微生物檢驗(yàn)技術(shù)-病毒檢驗(yàn)技術(shù)

1病毒分離與鑒定2病毒分離和鑒定的一般程序

臨床標(biāo)本的收集標(biāo)本處理后接種新生小鼠組織雞胚收獲尿囊液、羊膜腔液紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)CPE紅細(xì)胞吸附空斑試驗(yàn)包涵體EM觀察發(fā)病3

組織細(xì)胞培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)動(dòng)物接種一、病毒的分離方法4

1.組織細(xì)胞培養(yǎng)

根據(jù)細(xì)胞的來源、特性和傳代次數(shù)分為：(1)原代細(xì)胞培養(yǎng)：將離體的新鮮組織器官經(jīng)機(jī)械或胰蛋白酶處理，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，加營(yíng)養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。原代細(xì)胞再用胰蛋白酶或EDTA等消化后加營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，稱次代細(xì)胞。

5(2)二倍體細(xì)胞株：原代細(xì)胞體外分裂50代仍保持二倍體特性，如人胚肺細(xì)胞。廣泛用于病毒分離和疫苗制備。(3)傳代細(xì)胞株：來于腫瘤細(xì)胞，染色體特征類似腫瘤細(xì)胞。常用的有人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人喉上皮癌細(xì)胞(Hep-2)。繁殖快，易于傳代保存。只能用于病毒分離，不能用于疫苗制備。6常用于病毒分離的細(xì)胞

細(xì)胞種類可分離的病毒

原代細(xì)胞非洲綠猴腎細(xì)胞人單核細(xì)胞人胚腎、肺細(xì)胞恒河猴獼猴腎細(xì)胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒

HIV、HTLV、HHV-6腮腺炎病毒、腺病毒ECHO、脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A、B組、RSV二倍體細(xì)胞株人胚肺成纖維細(xì)胞株

WI-38、MRC—5CMV、VZV、鼻病毒腮腺炎病毒、腺病毒傳代細(xì)胞系

HelaHep-2Vero

柯薩奇A、B組、RSV腺病毒、RSVHSV、RSV、風(fēng)疹病毒、輪狀病毒、麻疹病毒7正常細(xì)胞細(xì)胞病變效應(yīng)CPE8

雞胚是用于分離粘病毒科、皰疹病毒、痘類病毒的較為理想的材料。

優(yōu)點(diǎn):有不同部位可以接種，易于病毒繁殖；來源充足，操作簡(jiǎn)便；通常是無菌的；對(duì)接種病毒不產(chǎn)生抗體。

缺點(diǎn):卵黃中含有抗家禽病原的抗體；可帶有某些病毒如雞白血病病毒；飼料中的抗生素也能傳遞給雞胚。2．雞胚接種9

雞胚的接種方法

卵黃囊接種羊膜腔接種尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種腦內(nèi)接種胚體接種1011常用動(dòng)物:動(dòng)物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分離病毒。接種部位:靜脈、鼻咽腔、腹腔、腦內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等。發(fā)病情況觀察:食欲、活動(dòng)及糞便情況；局部和全身變化;神經(jīng)系統(tǒng)感染可出現(xiàn)震顫、松毛，軟弱、不安、弓背、抽死亡；呼吸系統(tǒng)病毒可出現(xiàn)咳嗽、呼吸加快、少食等。不死，解剖后查病毒抗原，死亡，取病變組織傳代和鑒定。3．動(dòng)物接種12

病毒鑒定的方法

1、病毒增殖后導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化:①細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)：細(xì)胞腫大，變圓堆積成葡萄狀，細(xì)胞溶解出現(xiàn)空斑。13②多核巨細(xì)胞和包涵體。細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞，胞漿內(nèi)或核出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性包涵體等；

2.紅細(xì)胞吸附：血凝現(xiàn)象。

3.細(xì)胞培養(yǎng)液pH的變化。144.病毒的數(shù)量與感染性測(cè)定(1)空斑或蝕斑形成試驗(yàn)

空斑是指在單層細(xì)胞中被病毒感染引起死亡的細(xì)胞區(qū)域，周圍被活細(xì)胞包圍。一般而言，一個(gè)空斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒感染所引起的。15蝕斑（plaque）測(cè)定蝕斑形成單位（plaqueformingunit,PFU）病毒的數(shù)量與病毒毒力測(cè)定。(2)50%感染量或50%組織感染量（ID50或TCID50）測(cè)定

：用來估計(jì)病毒感染的強(qiáng)弱程度。164.其他實(shí)驗(yàn)

(1)干擾現(xiàn)象:

某些病毒間存在著干擾現(xiàn)象，如某些型別的鼻病毒能干擾以后進(jìn)入的副流感病毒的增殖，從而阻抑后者的紅細(xì)胞吸附作用。17(2)耐酸試驗(yàn)

