生物樣品的處理方法

第五章藥物定量分析與分析方法驗證第五章藥物定量分析與分析方法驗證第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法第二節(jié)定量分析方法的特點第三節(jié)藥品分析方法的驗證第四節(jié)生物樣品分析方法的基本要求第五章藥物定量分析與分析方法驗證

生物樣品分析的特點1．干擾物質多——生物樣品中含有大量的內(nèi)源性物，如質蛋白質、脂肪等，以及代謝物、結合物等干擾分析

——樣品一般均需經(jīng)過分離、凈化后才能進行分析2．樣品量少、不能重復取樣——生物樣品多數(shù)在特定條件下采集，無法再次取樣 3．被測成分濃度低——對分析方法的靈敏度及專屬性要求較高第五章藥物定量分析與分析方法驗證1.檢測方法的高靈敏度—最低檢測量10-9~10-7g或10-15~10-12g2.分離方法的高選擇性、高專屬性 為滿足各項要求，最常用的分析方法有

1）色譜法——GC、HPLC、HPCE（high-performancecapillaryelectrophoresis）

2）免疫分析法——RIA、EIA 3）聯(lián)用技術——GC-MS、LC-MS體內(nèi)分析方法要求（1）去除蛋白質(血樣)①加與水混溶的有機溶劑—蛋白質分子內(nèi)和分子間氫鍵發(fā)生改變.(乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃)②加中性鹽—蛋白質脫水.(飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等)③加強酸—與蛋白質陽離子形成不溶性鹽沉淀(

10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等)④加含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑—與蛋白質陰離子形成不溶性鹽沉淀.(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)⑤酶解法—枯草菌溶素.適用于酸不穩(wěn)定及蛋白結合牢固藥物.第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理生物樣品的處理方法（2）綴合物的水解(尿樣)含羥基、羧基、氨基和巰基藥物

+葡萄糖醛酸→葡萄糖醛酸苷綴合物含酚羥基、芳胺和醇類藥物

+硫酸→硫酸酯綴合物第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理生物樣品的處理方法常用方法:酸水解:鹽酸酶水解:葡萄糖醛酸苷酶硫酸酯酶葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶

第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理生物樣品的處理方法（3）分離純化與富集①液-液萃取法水相pH值是萃取成功的關鍵水相最佳pH值堿性藥物：高于pKa值1

2個pH單位 酸性藥物：低于pKa值1

2個pH單位第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理生物樣品的處理方法

但生物樣品宜在堿性或近中性提取——生物基質中內(nèi)源性物質多為酸性，在堿性下不易萃取

空白血清在pH2、pH7和pH13緩沖液中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)測定，堿性(pH13)下提取液的雜質峰最少第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理生物樣品的處理方法空白血清乙醚提取物的HPLC色譜圖第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理生物樣品的處理方法②液-固提取法（固相萃取法）

原理：將不同填料作為固定相裝入微型小柱，當含有藥物的生物樣品溶液通過時，由于受到吸附、分配、離子交換或其它親和力作用，藥物或雜質被保留在固定相上，用適當溶劑清洗雜質，再用適當溶劑洗脫藥物。第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理生物樣品的處理方法(4)化學衍生化

化學衍生化目的①使藥物變成具有能被分離的特性②提高對樣品的檢則靈敏度③增加藥物的穩(wěn)定性④提高對光學異構體的分離能力第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理生物樣品的處理方法

（5）有機破壞方法：濕法破壞干法破壞氧瓶燃燒法第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理生物樣品的處理方法

濕法破壞常用試劑：硝酸或硝酸-高氯酸.特點：破壞能力強、反應激烈，無機金屬離子為高價態(tài).應用：適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞.

第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理生物樣品的處理方法高溫爐高溫破壞應用——適合人發(fā)樣品的破壞干法破壞第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理生物樣品的處理方法氧瓶燃燒法應用——血漿、人發(fā)中鹵素、硫、硒等血漿：血漿1ml分次點于無灰濾紙上60℃烘干,按規(guī)定折疊后固定.人發(fā)：洗凈、干燥（60℃~80℃）剪碎,

稱取0.1~0.3g置無灰濾紙,按規(guī)定折疊固定.生物樣品的處理方法第五章藥物定量分析與分析方法驗證-樣品前處理第五章藥物定量分析與分析方法驗證生物樣品定量分析方法驗證內(nèi)容與基本要求 1．特異性——避免干擾

2．標準曲線與線性范圍——覆蓋所有濃度范圍

3．準確度——與實際狀況相符

4．精密度——結果可重現(xiàn)

5．定量限——達到峰濃度的1/10～1/20 6．穩(wěn)定性——確保所有樣品準確測定

7．提取回收率——確保準確度18一、方法特異性

方法的特異性(specificity) ——又稱專屬性或專一性，通常與選擇性(selectivity)互用

——系指當有內(nèi)源性物質存在時，方法準確測定待測物質的能力 專屬性——表示所檢測的信號(響應)系屬于待測藥物所特有的 選擇性——系指將待測物質與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力

特異性——涵蓋二者，以驗證所測定的物質與待測藥物的同一性 考察一個分析方法是否具有特異性。第五章藥物定量分析與分析方法驗證19二、標準曲線與線性范圍

標準曲線（standardcurve）——calibrationcurveorworkingcurve ——生物樣品中所測定藥物濃度與響應的相關性（比例的程度）

——通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評價

——除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標準曲線通常為線性模式

——回歸分析法為最小二乘法（leastsquares） 或加權最小二乘法（weightedleastsquares）

線性范圍（linearrang）——標準曲線的最高與最低濃度的區(qū)間

——模擬生物樣品的測定結果應達到試驗要求的精密度和準確度第五章藥物定量分析與分析方法驗證20二、標準曲線與線性范圍(續(xù))

