人胃腸癌類器官藥物敏感性測試管理規(guī)范

I人胃腸癌類器官藥物敏感性測試管理規(guī)范范圍本文件規(guī)定了人胃腸癌患者來源的腫瘤類器官的倫理、技術(shù)和管理等要求。本文件適用于人胃腸癌患者來源的腫瘤類器官藥物敏感性測試的操作規(guī)范、流程管理和使用指引。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T37864生物樣本庫質(zhì)量和能力通用要求WS213丙型肝炎診斷WS293艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)WS299乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)類器官藥物敏感性檢測指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)治療臨床應(yīng)用專家共識(2022年版)腫瘤類器官診治平臺的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中國專家共識(2022年版)中華人民共和國藥典（2020年版）全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程涉及人的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法（2023年版）術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1類器官organoids由干細(xì)胞或前體細(xì)胞體外培養(yǎng)形成的，包含組織器官特異性的多種細(xì)胞，能自我更新，具有特定器官關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能特性的三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)物。3.2腫瘤類器官tumoroids由患者的腫瘤組織或其他含腫瘤細(xì)胞的樣本中提取的腫瘤細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)而成的，可以在體外擴(kuò)增并重現(xiàn)原始腫瘤病理形態(tài)、遺傳特征和治療反應(yīng)特征的類器官。3.3人胃癌類器官humangastriccancerorganoids由病理診斷為胃癌患者的胃腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)而成的具有胃癌特征的腫瘤類器官。3.4人腸癌類器官humanintestinalcancerorganoids由病理診斷為腸癌患者的腸腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)而成的具有腸癌特征的腫瘤類器官。3.5類器官傳代organoidpassage體外培養(yǎng)的類器官經(jīng)過物理、化學(xué)或生物等處理方法，將原有類器官分成更小細(xì)胞簇甚至是單細(xì)胞，重新接種到與原培養(yǎng)條件相同的新培養(yǎng)體系中進(jìn)行體外培養(yǎng)的過程。3.6類器官凍存organoidcryopreservation類器官暫時脫離生長狀態(tài)并保持其細(xì)胞組成、基因表達(dá)特征及功能特性的低溫冷凍過程。3.7類器官復(fù)蘇organoidthawing凍存的類器官重新獲得生長和代謝活力的過程。3.8類器官藥物敏感性測試Organoidsdrugsensitivitytesting將多種藥物組合或單獨(dú)的藥物作用于類器官進(jìn)行藥效、毒性評估的過程，簡稱類器官藥敏測試。縮略語下列縮略語適用于本文件。DAB：二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine）DMSO：二甲基亞砜（DimethylSulfoxide）DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV：人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）H&E：蘇木精-伊紅（HematoxylinandEosin）PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSaline）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）STR：短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemRepeat）倫理要求5.1人胃癌和人腸癌類器官的倫理審查要求依照國家衛(wèi)生健康委、教育部、科技部、國家中醫(yī)藥局發(fā)布的《涉及人的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》（2023年版）進(jìn)行審查。