DB33T 2492-2022 蝦肝腸胞蟲核酸檢測技術(shù)規(guī)范

33Technicalspecificationfornucleicaciddhepatopenaei浙江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：朱凝瑜、鄭曉葉、梁倩蓉、葉鍵、1蝦肝腸胞蟲核酸檢測技術(shù)規(guī)范4縮略語BstDNA聚合酶：嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶（BacCt值：反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacidNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribLAMP：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediatedisothPCR：聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreactiSYBRGreenIqPCRMix：含雙鏈嵌合熒光染色劑的熒光定量2）：5.10This平衡酚（飽和酚）、1）：）：5.18瓊脂糖：電泳級。5.27BstDNA聚合酶，8U/μL。36.5水平電泳槽：50mL～500mL，帶有凝膠7.1.1.2對蝦受精卵、幼體、仔蝦及體長3cm以下稚蝦蟲、豐年蟲等餌料生物樣品取完整個體，冷藏運(yùn)輸進(jìn)行核酸抽提。或置于滅菌采樣容器內(nèi)，加入待檢將采集樣品用研磨棒研磨均勻，取10mg～100mg組織勻漿液，置于滅菌1.5mL的離心管中，用于48.3冷卻至室溫，加入等體積平衡酚，顛倒混合10min，于10000r/min離心3min，取上層水相至新），9.1通用要求樣品的PCR擴(kuò)增應(yīng)在PCR反應(yīng)區(qū)獨(dú)立完成，避免造成區(qū)域間污按商品化預(yù)混液說明書配制反應(yīng)體系）。同時設(shè)陽性對照、陰性對照及空白對照。短59.2.3瓊脂糖凝膠電泳加樣孔朝負(fù)極，加入1×TAE電泳緩沖液至沒過膠面勻后加入加樣孔，同時設(shè)立DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對照。5V/cm電泳30min，當(dāng)溴酚藍(lán)2/3處時停止電泳，凝膠成像儀觀察并判斷結(jié)果。若條帶未區(qū)分開，可適當(dāng)增加電泳9.2.4結(jié)果判定9.2.4.3待測樣品第一輪PCR在514bp處9.2.4.4結(jié)果判定可疑時，應(yīng)用其他檢測方法進(jìn)行確認(rèn)。9.3.1反應(yīng)體系在熒光PCR管中加入2×SYBRGre陰性對照及空白對照。短暫離心后將PCR管置于9.3.2反應(yīng)條件9.3.3結(jié)果判定9.4.1反應(yīng)體系在熒光PCR管中加入10×ThermoPol緩沖液2.5μL、外最后加滅菌雙蒸水至25μL體積（或者按商品化預(yù)混液說明書配制反應(yīng)體系）。同時設(shè)陽性對照、陰性對照及空白對照。短暫離心后將PCR管置于恒溫?zé)晒釶CR儀中或熒光定量PCR儀中選擇SYBR通9.4.2反應(yīng)條件9.4.3結(jié)果判定69.4.3.4結(jié)果判定可疑時，應(yīng)用其他檢測方法進(jìn)行確認(rèn)。7(資料性)EHP檢測方法引物序列及其在靶基因中的位置A.1EHP套式PCR引物序列及其在靶基因中的位置A.1.1套式PCR引物序列套式PCR引物序列及濃度見表A.1。引物名稱引物序列(5'→3')引物濃度GCTGTTTGTCTCCAACTGTA.1.2套式PCR引物在靶基因中的位置5'-ATGTTAGAAGATGCAAAGAGATATGTTGAAAGAAAAATTAAAAAAATTGAATACATTCATACAAAGTTACCAAAAAACAAAACAGGTACAGAAAAATGCGTGACGAACTAAATGTTTTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGTAATTACGAGTACAATTCTCAAACATTTTCACCATTGGTCAAATACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCATTAAAAAGAGACGATATCACAGCATTTGTAGGATATGAGCTTTCAAATACAGTTGGAGACAAACAGCTTAAAGAAGTTTGCAATGATTTTTCTAAAGCATATGAATGCATATCAGAAGATAAAAGGAAAATGGATCATCAACGCAAAACTGTAAATAACCTAAGATATGATTTAGAAGAATTTAGAAAAAAAATTAGGAGAAACATCTGAAAAAACACTAGTAGAAATGGATGAATTTATGCATTTAAGTATGATAAAAGAAAATTGCAAAGACACATCGTGAATTTA.2EHP熒光定量PCR引物序列及其在靶基因中的位置A.2.1熒光定量PCR引物序列熒光定量PCR引物序列及濃度見表A.2。8表A.2EHP熒光定量PCR引物序列引物名稱引物序列(5'→3')引物濃度ACAAAGTTACCAGAAGGTTATGA.2.2熒光定量PCR引物在靶基因中的位置熒光定量PCR引物在EHP靶基因中的位置見圖A.2。AGAAAATTGCAAAGACACATCGTGAATTTT圖A.2EHP熒光定量PCR引物在靶基因中的位置A.3EHPLAMP引物序列及其在靶基因中的位置表A.3EHPLAMP引物序列引物名稱引物序列(5'→3')引物濃度TAGAAGATGCAAAGAGATATTACTTAAACCCTTAACAACACTCTAAGTTACCAGAAGGTTATGAATGGCGGCACAATTCTCAATGTCTGTGTAAATATCGTAACATTTAGTTCGTCACGCATTCAAACACTGTAAACCTTA.3.2LAMP引物在靶基因中的位置9F3