標準曲線——用模擬生物樣品建立 線性范圍(不包括零點)應能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度 不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度

建立標準曲線所使用的模擬生物樣品 應使用與待測的含藥生物樣品相同的生物基質制備第五章藥物定量分析與分析方法驗證21標準曲線的限度要求

藥代動力學或生物利用度研究

——標準曲線至少包括5個濃度(通常為5～8個濃度,不包括零點)

——最高濃度應高于達峰濃度(Cmax)；最低濃度應低于Cmax的10%～5%，并應為方法的LOQ(非LOD) ——回歸方程的截距應接近于零

——相關系數(shù)要求

≥0.99(色譜法)或≥0.98(生物學方法) ——若非線性，可分為高低兩個濃度區(qū)間(每個區(qū)間不少于5個濃度)，分別加權回歸——如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200第五章藥物定量分析與分析方法驗證22三、準確度

方法準確度(accuracy) ——系指用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度

——應使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的所以，通常使用模擬生物樣品測定

——一般用相對回收率(relativerecovery，RR)或相對誤差(relativeerror，RE)表示第五章藥物定量分析與分析方法驗證231.測定法

取空白生物基質（如血漿）數(shù)份，照標準曲線項下方法操作，用標準曲線計算 在標準曲線范圍內(nèi)制備質控(qualitycontrol，QC)樣品

——高(接近上限)、中、低(接近LOQ)3個濃度

——每一濃度至少5個樣本

——與隨行的標準曲線同法測定、計算，每個樣品分析測定1次第五章藥物定量分析與分析方法驗證242.結果計算與限度要求

計算

——測定值M(measured)平均值與理論濃度(加入值)A(added)比值 相對回收率 相對誤差 限度要求

——相對回收率應在85%～115%(LOQ附近80%～120%) ——RE在±15%(LOQ附近為±20%)第五章藥物定量分析與分析方法驗證2025/1/11體內(nèi)藥物分析25四、精密度

方法精密度(precision) ——系指每次測定結果與多次測定的平均值的偏離程度

——表示該分析方法的可重復性(reproducibility) ——反映分析方法的可操作性，是方法驗證的基本要點之一 實際生物樣品的量有限(如血漿，一般為0.5～2ml) ——使用模擬生物樣品測定第五章藥物定量分析與分析方法驗證261.表示方法

方法精密度一般用標準偏差(standarddeviation，SD)或相對標準偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示

SD= RSD= = ——包括批內(nèi)(within-run或intra-assay)RSD—日內(nèi)(within-day)

批間(between-run或inter-assay)RSD—日間(between-day，day-to-day)第五章藥物定量分析與分析方法驗證272.測定法——分別測定法(Ⅰ)

照準確度項下方法，取空白生物基質(如血漿)數(shù)份，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低3個濃度的QC樣品，并分析測定

批內(nèi)RSD ——每一濃度5～6個樣品，每個樣品測定1次，用隨行標準曲線分別計算3個濃度及每1濃度的RSD

批間RSD ——每1分析批內(nèi)每一濃度制備1個樣品，每個樣品測定1次；用隨行標準曲線計算3個濃度(每一濃度5～6個分析批數(shù)據(jù))的RSD第五章藥物定量分析與分析方法驗證282.測定法——連續(xù)測定法(Ⅱ)

若實際樣品測定所用的分析批次少于5批，也可進行3個批次的連續(xù)分析(每1濃度的每1批次為5～6個樣本)——方差分析法

批間RSD=

批內(nèi)RSD= =第五章藥物定量分析與分析方法驗證2025/1/11體內(nèi)藥物分析293.限度要求

在藥代動力學和生物利用度研究中 對

g/ml級水平的RSD一般應≤10%

ng/ml級水平的RSD一般應≤15%

在LOQ附近RSD應≤20%。第五章藥物定量分析與分析方法驗證30五、定量限

方法定量限(limitofquantitation，LOQ) ——系指在保證具有一定可靠性(準確度與精密度符合要求)的前提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度

——又稱為方法靈敏度(sensitivity) ——標準曲線上的最低濃度點(最低濃度點≥LOQ)

要求

——應能滿足測定3～5個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度

——準確度在80%～120%(或RE在±20%的范圍內(nèi)) ——RSD＜20%第五章藥物定量分析與分析方法驗證31六、穩(wěn)定性與質量控制

穩(wěn)定性——包括方法穩(wěn)定性和樣品穩(wěn)定性

方法穩(wěn)定性——方法的耐用性

樣品穩(wěn)定性——生物樣品的存放條件和時間、凍-融循環(huán)

測定法——QC樣品穿插于實際樣品測定全過程

——模擬(或實際)生物樣品及其預處理后的待測溶液進行考察

要求

——準確度85%～115%(RE在±15%范圍內(nèi))，RSD＜15%第五章藥物定量分析與分析方法驗證32七、提取回收率

生物樣品的預處理方法

——重點考慮方法準確度(或相對回收率)，操作簡便、快速

——提取回收率(絕對回收率，absoluterecovery)，≥70%

萃取回收率與相對回收率的意義不同 提取回收率——考察生物樣品預處理過程造成的藥物的程度損失 相對回收率——采用標準曲線可準確計算生物樣品中藥物濃度第五章藥物定量分析與分析方法驗證331.測定法

取空白生物基質(如血漿)，照準確度項下方法，制備高、中、低3個濃度的QC樣品(每一濃度至少5個樣品)，每個樣品分析測定1次 另取等量的相同3個濃度的標準溶液，用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后的殘渣的溶劑稀釋至同體積，同法測定

AT——經(jīng)萃取后的QC樣品的檢測信號或比值(內(nèi)標法) AS——未經(jīng)萃取