5.2應(yīng)與類器官原組織供者簽署書面的合法有效的知情同意通知書，包括但不限于：合適條件下潛在研究及治療的應(yīng)用、研究成果潛在的商業(yè)應(yīng)用及其他問題所適用的內(nèi)容。應(yīng)對類器官原組織供者個人信息進(jìn)行隱私保護(hù)。5.3人胃癌和腸癌組織的采集、人胃癌和腸癌類器官的生產(chǎn)，以及利用人胃癌和腸癌類器官開展科學(xué)研究、產(chǎn)品開發(fā)、臨床藥敏測試等相關(guān)活動均需經(jīng)過倫理審查委員會審查通過。類器官要求6.1形態(tài)學(xué)特征人胃癌類器官在光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)囊泡型、致密型或混合型等多種形態(tài)特征；人腸癌類器官在光學(xué)顯微鏡下應(yīng)邊緣清晰、透亮，由細(xì)胞簇組合而成，呈現(xiàn)致密型、松散型、囊泡型或混合型等形態(tài)特征。體外三維培養(yǎng)類器官，可使用光學(xué)顯微鏡觀察，光學(xué)顯微鏡的倍數(shù)參照類器官的直徑大小選擇。6.2組織病理學(xué)特征類器官中的細(xì)胞應(yīng)與原腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞的異型性特征保持一致，如核深染、異常核分裂象、核質(zhì)比失調(diào)等。應(yīng)對類器官進(jìn)行相關(guān)標(biāo)志物檢測，檢測結(jié)果應(yīng)與原腫瘤組織結(jié)果基本一致，一致性不低于50%。人胃癌類器官檢測的標(biāo)志物包括但不限于CEA、CA19-9和Ki67，人腸癌類器官檢測的標(biāo)志物包括但不限于CDX2、CK20、CK7和Ki67。可按照附錄A檢測。6.3基因遺傳特征應(yīng)對類器官進(jìn)行基因變異檢測，檢測結(jié)果應(yīng)與原腫瘤組織的基因變異結(jié)果基本一致。人胃癌類器官和人腸癌類器官應(yīng)檢測的腫瘤相關(guān)熱點(diǎn)基因包括但不限于TP53、KRAS、NRAS、ERBB2、BRAF、NTRK1、ARID1、ARBB2、MUC6、RHOA、RNF43、APC、SMAD4、CDH1和PIK3CA。可按照附錄B檢測。體外生長特征從胃、腸癌患者來源的人胃、腸癌組織或細(xì)胞，初次在體外培養(yǎng)成人胃腸癌類器官后，應(yīng)能在體外維持培養(yǎng)2個月，或應(yīng)能傳代至少3代，且類器官數(shù)量應(yīng)保持穩(wěn)定。當(dāng)類器官傳代后，應(yīng)能體外重新生長成為新的類器官，重新生長的類器官和傳代前類器官的形態(tài)學(xué)特征、組織病理學(xué)特征和遺傳特征應(yīng)保持一致。存活率復(fù)蘇的類器官存活率應(yīng)不低于50%?？砂凑崭戒汣檢測。6.6微生物支原體、細(xì)菌、真菌、HIV、HBV、HCV、外源病毒因子等應(yīng)為陰性。支原體按照《中華人民共和國藥典》（2020年版）中“3301支原體檢查法”檢測。細(xì)菌及真菌按照《中華人民共和國藥典》（2020年版）中“1101無菌檢查法”檢測。HIV按照WS293核酸法檢測。HBV按照WS299核酸法檢測。HCV按照WS213核酸法檢驗(yàn)。外源病毒因子按照《中華人民共和國藥典》（2020年版）中“3302外源病毒因子檢查法”檢測。體外培養(yǎng)的類器官，進(jìn)行STR檢測及分型鑒定，應(yīng)與供體STR一致?？砂凑崭戒汥檢測。成瘤性當(dāng)人胃腸癌類器官通過體內(nèi)異種移植的方式接種于免疫缺陷小鼠后，應(yīng)能形成腫瘤?？砂凑崭戒汦檢測。類器官管理要求標(biāo)識應(yīng)建立培養(yǎng)、驗(yàn)證、記錄和維護(hù)等相關(guān)人胃腸癌類器官的規(guī)程。應(yīng)建立人胃腸癌類器官的唯一標(biāo)識。此唯一標(biāo)識應(yīng)至少包括類器官名稱、樣品編號或批號，應(yīng)有與供者相關(guān)的信息代碼。應(yīng)記錄人胃腸癌類器官培養(yǎng)信息，包括但不限于培養(yǎng)時間、培養(yǎng)人員、培養(yǎng)方法、類器官名稱等。凍存應(yīng)建立人胃腸癌類器官凍存規(guī)范。