微生物檢驗技能-細菌的形態(tài)學檢查

顯微鏡的使用光學部分：接目鏡、接物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。機械部分：鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、載物臺轉移器、粗調節(jié)器、細調節(jié)器等部件。它起著支持、調節(jié)、固定等作用。顯微鏡的構造顯微鏡的使用用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔調節(jié)光亮度低倍鏡觀察：粗調、細調高倍鏡觀察油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細調至看清物象為止顯微鏡的使用換片：另換新片，必須從第三條開始操作。用后復原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復原。

不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。觀察標本時，必須依次用低、高倍鏡，最后用油鏡。當目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。顯微鏡的使用注意事項觀察時，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時，右眼注視繪圖。拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。顯微鏡應存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。顯微鏡的使用注意事項細菌形態(tài)結構觀察利用油鏡，結合細菌三型等染色片觀察細菌的基本形態(tài)（球狀、桿狀和螺旋狀），邊觀察邊繪圖。觀察細菌的特殊構造：變形桿菌、綠膿桿菌----示鞭毛破傷風梭菌、枯草桿菌----示芽胞肺炎鏈球菌---示莢膜基本形態(tài)的觀察金黃色葡萄球菌鏈球菌基本形態(tài)的觀察霍亂弧菌大腸桿菌特殊構造的觀察變形桿菌的鞭毛特殊構造的觀察細菌莢膜特殊構造的觀察細菌芽胞敘述細菌的基本形態(tài)和大小。敘述使用油鏡的注意事項。細菌有哪些基本結構和特殊結構？細菌特殊結構有什么臨床意義？細菌形態(tài)結構辨認細菌形態(tài)學檢查知道細菌的基本形態(tài)明確細菌大小和測量單位知道細菌特殊結構及臨床意義學會使用光學顯微鏡油鏡觀察細菌學會顯微鏡下辨認各種細菌形態(tài)和結構概念bacterium—是一類單細胞的原核生物。廣義：各類原核細胞型微生物（細菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體）狹義：細菌細菌的大小測量細菌大小的單位是微米（μm）多數(shù)球菌直徑為1μm

中等大小桿菌長約為２～３μm

同一種細菌可因菌齡不同和環(huán)境等因素而有差異RBC直徑：7.5μm

細菌的形態(tài)細菌的基本形態(tài)有三種：球菌(coccus)；桿菌(bacillus)螺形菌(spirillarbacterium)球菌外觀呈球形或近似球形，直徑在1μm左右，由于繁殖時細菌分裂平面不同和分裂后菌體之間相互粘附程度不一，可有幾種排列方式。雙球菌鏈球菌葡萄球菌桿菌形態(tài)多呈直桿狀，也有的菌體稍彎；多數(shù)呈分散存在，亦有排列規(guī)則者。不同桿菌的大小、長短、粗細很不一致，均具桿菌的形態(tài)，但排列特點不同。桿菌桿菌棒狀桿菌鏈桿菌螺形菌菌體彎曲，長度不等，有以下幾種形態(tài)分類：弧菌，如：霍亂弧菌螺菌，如：鼠咬熱螺菌螺桿菌，如：幽門螺桿菌霍亂弧菌螺形菌細菌的結構細菌的結構莢膜鞭毛菌毛芽胞細胞壁細胞膜細胞質核質細菌的基本結構細菌的特殊結構莢膜細菌代謝過程中分泌在細胞壁外的一層粘液性物質，能牢固地與細胞壁結合，厚度≥0.2μm，邊緣明顯莢膜鞭毛某些細菌表面附著的細長呈波狀彎曲的絲狀物。根據(jù)鞭毛的數(shù)量、位置可將鞭毛菌分成四類：單毛菌；雙毛菌；從毛菌；周毛菌。有鑒別意義檢查細菌鞭毛的方法電鏡觀察特殊染色后用普通光學顯微鏡觀察壓滴法或懸滴法觀察細菌動力接種于半固體培養(yǎng)基觀察其擴散生長現(xiàn)象電鏡觀察鞭毛電鏡觀察鞭毛鞭毛染色光鏡觀察半固體培養(yǎng)基觀察動力許多G-菌和個別G+菌體的周圍具有一些比鞭毛更纖細、短直且堅硬的絲狀物，稱為菌毛，與細菌的運動無關。光學顯微鏡下看不到，須用電鏡觀察。菌毛菌毛芽胞某些細菌在一定環(huán)境條件下，能在菌體內部形成一個圓形或卵圓形小體，是細菌的休眠形式。產生芽胞的細菌都是G+菌。不同細菌的芽胞形態(tài)、大小、位置有所差異，是鑒別細菌的指標之一。芽胞芽胞革蘭染色技術基本技能單項訓練患者王某，男，63歲，入院后經氣管插管手術48h后出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咯痰，X線檢查顯示有較新炎癥病灶，初步判斷為肺部感染。取病人痰液標本送檢驗科微生物室檢驗。病人痰液呈磚紅色似果醬樣，粘稠。請問該病人可能是何種病原菌感染？將如何鑒定？可將細菌分為兩大類，是對細菌進行鑒定的最基本的檢驗技術，可將細菌分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。兩類細菌致病性不同。對藥物的敏感性均不相同。革蘭染色的臨床意義能力目標掌握細菌革蘭染色的操作方法掌握細菌革蘭染色的臨床意義掌握細菌革蘭染色的注意事項了解細菌革蘭染色的原理鞏固顯微鏡操作技術和無菌技術素質目標注意生物安全注意操作規(guī)范細菌菌體微小、而且折光率低，在顯微鏡下特別是在油鏡下幾乎與背景無反差，很難看清楚，如將其染色，使折光率增大，便容易觀察。由于菌體的性質及各部分對某些染料的著色性不同，因此可以利用不同的染色方法來區(qū)別不同的細菌及其結構。細菌染色法分單染法和復染法應用最廣泛的是革蘭染色法。革蘭染色法能將細菌分為G+菌(紫色）和G-菌（紅色）。涂片→干燥→固定→染色革蘭染色法

