流感病毒的核酸檢測技術(shù)操作規(guī)范

流感病毒的核酸檢測技術(shù)操作規(guī)范（一）流感病毒ConventionalonestepRT-PCR檢測應(yīng)用核酸檢測技術(shù)為疑似流感病毒感染病例診斷提供依據(jù)，為流感病毒的型別和亞型的鑒定提供技術(shù)方法。按照規(guī)定方法對標本和病毒進行處理和檢測，保證檢測結(jié)果的快速性和可靠性，同時確保樣本不被污染和污染環(huán)境。1.生物安全要求實驗室操作應(yīng)當遵守生物安全實驗室的有關(guān)生物安全的規(guī)定。季節(jié)性流感病毒生物安全二級，疑似高致病禽流感病例標本需在BSL-2級實驗室操作，采取BSL-3級防護；核酸提取及加RNA模板可在BSL-2級實驗室生物安全柜內(nèi)操作；PCR反應(yīng)體系配制在體系配制區(qū)；PCR產(chǎn)物檢測在電泳區(qū)操作。2.主要試劑（所列廠家僅用作舉例，實驗室可自行選擇）序號試劑名稱貨號規(guī)格生產(chǎn)商1One-stepRTPCRkit210212Qiagen2引物*（20μM)2ODTAKARA3RNaseinhibitorN2111Promega注：*引物序列詳見表1。3.設(shè)備BSL-2生物安全柜；可調(diào)轉(zhuǎn)速最大至14000rmp的離心機；渦旋混合器；10μL，100μL，200μL，1000μL量程移液器；PCR儀；電泳槽和電泳儀；凝膠成像系統(tǒng)。4.質(zhì)量控制實驗檢測所需核酸提取試劑和一步法RT-PCR檢測試劑不同批號之間需進行靈敏度的檢測。同一試劑不同批次的靈敏度的檢測至少半年一次。實驗檢測除待檢標本外還需設(shè)置陽性對照及陰性對照，陽性對照核酸事先應(yīng)稀釋分裝，經(jīng)Real-timePCR檢測Ct值在30以內(nèi)；陰性對照為DEPC處理水Real-timePCR檢測Ct值為0。5.實驗步驟實驗注意事項由于PCR檢測靈敏度高，因此必須采取一些預(yù)防污染的措施，以避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，建議采取如下方法：核酸提取、反應(yīng)液配制及檢測反應(yīng)進行應(yīng)在獨立的房間中進行。不同的房間配制相應(yīng)的專用耗材和設(shè)備，不可交叉使用。配制反應(yīng)液時，應(yīng)穿著干凈的實驗服，帶無粉手套進行操作。實驗操作期間，如懷疑有污染，請更換手套。試劑及反應(yīng)管的蓋子應(yīng)盡可能蓋上。設(shè)備準備操作臺的表面、槍頭和離心機應(yīng)保持潔凈，可用5%漂白劑或其它清潔劑，如可以去除DNA酶的試劑擦拭臺面，以減少核酸污染的風險。試劑準備注意：配制反應(yīng)液期間，盡量保持所有試劑放置在低溫裝置中，如預(yù)冷的冰盒。引物配制將新合成的引物在開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。用RNaseFreeWater溶解，加水量為10×總摩爾數(shù)，充分混勻，此時引物濃度為100pmol/μL，即100μM。（例如：合成引物2OD，9.5nmol，則加水量為10×9.5＝95μL），可作為儲存液。將100μM的引物濃度再10倍稀釋，配成濃度為10μM，即可直接用于PCR反應(yīng)。引物準備融化引物，振蕩所有引物，短暫離心引物，然后放置在低溫裝置上。ConventionalRT-PCR試劑將RT-PCREnzymeMix放置在低溫裝置上，融化5×RT-PCRBuffer，顛倒混勻。短暫離心5×RT-PCRBuffer后放置在低溫裝置上。反應(yīng)體系配制按照如下組分配制反應(yīng)體系：組分體積（μL）5×RT-PCRBuffer5×n10mMdNTPMixture1×nRT-PCREnzymeMix1×nRNaseInhibitor0.1×n上游引物0.5×n下游引物0.5×nRNaseFreeWater11.9×nTotal20×n將上述反應(yīng)液混勻，分裝到0.2mLPCR小管中，每管20μL，分別做好標記。加RNA模板（在核酸提取區(qū)）將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然后分別加標本RNA（每管5μL），最后加入陽性對照RNA（每管5μL）。