腸道病毒對(duì)酸有耐受力，而鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。(3)乙醚敏感試驗(yàn)病毒外圍如有類脂包膜，則易被乙醚破壞，而失去感染性，不能感染細(xì)胞。可作為病毒是否具有類脂包膜的依據(jù)，也可用氯仿或去膽酸鈉代替乙醚進(jìn)行試驗(yàn)。18

一、血清學(xué)診斷方法

（一）抗原的檢測(cè)：

病毒抗原是病毒特異性的標(biāo)志，通過免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中特異性抗原存在，可以早期診斷病毒感染。病毒血清學(xué)診斷及其他快速診斷方法191．免疫熒光技術(shù)適合于型別少，細(xì)胞培養(yǎng)難以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒等。肝活檢組織中的肝炎病毒、神經(jīng)組織中的單純皰疹病毒、腦組織中的狂犬病毒或其他脫落細(xì)胞和活檢組織中的病毒抗原檢測(cè)。202．酶免疫技術(shù)

有酶免疫組化和酶免疫吸附(ELlSA)試驗(yàn)法。測(cè)定標(biāo)本中游離的抗原或抗體。如檢測(cè)乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人的P24抗體等。213.其他技術(shù)

如固相放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)等。22●標(biāo)本采集時(shí)間、急性期單份血清IgM、雙份血清IgG●常用血清試驗(yàn)原理和用途

1、中和試驗(yàn)

（二）抗體檢測(cè)

2、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)3、血凝及血凝抑制試驗(yàn)4、免疫熒光試驗(yàn)5、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)6、免疫印跡實(shí)驗(yàn)7、固相免疫放射測(cè)定23早期抗體檢測(cè)

檢測(cè)病毒感染機(jī)體后產(chǎn)生的早期特異性抗體，如測(cè)定特異性IgM可以快速明確診斷各種病毒引起的新生兒先天性感染，測(cè)定HAV感染后抗HAV的IgM抗體可以明確診斷HAV等。24

二、病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)方法

只要有完整的特異基因片段存在，就可進(jìn)行診斷。25（一）核酸分子雜交技術(shù)：1．斑點(diǎn)雜交法

將待測(cè)的DNA或RNA直接點(diǎn)在雜交濾膜上，變性后，用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。用32p或131I同位素標(biāo)記的探針通過放射自顯影，可直接觀察?，F(xiàn)用地高辛、生物素等非同位素物質(zhì)標(biāo)記，然后采用酶反應(yīng)或酶免疫技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，已被越來越多的實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。262.原位分子雜交技術(shù)

在細(xì)胞原位暴露DNA或RNA，加入標(biāo)記特異核酸探針進(jìn)行雜交。通過顯色技術(shù)可顯示特定雜交探針在細(xì)胞內(nèi)的位置和核酸的數(shù)量。27

3.Southern印跡和Northern印跡法

Southern印跡法用于DNA的雜交。提取DNA,用內(nèi)切酶切割后，進(jìn)行瓊脂糖電泳按分子量使DNA分開，將DNA移至硝酸纖維膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。可以檢測(cè)病毒DNA特異序列。

Northern印跡法用于RNA雜交分析。將瓊脂糖電泳后的RNA移至DBM膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。用于檢測(cè)RNA或mRNA。28

（二）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

選擇病毒的特異保守片段作為靶基因，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增可診斷病毒性感染。(1)DNA病毒：可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增其特異片段。(2)RNA病毒：可通過RT-PCR技術(shù)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。29(3)定量PCR技術(shù)：對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行原始標(biāo)本定量，對(duì)病毒感染的診斷起到了量化的作用。同時(shí)，對(duì)研究病毒和機(jī)體之間的關(guān)系提供了參考。30（三）基因芯片技術(shù)將數(shù)以萬計(jì)、乃至百萬計(jì)的特定序列的DNA片段（基因探針），有規(guī)律地排列固定于2平方厘米的硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個(gè)二維DNA探針陣列，與計(jì)算機(jī)的電子芯片十分相似，所以被稱為基因芯片。基因芯片主要用于基因檢測(cè)工作。31

病毒形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

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通過測(cè)定病毒的特異標(biāo)志成分，如特殊形態(tài)、特異的抗原成分及病毒的核酸，早期確認(rèn)病毒的感染，是病毒學(xué)診斷的重大發(fā)展。

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一、形態(tài)學(xué)檢查

1．光學(xué)顯微鏡：查包涵體。

狂犬病病毒在腦細(xì)胞出現(xiàn)嗜酸性的圓形或橢圓形包涵體，稱為內(nèi)基小體。

巨細(xì)胞病毒在上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)周圍繞有一輪暈似“貓頭鷹眼”樣大型嗜酸性包涵體。34Negribodyinaneuron352