《水產(chǎn)品中河豚毒素的快速檢測 膠體金免疫層析法》

ICS67.080.10

CCSB50

TGAIA

廣東省分析測試協(xié)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GAIAxxx—xxxx

水產(chǎn)品中河豚毒素的快速檢測膠體金免疫

層析法

Rapiddetectionoftetrodotoxininaquaticproducts-Colloidalgold

immunochromatographicassay

(征求意見稿)

xxxx-xx-xx發(fā)布xxxx-xx-xx實(shí)施

發(fā)布

廣東省分析測試協(xié)會

水產(chǎn)品中河豚毒素的快速檢測膠體金免疫層析法

1范圍

本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中河豚毒素的膠體金免疫層析快速檢測方法。

本文件適用于河豚魚、織紋螺、蝦等水產(chǎn)品中的河豚毒素成分的快速篩查。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB5009.206—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中河豚毒素的測定》

GB/T6682實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

檢測線testline

即T線，用于判斷是否檢測到了特定抗原或抗體。

3.2

質(zhì)控線controlline

即C線，用于驗(yàn)證試劑的有效性。

4原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中河豚毒素經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的河豚毒

素特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和檢測卡中檢測線（T線）上河豚毒素抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致

檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與質(zhì)控線（C線）顏色深淺比較，對樣品中河豚毒素進(jìn)

行定性判定。

5試劑與材料

除非另有說明，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為GB/T6682規(guī)定的二級水。

5.1試劑

5.1.1乙酸（CH3COOH）。

5.1.2對甲苯磺酸（TsOH）。

5.2試劑配制

1

5.2.1樣品提取液：稱取3g對甲苯磺酸粉末（5.1.2），加水充分溶解后，定容至100mL，

混合均勻。

5.2.2乙酸-水溶液（1+99）：量取1mL乙酸（5.1.1），加水定容至100mL，混合均勻。

5.2.3磷酸鹽緩沖液：稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44g無水Na2HPO4和0.24g無水KH2PO4,

溶于800mL水中，最后加水定容至1000mL。

5.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

表1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息

中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子質(zhì)量

河豚毒素Tetrodotoxin4368-28-9C11H17O8N3319

注：經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

5.4.1河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1mg/mL）：精密稱取河豚毒素10.0mg，精確至0.1mg，用

乙酸-水溶液（5.2.2）溶解，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶，再用乙酸水溶液（5.2.2）定容至刻度，

配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。?20℃避光保存，有效期1年。

5.4.2河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)中間液（50μg/mL）：移取河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（5.3.1）500μL置于

10mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（5.2.3）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為50μg/mL的

標(biāo)準(zhǔn)中間液。?20℃避光保存，有效期3個(gè)月。

5.4.3河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液（1μg/mL）：移取河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)中間液（5.3.2）200μL置于10

mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（5.2.3）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)

工作液。?20℃避光保存，有效期3個(gè)月。

注：為避免毒素的危害,應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。移液器吸頭等用過的器材、廢棄的提取液

等應(yīng)在氫氧化鈉溶液(1mol/L)中浸泡1h以上,以使毒素分解。

5.5空白試樣

經(jīng)參比方法（GB5009.206—2016）檢測不含河豚毒素的水產(chǎn)品。

5.6材料

河豚毒素膠體金免疫層析試劑盒：一般包含膠體金試紙條、金標(biāo)微孔及配套試劑。

儲存條件：室溫、密封、避光、通風(fēng)干燥保存，保質(zhì)期12個(gè)月。

6儀器與設(shè)備

6.1天平：感量為0.1mg和0.01g。

6.2組織攪碎機(jī)。

6.3渦旋混合器。

6.4振蕩器。

6.5移液器：200μL，1000μL，5mL。

6.6離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000r/min。

6.7膠體金讀數(shù)儀（可選）

2

7分析步驟

7.1試樣制備

河豚去皮去內(nèi)臟，將肌肉部分用水清洗魚體表面的污物,濾紙吸干魚體表面的水分后用

剪刀將魚體分解成肌肉、肝臟、皮膚和性腺(精巢或卵巢)等部分,各部分組織分別用水洗去

血污,濾紙吸干表面的水分后將各組織剪碎,充分均質(zhì)；去除織紋螺體表面的泥漿及污物，打

開螺殼，將其內(nèi)容物剪碎，充分均質(zhì)；蝦去頭和殼后進(jìn)行取樣，充分均質(zhì)。裝入清潔容器內(nèi),

并標(biāo)明標(biāo)記。

7.2試樣提取

稱取2g（精確到0.1g）勻漿試樣于15mL離心管中，加入2mL磷酸鹽緩沖液（5.2.3），

充分渦旋振蕩，4000r/min離心2min。取200μL上清液于5mL離心管中，加入400μL磷酸鹽

緩沖液（5.2.3），渦旋混合30s，作為待測液。

7.3試樣測定

取100μL樣品待測液加入金標(biāo)微孔中，充分混勻后室溫孵育3min，隨后將微孔內(nèi)的所

有溶液吸出，加到試紙條的樣品墊上，反應(yīng)5min后觀察結(jié)果。

注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。若無金標(biāo)微孔，可直接取100μL待測液滴加至試

紙條樣品孔上。

7.4質(zhì)量控制

7.4.1每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和質(zhì)控試驗(yàn)。

7.4.1.1空白試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取液體或稱取固體空白試樣，按照7.1、7.2和7.3步驟與試樣同法操作。

7.4.1.2質(zhì)控試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取空白試樣2g（精確到0.1g）于15mL離心管中，加入20μL標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.4.3），

使河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為10μg/kg，按照7.1、7.2和7.3步驟與試樣同法操作。

7.4.2空白試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陽性。

8性能指標(biāo)

8.1性能指標(biāo)計(jì)算方法按照附錄A執(zhí)行。

8.2檢出限：10μg/kg

8.3靈敏度：≥99%。

8.4假陰性率：≤1%。

8.5假陽性率：≤3%。

8.6特異性；≥97%。

9結(jié)果判定

3

通過對比C線和T線的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定，目視判定示意圖見圖1或2。結(jié)果判定也

可根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

9.1無效：C線不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。

9.2陰性結(jié)果：C線顯色，T線顏色比C線顏色深或T線顏色與C線顏色相當(dāng)，均表示樣

品中不含待測組分或含量低于方法檢測限，判為陰性。

9.3陽性結(jié)果：C線線顯色，T線顏色比C線顏色明顯淺或T線不顯色，均表示樣品中待

測組分含量高于方法檢測限，判為陽性。

注：T線為檢測線，C線為質(zhì)控線。

圖1試紙條目視判定示意圖

注：T線為檢測線，C線為質(zhì)控線。

圖2檢測卡目視判定示意圖

10確證

當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時(shí)，采用GB5009.206—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中河豚毒素

的測定》中第三法液相色譜-熒光檢測法進(jìn)行確證。

11其他

4

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)

不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本

方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。

A

A

附錄A

（規(guī)范性）

快速檢測方法性能指標(biāo)計(jì)算表

快速檢測方法性能指標(biāo)計(jì)算方法見表A.1。

表A.1性能指標(biāo)計(jì)算方法

檢測結(jié)果b

樣品情況"總數(shù)

陽性陰性

陽性N11N12N1.=N11+N12

陰性N21N22N2.=N21+N22

總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2

X2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21)，

顯著性差異(X2)

自由度（df)=1

靈敏度（p+，％)p+=N11/N1.

假陰性率（pf-，