凍存過程應(yīng)控制細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、冷凍速率等，并選擇使用適當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑，并對冷凍過程進(jìn)行記錄，包括但不限于：類器官名稱、批號、代數(shù)、凍存日期、凍存人員、類器官數(shù)量等。應(yīng)按照GB/T37864要求對人胃腸癌類器官進(jìn)行儲存。應(yīng)對每批儲存的人胃腸癌類器官進(jìn)行記錄，記錄內(nèi)容包括但不限于：類器官名稱、批號、儲存日期、儲存位置和存儲數(shù)量等。7.3運(yùn)輸供應(yīng)方應(yīng)制定人胃腸癌類器官運(yùn)輸規(guī)程并實(shí)施。應(yīng)按照GB/T37864要求進(jìn)行運(yùn)輸，并根據(jù)人胃腸癌類器官的使用需求選擇適當(dāng)?shù)倪\(yùn)輸方式和運(yùn)輸條件。人胃腸癌類器官應(yīng)以凍存狀態(tài)或以生長狀態(tài)的方式運(yùn)輸，根據(jù)規(guī)程控制運(yùn)輸條件包括但不限于：溫度、防污染措施、適當(dāng)?shù)陌b等，并告知接收方相關(guān)信息。人胃腸癌類器官的運(yùn)輸應(yīng)記錄以下方面，包括但不限于：運(yùn)輸方式和條件、運(yùn)輸路線、聯(lián)系方式和收件人信息等。應(yīng)在必要時檢查運(yùn)輸中的包裹，并在可能的情況下添加新的冷凍源（如干冰和液氮）以保持適宜的運(yùn)輸溫度。7.4使用說明應(yīng)按照GB/T37864要求進(jìn)行人胃腸癌類器官分發(fā)。使用前，應(yīng)由人胃腸癌類器官接收方提交申請，并經(jīng)供應(yīng)方根據(jù)其正式程序進(jìn)行審批。供應(yīng)方與用戶簽署MTA或同等條款和條件文件。供應(yīng)方應(yīng)向用戶提供相關(guān)信息包括但不限于：可追溯的批號、質(zhì)量證明、培養(yǎng)方法、凍存方法、凍存日期、建庫日期、微生物檢測數(shù)據(jù)、匿名化的類器官供者的知情同意書副本等。類器官藥敏測試8.1藥物板應(yīng)建立人胃腸癌類器官藥物板的管理規(guī)范，包括但不限于：藥物配制時間、藥物配制人員、取用記錄和藥物板維護(hù)等相關(guān)類器官藥物篩選的規(guī)程。應(yīng)建立人胃腸癌類器官藥物板的詳細(xì)標(biāo)識，此標(biāo)識表包括但不限于藥物名稱、藥物位置、藥物濃度范圍、藥物體積、配制日期、有效期記錄、配制人員等。應(yīng)結(jié)合藥物種類、藥物溶劑、藥物的有效儲存條件等選擇合適的藥物儲存條件，存儲條件控制內(nèi)容包括但不限于：存儲溫度、防污染措施、封膜處理等，并記錄相應(yīng)儲存條件下藥物的有效期、儲存日期、儲存位置等信息。且應(yīng)對每批儲存的藥物板進(jìn)行記錄，記錄內(nèi)容包括但不限于：藥物板名稱、藥物數(shù)目、藥物批號等。供應(yīng)方應(yīng)制定人胃腸癌類器官藥物板的運(yùn)輸規(guī)程并實(shí)施。根據(jù)藥物板的使用需求選擇適當(dāng)?shù)倪\(yùn)輸方式和運(yùn)輸條件，必要時檢查運(yùn)輸中的包裹，并在可能的情況下添加新的冷凍源以保持適宜的運(yùn)輸溫度。且應(yīng)記錄藥物板運(yùn)輸記錄，包括但不限于：運(yùn)輸方式和條件、運(yùn)輸路線、聯(lián)系方式和收件人信息等。8.2類器官用于臨床藥敏測試的人胃腸癌類器官應(yīng)符合第6章的技術(shù)要求，且類器官代數(shù)應(yīng)不超過20。8.3操作流程8.3.1儀器和設(shè)備準(zhǔn)備：微孔板、移液工作站/自動分液器、自動微量加樣器、化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性分析系統(tǒng)。8.3.2試劑準(zhǔn)備：基質(zhì)膠、人胃腸癌類器官培養(yǎng)基、藥物板、ATP活性檢測試劑、Staurosporine、蛋白酶抑制劑Mg132。8.3.3檢測步驟8.3.3.1收集數(shù)目合適且生長狀態(tài)良好的人胃腸癌類器官，用PBS洗去基質(zhì)膠后，離心收集類器官。8.3.3.2采用機(jī)械或酶解法消化人胃腸癌類器官成單細(xì)胞，用預(yù)混5%～50%基質(zhì)膠的人胃腸癌類器官培養(yǎng)基重懸細(xì)胞或用基質(zhì)膠預(yù)先包被板底后鋪入單細(xì)胞懸液。使用自動分液器將單細(xì)胞混液按合適數(shù)目進(jìn)行鋪板，孔間細(xì)胞密度要求一致。