一步法ConventionalRT-PCR反應(yīng)將上述加好模板的反應(yīng)管混勻，短暫離心后放入PCR儀進行RT-PCR擴增，反應(yīng)程序如下：溫度時間（分鐘：秒）循環(huán)數(shù)60°10：00142°10：00150°30：00195°15：00194°00：304050°00：3072°01：0072°10：0014°RT-PCR產(chǎn)物檢測1.5％瓊脂糖凝膠制備：稱取1.5gAgarose，倒入耐熱玻璃瓶內(nèi)，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻后加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料（GoldView）5μL，輕輕混勻（不要產(chǎn)生氣泡）。待膠的溫度降至50℃左右時，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之后，將梳子拔出。將制備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。PCR產(chǎn)物各取10μL，加入2μL上樣緩沖液（6×LoadingBuffer），混勻后加入電泳膠孔內(nèi)（先加Marker（DL-2000）5μL，然后依次加標本PCR產(chǎn)物，再加陰性對照，最后加陽性對照產(chǎn)物）。電泳電壓100V，約30～40min后看結(jié)果。將電泳膠放入凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。結(jié)果說明判讀前提：陰性對照未擴增得到條帶，陽性對照僅擴增得到特異性條帶。陽性結(jié)果：根據(jù)各檢測引物電泳時出現(xiàn)相應(yīng)大小特異性條帶，進行結(jié)果判斷。陰性結(jié)果：未出現(xiàn)條帶，或不在相應(yīng)位置出現(xiàn)非特異性條帶，均判為陰性結(jié)果。

表1.流感病毒One-StepPCR檢測引物引物名稱堿基組成說明FluA-M-F305’-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’用于檢測A型流感病毒M基因FluA-M-R2645’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’FluB-NS-F485

5’-GGGACATGAACAACAAAGATGC-3’用于檢測B型流感病毒Ns基因FluB-NS-R9885’-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3’H1HA-F768

5’-ACTACTGGACTCTGCTGGAAC-3’主要用于檢測季節(jié)性H1N1亞型流感病毒HA基因，也可檢出部分甲型H1N1流感病毒HA基因。對疑似標本進行季節(jié)性H1N1亞型鑒定時，最好使用Real-timePCR方法進行檢測，以免造成結(jié)果的誤判。H1HA-R10945’-CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3’N1-F10595’-AAGGGGTTTTCATACAGGTATGGT-3’主要用于檢測季節(jié)性H1N1亞型流感病毒NA基因，也可檢出禽流感H5N1亞型病毒NA基因及甲型H1N1亞型流感病毒NA基因。N1-R11655’-TCTGTCCATCCATTAGGATCC-3’H3HA-F6715’-ATCAGGGAGAGTCACAGTCTC-3’主要用于檢測季節(jié)性H3N2亞型流感病毒HA基因H3HA-R9405’-ATGCTTCCATTTGGAGTGATGC-3N2-F779

5’-GGAAATCGTTCATATTAGCCCATTG-3’主要用于檢測季節(jié)性H3N2亞型流感病毒NA基因，也可檢測出部分禽流感H9N2亞型病毒NA基因N2-R9555’-AGCACACATAACTGGAAACAATGC-3’H5HA-F2485’-GTGACGAATTCATCAATGTRCCG-3’主要用于檢測禽流感H5N1亞型流感病毒HA基因H5HA-R6475’-CTCTGGTTTAGTGTTGATGTYCCAA-3’AN1-F5805'-TGAAGTACAATGGCATAATAACWGACAC-3’主要用于檢測禽流感H5N1亞型流感病毒NA基因，也可檢測出部分甲型H1N1亞型流感病毒NA