流感病毒的紅細胞凝集及紅細胞凝集抑制試驗技術(shù)操作規(guī)范

流感病毒的紅細胞凝集及紅細胞凝集抑制試驗技術(shù)操作規(guī)范流感病毒的血凝素（HA）能夠引起多種禽類和哺乳動物的紅細胞發(fā)生凝集，因此而得名。用于檢測流感病毒滴度的紅細胞凝集試驗也是根據(jù)病毒的這一特性而建立的。當血清中特異性抗體與病毒血凝素結(jié)合后，則可以抑制紅細胞凝集的出現(xiàn)，即為紅細胞凝集抑制試驗（HI）的理論根據(jù)。微量紅細胞凝集抑制試驗是目前最常用的一種鑒定流感病毒型/亞型的方法。該方法簡單、易行、結(jié)果可信。用于HI的標準參照血清必須及時更新，要包括當年的疫苗株和/或流行代表株的抗血清。HI中所用的血清必須經(jīng)特殊處理以去除非特異性抑制素及非特異性凝集素。（一）生物安全要求生物安全要求及個人防護要求與流感病毒的分離相同，并應遵守相應的生物安全規(guī)定。（二）實驗所用試劑1.抗原：季節(jié)性A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒液2.抗血清：經(jīng)RDE或者過碘酸鉀處理后的季節(jié)性A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒抗血清。（三）其他試劑/材料/儀器（試劑盒中不包含）紅細胞懸液 PBS緩沖液，PH7.4 水浴箱（37℃，56℃）臺式離心機 多道可調(diào)加樣器 離心管7.96孔微量血凝板（使用豚鼠和人紅細胞進行實驗須用“U”底板，使用雞/火雞紅細胞進行實驗最好用“V”底板，“U”底板也可使用）、可調(diào)多通道加樣器、單道加樣器等。8.200ul、1000ulTIP頭、水槽流感病毒紅細胞凝集試驗各項條件比較紅細胞雞火雞豚鼠人“O”型血終濃度0.50.50.750.75孔底部形狀V型V型U型U型孵育時間30min30min45min60min紅細胞沉積形狀細胞沉積成點狀，傾斜時細胞向下流成淚滴狀細胞沉積成點狀，傾斜時細胞向下流成淚滴狀細胞沉積成環(huán)狀細胞沉積成環(huán)狀（四）流感病毒鑒定步驟1.紅細胞配置如用火雞、雞的紅細胞，工作液濃度為1%，如用人“O”型、豚鼠紅細胞，工作濃度為1.5%。下面介紹WHO流感參比與合作中心提供的紅細胞標定的方法：S液中的紅細胞，1200r/min離心5min，棄上清。加入等量的PBS液體洗滌，充分混勻，1200r/min離心5min，棄上清。PBS液體洗滌三次。最后一次洗滌后，1200r/min離心10min。將紅細胞稀釋至合適的濃度。注：A.S液全稱為Alsever氏液。配制方法為葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g、去離子水加至100mL，微熱溶解，將pH值調(diào)到6.1，8磅20min高壓滅菌，4℃貯存?zhèn)溆谩?.流感毒株HA滴度的測定在微量血凝板的第2~12列加入50ulPBS（PH7.4）。在第一列（A1~G1）中加入100ul病毒懸液。H1加入100ulPBS，作為紅細胞陰性對照。從第一列各孔吸50ul病毒液，由第1列至第12列做2倍系列稀釋，最后一列每孔棄去50ul。在每孔中加入50ul紅細胞懸液，輕拍血凝板，充分混勻。室溫孵育，孵育時間見表：流感病毒紅細胞凝集試驗各項條件比較。3.HA試驗結(jié)果判斷引起全部紅細胞凝集為完全凝集，以“+”記錄；只有部分紅細胞凝集記錄為“+/-”；無凝集記錄“-”。血凝滴度的判定以出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的血凝滴度。HA滴度判定舉例病毒稀釋度HA滴度1:11:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048123456789101112A++----------2B++++--------8C+++++-------16D++++++------32E+++++++-----64F++++++++----128G++++++++++++≥2048H------------＜14.制備用于紅細胞凝集抑制試驗的4個血凝單位的抗原一個凝集單位指能引起等量的標準化的紅細胞凝集的病毒量。