革蘭染色法是微生物學中常用的一種染色方法，該染色法由丹麥醫(yī)生Gram于1884年首創(chuàng)，故名。

細菌革蘭染色原理通透性機制：

G+菌細胞壁結構致密，脂類含量少，乙醇不易透入，反而可使細胞壁脫水形成一道屏障，阻止染料從細胞內滲出；G-菌細胞壁較疏松，含脂類物質多，易被乙醇溶解，使其通透性增大，細胞內的結晶紫―碘復合物易被溶解滲出易脫色。細菌革蘭染色原理化學機制：

G+菌細胞內含大量核糖核酸鎂鹽，與結晶紫―碘復合物結合牢固，另外，其等電點較低，結合的堿性染料多而牢固，因而染成紫色。結晶紫初染全部紫色碘液媒染全部紫色乙醇脫色G-菌無色G+菌紫色

復紅復染G-菌紅色

G+菌紫色革蘭染色各步驟時細菌的顏色革蘭染色操作步驟涂片制備涂片：干燥：固定：通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。涂片干燥固定染色水洗、吸干鏡檢制備涂片標本→染色革蘭染色操作步驟

鏡檢涂片滴水取菌固定結晶紫（1min）水洗水洗碘液（1min）

乙醇脫色干燥水洗復紅0.5min水洗革蘭染色操作步驟革蘭染色操作步驟革蘭染色結果革蘭陰性桿菌革蘭陽性鏈球菌革蘭染色結果革蘭染色結果（一）玻片要盡量潔凈。（二）菌齡要適當，一般在對數(shù)生長期取材，菌齡過長染色性容易改變。（三）菌量要適當，菌膜不宜涂得太厚。（四）涂菌動作要輕，防止菌液崩濺。（五）行火焰固定時，既要殺死細菌，又不能破壞細菌原有形態(tài)。（六）粘有細菌的接種環(huán)要及時火焰滅菌。（七）注意檢查染液質量，染液中不應有沉淀物。另外，在染色中染液不能干涸。（八）掌握好脫色時間，脫色時間過長或過短均會造成染色性改變。影響革蘭染色結果的因素歸納細菌形態(tài)學檢查常用的方法和用途。敘述細菌革蘭染色的步驟、結果及臨床意義。影響革蘭染色結果的因素有哪些？抗酸染色技術基本技能單項訓練診斷活動性肺結核的金標準

患者王某，男，50歲，出現(xiàn)低熱、咳嗽、咯痰二十余天，X線檢查顯示肺部有炎癥病灶，初步判斷為肺部感染。取病人痰液標本送檢驗科微生物室檢驗。病人痰液帶血絲。請問該病人可能是何種病原菌感染？將如何鑒定？能力目標會操作細菌抗酸染色能正確觀察細菌抗酸染色結果知道細菌抗酸染色的臨床意義知道細菌抗酸染色的原理、影響因素學習目標素質目標

進一步強化生物安全的意識樹立嚴肅認真、實事求是、高度負責的科學態(tài)度，具有良好的職業(yè)素質和崇高的職業(yè)道德?？顾崛旧ǚ种U菌屬的細菌（包括結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌等）為抗酸性細菌，一般染色法不易著色，須用抗酸染色法。分枝桿菌呈紅色(+)其他細菌和背景為藍色(-)。實驗原理分枝桿菌的細胞壁內含有大量的脂質，主要是分枝菌酸，它包圍在外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色(齊-尼氏抗酸染色法)。實驗材料細菌：卡介苗染液：石炭酸復紅液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭溶液其它：接種環(huán)、酒精燈、載玻片等

染色步驟1、細菌涂片標本的制備涂片干燥固定2、染色染色步驟1）初染：用玻片夾夾持涂片標本，滴加石炭酸復紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，若染液蒸發(fā)減少，應再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標本冷卻后用水沖洗。2）脫色：

3%鹽酸酒精脫色30秒至1分鐘，用水沖洗。3）復染：用堿性美蘭溶液復染1分鐘，用水沖洗后用吸水紙吸干。3、油鏡觀察實驗結果結核桿菌呈紅色，常堆積成團，排列無序，偶呈分枝狀生長。偶爾有桿菌著色不均，呈顆粒狀者。背景及非抗酸性細菌呈蘭色?？顾崛旧Y果抗酸染色結果抗酸