基因AN1-R9185'-CCACTGCATATATATCCTATTTGATACTCC-3’H9HA-F4265’-GAATCCAGATCTTTCCAGAC-3’主要用于檢測禽流感H9N2亞型流感病毒HA基因，H9HA-R8085’-CCATACCATGGGGCAATTAG-3’AN2-F11215’-CGCTACGGTTATGAGACTTTCAG-3’主要用于檢測禽流感H9N2亞型流感病毒NA基因AN2-R14015’-ATATTCGCCCCATCAGGCCATGAG-3’H7-F2455’-CCCAATGTGAYCAATTCCT-3’主要用于檢測禽流感H7N7或H7N3亞型流感病毒HA基因H7-R4285’-GCTCCATTRGTTCTGATTCC-3’注：所列引物將根據(jù)流感流行情況不斷進行更新。（二）流感病毒Real-timeonestepRT-PCR檢測應(yīng)用Real-timeonestepRT-PCR核酸檢測技術(shù)為疑似流感病毒感染病例診斷提供依據(jù)，為流感病毒的型別和亞型的鑒定提供技術(shù)方法。按照規(guī)定方法對標本和病毒進行處理和檢測，保證檢測結(jié)果的快速性和可靠性，同時確保樣本不被污染和污染環(huán)境。1.生物安全要求實驗室操作應(yīng)當遵守生物安全實驗室的有關(guān)生物安全的規(guī)定。季節(jié)性流感病毒生物安全二級，疑似高致病禽流感病例標本需在BSL-2級實驗室操作，采取BSL-3級防護；核酸提取及加RNA模板可在BSL-2級實驗室生物安全柜內(nèi)操作；PCR反應(yīng)體系配制在體系配制區(qū)；PCR產(chǎn)物檢測在電泳區(qū)操作。2.試劑及耗材（所列廠家僅用作舉例，實驗室可自行選擇）序號試劑名稱貨號規(guī)格生產(chǎn)商1AgPath-IDTMOne-stepRT-PCRkit4387424500次AB2引物*（40μM）2ODTAKARA3探針*（10μM）2ODTAKARA*引物和探針序列見表23.設(shè)備BSL-2生物安全柜；渦旋混合器；10μL，100μL，200μL，1000μL量程移液器；Real-timePCR儀；4.質(zhì)量控制本實驗檢測所需AgPath-IDTMOne-stepRT-PCR試劑不同批號之間需進行靈敏度的檢測。同一試劑不同批次的靈敏度的檢測至少半年一次。實驗檢測除待檢標本外還需設(shè)置陽性對照及陰性對照，陽性對照核酸事先應(yīng)稀釋分裝，經(jīng)Real-timePCR檢測Ct值在30以內(nèi)，陰對照為DEPC處理水，Real-timePCR檢測Ct值為0。5.實驗步驟實驗注意事項由于Real-timePCR檢測靈敏度高，因此必須采取一些預(yù)防污染的措施，以避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，建議采取如下方法：核酸提取、反應(yīng)液配制及檢測反應(yīng)進行應(yīng)在獨立的房間中進行。不同的房間配制相應(yīng)的專用耗材和設(shè)備，不可交叉使用。配制反應(yīng)液時，應(yīng)穿著干凈的實驗服，帶無粉手套進行操作。實驗操作期間，如懷疑有污染，請更換手套。試劑及反應(yīng)管的蓋子應(yīng)盡可能蓋上。設(shè)備準備操作臺的表面、槍頭和離心機應(yīng)保持潔凈，可用5%漂白劑或其它清潔劑，如可以去除DNA酶的試劑擦拭臺面，以減少核酸污染的風險。試劑準備注意：配制反應(yīng)液期間，盡量保持所有試劑放置在低溫裝置中，如預(yù)冷的冰盒。引物和探針配制引物配制：將新合成的引物開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。用RNaseFreeWater溶解，加水量為10×總摩爾數(shù)，充分混勻，此時引物濃度為100μM，可作為儲存液。將100μM的引物2.5倍稀釋，此時濃度為40μM，可作為工作濃度。探針配制：將新合成的探針管開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。用RNaseFreeWater溶解，加水量為10×總摩爾數(shù)，充分混勻，此時引物濃度為100μM，可作為儲存液。將100μM的探針10倍稀釋，此時濃度為10μM，可作為工作濃度。引物和探針準備融化引物和探針（融化后的引物和探針在避光條件下，可在2℃-8℃下保存3個月,振蕩所有引物和探針,短暫離心引物和探針，然后放置在低溫裝置上。