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DB33-PCR檢測(cè)方法Real-timePCRdetectiontechniqueforJapaneseencephal浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I1豬流行性乙型腦炎病毒熒光定量RT－PCR檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬流行性乙型腦炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）熒光定量RT－PCR檢除特別說(shuō)明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，所有試3.2.1Trizol：核糖核酸（Ribonucleicacid,RNA2）：KCl0.2g,KH2PO40.2g,NaCl3.2.8引物和探針，其序列如下：上游引物：5－GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTT-3，下游引物：5-TGCTTTCCATCGGCCYAAAA-3，探針：5－FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA-4.1樣品采集4.1.1腦組織：選擇代表性病癥的病死豬，應(yīng)無(wú)菌采集腦組織，將采集到的腦組若不能及時(shí)送檢的全血，應(yīng)分離血清置于-20℃以下保4.2樣品處理4.2.2取全血3500r/min離心54.3.2取n個(gè)滅菌的1.5mL離心管，其中n為被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的和，對(duì)每個(gè)離4.3.3每管加入750μLTrizol，分別加入被檢樣品中離心后的上清液（注意不吸出中間層）轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，加入等體積異丙醇，混4.4.1反應(yīng)體系組成設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，反應(yīng)體系（20μL）由表用量/μLPrimeScriptRTEnzyme444.4.2反應(yīng)條件4.4.3熒光素的設(shè)定ReportDye設(shè)定為FAM，QuencherDye設(shè)定為5.1結(jié)果分析條件設(shè)定5.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)≤30并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，陰性5.3結(jié)果描述及判定Ct值≤35，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增
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