細(xì)胞復(fù)蘇失敗原因分析-復(fù)蘇篇

細(xì)胞復(fù)蘇失敗原因分析——復(fù)蘇篇細(xì)胞復(fù)蘇成敗和凍存及復(fù)蘇操作密切相關(guān)。上個(gè)星期和大家分享了細(xì)胞凍存方面容易出錯(cuò)的細(xì)節(jié)，詳見《細(xì)胞復(fù)蘇失敗原因分析——凍存篇》。本篇主要從復(fù)蘇角度分析，排查復(fù)蘇過程中容易出現(xiàn)的問題。同樣，我們先復(fù)習(xí)一下復(fù)蘇步驟：1.提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速；2.準(zhǔn)備一個(gè)15ml離心管并加入適量培養(yǎng)基。3.取出凍存管，浸入水浴鍋迅速搖晃使細(xì)胞在2min內(nèi)充分融化；4.將細(xì)胞懸液緩慢滴入提前加了培養(yǎng)基的離心管，1000rpm3min離心；5.棄上清，重懸細(xì)胞并接種至培養(yǎng)器皿中，放入培養(yǎng)箱。復(fù)蘇常見的錯(cuò)誤操作1.若液氮或冰箱距離水浴鍋較遠(yuǎn)，沒有做保冷措施為防止細(xì)胞在運(yùn)輸路上開始融化（特別是夏季），凍存細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至水浴鍋。2.運(yùn)輸凍存管時(shí)手觸碰到細(xì)胞部分或放在了口袋里請勿用手觸碰凍存管身，避免局部溫度升高導(dǎo)致細(xì)胞開始融化。應(yīng)捏住管蓋或放在容器中運(yùn)輸3.采用錯(cuò)誤的方式融化細(xì)胞不要用手捂化（搓熱也不行），手心溫度不夠高，細(xì)胞受熱不均勻且降溫速度太慢導(dǎo)致細(xì)胞死亡。4.水浴時(shí)沒有嚴(yán)格控制時(shí)間，直接放水里靜置，沒有晃動促進(jìn)融化細(xì)胞復(fù)蘇需遵循“快融”原則，建議在2min內(nèi)將細(xì)胞充分融化，水浴時(shí)間越長活率越低。最好的方法是捏住管蓋，將管身浸沒水中快速搖晃，促進(jìn)細(xì)胞融化。切忌將凍存管靜置在水浴中。5.水浴結(jié)束時(shí)管內(nèi)還有較大冰塊如果沒融化完全，還有比較大的冰塊，也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。一方面冰塊中的細(xì)胞緩慢升溫而死亡，另一方面冰塊導(dǎo)致已融化的細(xì)胞被低溫?fù)p傷。有的同學(xué)說2min的水浴很難讓細(xì)胞融化，那么咱們可以將水浴鍋溫度提高至39度（小編親測可行），搖晃速度加快，擔(dān)心污染可以將凍存管放在一次性PE手套內(nèi)再進(jìn)行水浴。水浴鍋里的水不能太少，否則凍存管放入水后局部溫度會達(dá)不到預(yù)設(shè)溫度，導(dǎo)致融化過慢。6.細(xì)胞融化后沒有離心去除DMSO有的同學(xué)復(fù)蘇細(xì)胞會在細(xì)胞融化后加10倍培養(yǎng)基稀釋，不離心直接培養(yǎng)，等細(xì)胞貼壁后換液。雖然這對于好養(yǎng)的貼壁細(xì)胞是可行的，但不是長遠(yuǎn)之計(jì)，也不適用于懸浮細(xì)胞。DMSO對細(xì)胞有一定毒性，有些細(xì)胞對DMSO比較敏感，如HL-60細(xì)胞等。如果你不清楚自己的細(xì)胞是否對DMSO敏感，那么還是離心去除上清最為保險(xiǎn)。以上由小尚多年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而