Real-timeRT-PCR試劑將25×RT-PCREnzymeMix放置在低溫裝置上。融化2×RT-PCRBuffer，顛倒混勻。短暫離心2×RT-PCRBuffer后放置在低溫裝置上。反應(yīng)體系配制按照如下組分配制反應(yīng)體系，引物序列詳見附錄附表2,配制方法詳見Real-timePCR引物制備SOP。組分體積（μL）2×RT-PCRBuffer12.5×n25×RT-PCREnzymeMix1×n上游引物0.5×n下游引物0.5×n探針0.5×nRNaseFreeWater5×nTotal20×n將上述反應(yīng)液混勻，分裝到0.2mLPCR小管中，每管20μL，分別做好標記。加RNA模板（在核酸提取區(qū)）將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然后分別加標本RNA（每管5μL），最后加入陽性對照RNA（每管5μL）。一步法Real-timeRT-PCR反應(yīng)將上述加好模板的反應(yīng)管混勻，短暫離心后放入PCR儀進行RT-PCR擴增，反應(yīng)程序如下：96孔儀器SmartCyclerII循環(huán)數(shù)溫度時間（分鐘：秒）溫度時間（分鐘：秒）45℃10:0045℃10：00195℃10:0095℃15：00195℃00:1595°00：154060℃00:4560°00：60注：SmartCyclerII儀器升降溫度設(shè)為1.6℃/秒；適用此反應(yīng)條件的96孔儀器有AB7500，7900HT和Stratagene3500P.結(jié)果說明陰性對照反應(yīng)得到的熒光曲線不應(yīng)超過閾值線，應(yīng)無Ct值或為Ct值為零。如果陰性對照產(chǎn)生假陽性則是說明有污染產(chǎn)生，此次檢測結(jié)果無效，然后嚴格按照操作程序重復(fù)實驗。陽性對照的檢測結(jié)果應(yīng)為陽性，且Ct值在20～30之間。如果陽性對照檢測結(jié)果未達到要求，則需嚴格按照操作程序重復(fù)試驗。當所有對照成立，檢測標本在35個循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)熒光信號，則相應(yīng)引物和探針陽性；若Ct值在35～40間，應(yīng)重復(fù)確認，如Ct值還在40內(nèi)可判斷為陽性；Ct值超過40，視該樣本為陰性。所有的臨床標本RNP檢測都必須為陽性，且Ct值在35.0以內(nèi)才足可以證明樣品的質(zhì)量是可接受的。如果臨床標本RNP檢測為陰性，則可能是以下原因：臨床樣本核酸提取不正確導(dǎo)致RNA的丟失或臨床標本里存在大量的RT-PCR反應(yīng)抑制劑。樣品中人細胞成分太少，以至于不能檢測到。反應(yīng)液配制錯誤或程序設(shè)置錯誤。試劑或儀器失靈。

表2.流感病毒檢測引物和探針序列引物/探針名稱堿基組成FluA-Forward5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’FluA-Reverse5’-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3’FluA-probe5’-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3’H1-F2475’-AACATGTTACCCAGGGCATTTCGC-3’H1-R3615’-GTGGTTGGGCCATGAGCTTTCTTT-3’H1-P2785’-GAGGAACTGAGGGAGCAATTGAGTTCAG-3’H3-F2935’-ACCCTCAGTGTGATGGCTTCCAAA-3’H3-R4005’-TAAGGGAGGCATAATCCGGCACAT-3’H3-P3845’-ACGCAGCAAAGCCTACAGCAACTGT-3’FluBForward5’-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3’FluBReverse5’-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3’FluBprobe5’-CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-3’SWH1Fo