進行紅細胞凝集抑制試驗時一般用4個血凝單位的病毒量。制備4個單位血凝抗原時，首先計算出紅細胞凝集抑制試驗所需的病毒抗原的總量。如每種血清做8孔稀釋，每孔用抗原25ul，則測定一份血清需0.2mL抗原。根據(jù)標準血清的份數(shù)（本試劑盒包含5種標準血清）計算出實驗所需病毒抗原總量。其次，計算出病毒稀釋度。用病毒的HA滴度除以8，得到的商即為配置4個血凝單位所需的稀釋度。如，某病毒的HA滴度為64，除以8等于8，則1:8（1mL病毒液加7mLPBS）稀釋該病毒即可得到4個血凝單位的抗原。注：紅細胞凝集抑制試驗中所用的4個血凝單位是指每25ul病毒液中含有4個血凝單位（等于50ul病毒液中含有8個血凝單位）。所需抗原總量為1600ul時，4個血凝單位配置對照表HA滴度病毒液(ul)PBS(ul)168008003240012006420014001281001500256501550512251575102412.51587.520486.251593.755.4個血凝單位抗原的復核滴定為了保證紅細胞凝集抑制試驗中抗原用量一致并且準確無誤，新配置的4個血凝單位抗原需復核滴定。操作方法同HA實驗步驟。如果只有前4孔出現(xiàn)凝集，表明每50ul病毒含有8個血凝單位，該病毒稀釋準確，可以用于紅細胞凝集抑制試驗。如第5孔也出現(xiàn)凝集，說明每50ul病毒含有16個血凝單位，該抗原必須等量稀釋。如只有前3孔凝集，表明每50ul病毒僅含4個血凝單位，病毒量需加倍。此外，4個血凝單位抗原必須每次用前新配置。6.紅細胞凝集抑制試驗（HI）鑒定未知病毒在血凝板的每孔加入25ulPBS。然后在A1—A5、A7—A11各列分別加入：抗季節(jié)性A(H1N1)流感病毒標準參考血清、抗季節(jié)性A(H3N2)流感病毒標準參考血清、抗B-Yamagata系流感病毒標準參考血清、抗B-Victoria系流感病毒標準參考血清、抗新甲型H1N1流感病毒標準參考血清25ul，A6、A12加入25ulPBS，作為陰性對照。用多道移液器從A行每個孔分別取25ul，由A至H行做2倍稀釋血清，最后一行棄去25ul。A1至A5各列每孔加入25ul待檢抗原（4個血凝單位）陽性對照：A7至A11各列分別加入4個血凝單位的季節(jié)性A(H1N1)流感病毒標準參考抗原、季節(jié)性A(H3N2)流感病毒標準參考抗原、B-Yamagata系流感病毒標準參考抗原、B-Victoria系流感病毒標準參考抗原、新甲型H1N1流感病毒標準參考抗原各25ul/孔。對照孔A6、A12各列加入25ulPBS/孔。輕拍，混勻，室溫孵育30min。每孔加入50ul配置好的紅細胞懸液，輕拍混勻，室溫孵育30-60min，觀察血凝抑制實驗結(jié)果。（具體孵育時間根據(jù)使用的不同種血球來定，詳見表1。）血凝抑制效價是完全抑制血凝出現(xiàn)時血清的最高稀釋度的倒數(shù)。7.鑒定結(jié)果判定標準參照血清對待檢抗原的抑制效價≥20才可以算為陽性。一種待檢抗原不能同時被兩種或兩種以上的標準血清抑制。待檢抗原標準參照血清有交叉抑制，但與一種亞型（B型流感稱為系）的標準參照血清抑制效價大于其他亞型參照血清4倍以上時，便可以判定為此種亞型的流感病毒。（五）注意事項血紅細胞凝集抑制試驗必須用4個血凝單位/25ul的抗原，抗原必須新鮮配制。紅細胞懸液的配制必須標準化。正確存放試劑，避免反復凍融及污染。凍干的試劑應按照說明溶解，保存。5.任何待檢病毒與一種以上的推薦抗血清反應，滴度明顯大于20，可能的原因為：使用了不足4個血凝單位的抗原。細菌污染。非流感病毒來源的凝集素可以非特異的與所有的抗血清反應，也可以不發(fā)生反應。讀取結(jié)果的時間不正確，只有當病毒的血凝活性恰好被完全抑制時，血抑結(jié)果才最可信。未充分去除非特異性抑制素。人和動物來源的血清存在非特異抑制素，許多敏感病毒在滴定時很容易與血清中殘留的非特異性抑制素反應而引起曲解，為避免假陽性結(jié)果，要求在HI試驗前預先處理血清。非特異性抑制素實質(zhì)上是游離在血清中類似流感病毒受體的唾液酸殘基。這些類似受體的多糖類物質(zhì)能與病毒血凝素分子上的受體結(jié)合部位結(jié)合，因此用于血凝抑制或其它試驗的血清必須徹底清除其中所含的非特異性血凝抑制素。人和動物血清中的非特異性血凝抑制素分為α、β、γ三種，這三種