DB12T 653-2016 鮮凍畜、禽肉中動物源性成分的定量檢測 實時熒光PCR法　　

B45DB12QuantitativePCRmethod天津市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙新、易萌、劉娜、蘭青闊、劉雪巖、陳銳、朱珠、王成、徐石鮮凍畜、禽肉中動物源性成分的定量檢測實時熒光PCR法下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實時熒光PCRrealtimePCR雞源性成分chicken-deriv算試樣中種屬特異性基因和內(nèi)參基因的比值，從而對鮮凍畜、禽肉中動物源性成分進(jìn)行定量檢測。Rd1Rd1-P：5′-FAM-CGGCACSus-ACTBSus-P：5′-FAM-TCTGDucg作為試樣，裝入清潔容器中，加封后，標(biāo)明標(biāo)記。將試樣于-20℃冷凍保存。SDS裂解液和20μL蛋白酶K（20mg/m緩慢顛倒混勻，12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至一5.3.4.1標(biāo)準(zhǔn)樣品和試樣實時熒光P進(jìn)行45次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（95℃變性15s，60℃退火延伸1min在第二階段的退火延伸（60℃)時段收集熒光信號。4—2.0μL2.0μL—25.0μL—1.0μL1.0μL0.5μL1.0μL—25.0μL情況進(jìn)行調(diào)整。設(shè)定閾值處，要求不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線平行，而且同一樣品的不同平根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的擴(kuò)增Ct值和初始模板含量的對數(shù)間的線性關(guān)系，分別繪制動物源性y=x+b(1yb—標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。n—模板靶標(biāo)濃度a—標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。5.3.5.5.2計算試樣中動物源性成分種屬特出試樣中動物源性成分種屬特異性基因百分含量。c—試樣中動物源性成分種屬特異性基因的百n16SrDNA—內(nèi)參基因16SrDNA濃度。依照6.1-6.2進(jìn)行判斷；如重復(fù)實驗動物源性種屬特異性基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，但Ct值仍在36～38內(nèi)參基因和動物源性種屬特異性基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，但Ct1GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAGCTACTTCTGTGAGGCAGA61GCTGTGTTCCTTGCCGTCATGTGCCCAGGAGACTGGCGGGGAAGGAAGAGACTGGCGGGGAAGGAA61ACAGAGCGAGTCAGAAGGCT注：劃線部分為OA-F和OA-R引物序列，方61AGCACACTTAGCCGTGTTCCTTGCACTCTCTGCATATATCCACGGTTCCGCTATG注：劃線部分為Chk-F和Chk-R引AAAACTAAAGAATCCCACTAATTAAAA