8.3.3.3根據(jù)藥物的有效抑制濃度范圍合理設(shè)計藥物工作劑量梯度，并預(yù)設(shè)好藥物板上各藥物的位置及濃度分布孔位。按藥物說明書選擇合適溶劑溶解藥物配成合適的儲液濃度，將儲液藥物依次稀釋到相應(yīng)的工作劑量濃度并移至對應(yīng)的藥物板空位。8.3.4藥物處理8.3.4.1提前設(shè)置好藥物處理分組，陰性對照組、藥物處理組和陽性對照組。8.3.4.2提前預(yù)設(shè)好人胃腸癌類器官單細(xì)胞板上藥物處理的組別、濃度和加樣位置。8.3.4.3在藥物處理前后觀察且記錄類器官的生長特征，用微量加樣器將藥物板上對應(yīng)的藥液按相應(yīng)濃度移至上述細(xì)胞板位置。8.3.5細(xì)胞活性檢測8.3.5.1按ATP化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒說明書對細(xì)胞活性進(jìn)行檢測。8.3.5.2使用化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性檢測儀對加入細(xì)胞活性ATP檢測試劑的細(xì)胞進(jìn)行檢測，得到各實(shí)驗(yàn)藥物組細(xì)胞RLU數(shù)值并分析上述各組的細(xì)胞活性變化。8.3.6結(jié)果分析與判讀8.3.6.1藥物溶劑和空白組為陰性對照組，藥物處理組為各濃度梯度的藥物，蛋白酶抑制劑Mg132或Staurosporine處理組為陽性對照組。陰性對照組細(xì)胞活性應(yīng)最強(qiáng)。8.3.6.2類器官細(xì)胞活性按照公式（F.1）進(jìn)行計算：CV=（CV藥物/CV對照）×100%（F.1）式中：CV—類器官細(xì)胞相對活力；CV藥物—藥物處理組類器官細(xì)胞活力；CV對照—陰性對照組類器官細(xì)胞活力。8.3.7計算與分析按上式計算各藥物濃度劑量下的細(xì)胞活力，保證至少三次技術(shù)重復(fù)，結(jié)合藥物濃度，繪制劑量反應(yīng)曲線，得出IC50。8.3.8結(jié)果判讀類器官藥物反應(yīng)結(jié)果與臨床療效的一致性比較依照共識進(jìn)行判讀。8.4流程管理應(yīng)記錄人胃腸癌類器官藥物篩選信息，包括但不限于類器官名稱、類器官代數(shù)、類器官的數(shù)目、測試藥物名稱、測試藥物數(shù)目、藥物篩選人員等。應(yīng)建立人胃腸癌類器官藥敏測試實(shí)驗(yàn)規(guī)范，應(yīng)按照《腫瘤類器官診治平臺的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中國專家共識（2022年版）》和《類器官藥物敏感性測試指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)治療臨床應(yīng)用專家共識（2022年版）》（以下簡稱“共識”）要求進(jìn)行藥敏測試，包括但不限于：患者知情同意授權(quán)、入組患者人群、藥物測試選擇、藥物測試結(jié)果判讀、患者個性化治療方案選擇等。應(yīng)按照共識要求記錄人胃腸癌類器官藥敏實(shí)驗(yàn)，記錄內(nèi)容包括但不限于：人胃腸癌組織原代處理圖片、類器官培養(yǎng)成功圖片、類器官的數(shù)目/直徑變化、用藥前后類器官的形態(tài)學(xué)變化、藥物劑量變化曲線、細(xì)胞活力量化結(jié)果統(tǒng)計等。應(yīng)按照共識要求在具有測試資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)或第三方檢測單位進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，測試結(jié)束后應(yīng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果出具測試報告，報告內(nèi)容包括但不限于腫瘤生長抑制率、半數(shù)抑制濃度、二分類法或三分類法區(qū)分出藥物抑制效果等。由于胃、腸腫瘤的復(fù)雜性，應(yīng)按照共識要求在臨床診療過程中進(jìn)行多學(xué)科討論，依據(jù)患者具體病情、病理結(jié)果及患者原始癌組織的基因測試結(jié)果綜合判斷胃癌或腸癌類器官藥敏報告，為患者制定安全、潛在獲益的單藥、聯(lián)合用藥策略。

附錄A（資料性）類器官組織病理檢測石蠟包埋法A.1儀器和設(shè)備石蠟包埋儀、石蠟切片機(jī)、組織攤片機(jī)、光學(xué)顯微鏡。A.2試劑A.2.1石蠟切片制備試劑：按照相應(yīng)要求配制石蠟包埋需要試劑，包括固定液、脫水液、石蠟、脫蠟液、復(fù)水液、乙醇、二甲苯、中性樹脂。A.2.2H&E染色試劑：蘇木精、伊紅。A.2.3除特別說明外，所用試劑均為分析純，檢測用水均為去離子水。A.3檢測步驟A.3.1樣品準(zhǔn)備和固定取體外培養(yǎng)的類器官，用移液器吸出類器官和基質(zhì)膠混合物，轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi)，離心棄上清，用4%多聚甲醛固定類器官15min-30min。A.3.2類器官石蠟切片制作按照石蠟切片制作方法對類器官樣品進(jìn)行固定，脫水，透明后浸入石蠟中，用石蠟包埋儀器進(jìn)行包埋。用石蠟切片機(jī)切成標(biāo)準(zhǔn)厚度，制成石蠟切片。A.3.3H&E染色將類器官石蠟切片進(jìn)行脫蠟，復(fù)水，用蘇木精染色，分化后沖水。接著用伊紅染色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。A.3.4免疫組化染色將類器官石蠟切片進(jìn)行脫蠟，復(fù)水，抗原修復(fù)，加封閉液進(jìn)行封閉。加一抗孵育，PBS清洗。加對應(yīng)二抗，PBS清洗。用DAB進(jìn)行顯色，加水終止顯色反應(yīng)。蘇木精襯染，鹽酸透明后沖水。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。A.4結(jié)果分析得到的檢測結(jié)果由具有病理診斷資質(zhì)的人員分析和判定，并與原腫瘤組織病理檢測結(jié)果具有一致性。

附錄B（資料性）類器官基因突變檢測測序法B.1儀器和設(shè)備離心機(jī)、-80℃冰箱、超微量分光光度計。B.2試劑按相應(yīng)要求準(zhǔn)備的細(xì)胞DNA抽提試劑盒。B.3樣品保存樣品制備好后，于-80℃以下保存。B.4檢測步驟B.4.1樣品制備將類器官在基質(zhì)膠中培養(yǎng)至穩(wěn)定生長狀態(tài)，用移液器吹打基質(zhì)膠，至基質(zhì)膠破碎后，混合液收集于離心管中，離心收集類器官，棄上清。B.4.2DNA提取按細(xì)胞DNA抽提試劑盒說明書對類器官基因組DNA進(jìn)行提取，提取后的DNA使用超微量分光光度計進(jìn)行濃度和質(zhì)量檢測。B.4.3測序?qū)㈩惼鞴貲NA樣本和原腫瘤組織送至具有臨床基因檢測資質(zhì)的機(jī)構(gòu)進(jìn)行一代測序或二代測序檢測，或采用ARMS法、ddPCR法等對基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測。B.5結(jié)果分析分析基因突變位點(diǎn)，比較類器官測序和原腫瘤組織測序結(jié)果的一致性。

附錄C（資料性）類器官存活率檢測鈣黃綠素AM染色法C.1儀器和設(shè)備倒置熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)箱。C.2試劑C.2.1細(xì)胞級別DMSO。C.2.2PBS（pH為7.4）。C.2.3儲存液的配制（鈣黃綠素AM溶液）：用細(xì)胞級別DMSO制備2mmol/L的鈣黃綠AM素溶液。C.2.4除特別說明外，所用試劑均為分析純，檢測用水均為去離子水。C.3檢測步驟C.3.1類器官總數(shù)量計數(shù)將體外培養(yǎng)的類器官置于光學(xué)顯微鏡下，觀察其形態(tài)和狀態(tài)，通過肉眼觀察來確定類器官是否存活。C.3.2活類器官數(shù)量計數(shù)實(shí)驗(yàn)時，取出已經(jīng)配置好的鈣黃綠素AM儲存液，加入鈣黃綠素AM溶液到培養(yǎng)基中至終濃度為0.2μmol/L。隨后在37℃條件下孵育60min。到達(dá)時間后，用PBS緩慢清洗掉帶有鈣黃綠素AM的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基。用490nm激發(fā)波長，515nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察類器官并斷層掃描拍照。活類器官在熒光顯微鏡下顯示為綠色且邊緣清晰。對直徑≥20μm的活類器官計數(shù)。C.4類器官存活率計算符合6.1類器官形態(tài)要求，對直徑≥20μm的類器官計數(shù)。類器官存活率按照公式（C.1）進(jìn)行計算：X=（N活/N總）×100%（C.1）式中：X—類器官存活率；N活—活類器官數(shù)量；N總—總類器官數(shù)量。C.5計算與分析按照C.3步驟再重復(fù)兩次，計算三次活類器官比率結(jié)果的平均值，記為類器官平均存活率。C.6精密度在重復(fù)性條件下獲得的三次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的10%。?

附錄D（資料性）類器官STR鑒定D.1儀器和設(shè)備離心機(jī)、PCR儀、毛細(xì)管電泳儀、微量紫外分光光度計、-80℃冰箱。D.2試劑細(xì)胞DNA抽提試劑盒、STR細(xì)胞鑒定試劑盒。D.3樣品保存樣品制備好后，于-80℃以下保存。D.4檢測步驟D.4.1樣品制備將類器官在基質(zhì)膠中培養(yǎng)至穩(wěn)定生長狀態(tài)，用移液器吹打基質(zhì)膠，至基質(zhì)膠破碎后，混合液收集于離心管中，離心收集類器官，棄上清。D.4.2DNA提取D.4.2.1按細(xì)胞DNA抽提試劑盒說明書對類器官和原腫瘤組織基因組DNA進(jìn)行提?。籇.4.2.2紫外分光光度計檢測提取后的DNA的吸光度A260/A280的比值在1.8~2.0之間；D.4.2.3DNA樣本要求：DNA體積≥20μL，濃度≥50ng/μL。D.4.3PCR擴(kuò)增D.4.4.1按照標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增方法對STR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，也可以按照經(jīng)過質(zhì)檢合格的商業(yè)化試劑盒說明書進(jìn)行。D.4.4.2設(shè)置陰性對照組、樣本檢測組和陽性對照組。陰性對照組采用無菌水為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，樣本檢測組以類器官和原腫瘤組織樣本提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽性對照組采用DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。D.4.4.3采用瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、陰性對照組和陽性對照組。陰性對照組無目的條帶，陽性對照組有清晰的目的條帶。D.4.4STR基因分型檢測使用毛細(xì)管電泳基因分析儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并得到STR遺傳圖譜數(shù)據(jù)。陽性對照組有清晰的目的條帶。類器官與原腫瘤組織的擴(kuò)增條帶應(yīng)該一致。D.5結(jié)果分析D.5.1當(dāng)STR位點(diǎn)的等位基因含有相同重復(fù)次數(shù)時，圖譜僅出現(xiàn)1個等位基因峰；當(dāng)含有不同重復(fù)次數(shù)時，圖譜會出現(xiàn)2個等位基因峰。且當(dāng)陰性對照組無等位基因峰出現(xiàn)，陽性對照組檢測結(jié)果與其標(biāo)準(zhǔn)基因分型數(shù)據(jù)一致時視為有效檢測。D.5.2在檢測有效的前提下，若受檢樣本STR位點(diǎn)出現(xiàn)2個以上的等位基因峰，經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)排除引物結(jié)合區(qū)突變等干擾因素后，判定受檢樣本存在交叉污染。?

附錄E(資料性)成瘤性檢測人胃腸癌類器官皮下成瘤實(shí)驗(yàn)E.1儀器和設(shè)備接種針、游標(biāo)卡尺、體重秤、4℃冰箱。E.2試劑基質(zhì)膠。E.3實(shí)驗(yàn)動物NSG（NODscidgamma）或NCG（NODCRISPRPrkdcIl2rgamma）免疫缺陷小鼠，4-6周鼠齡。E.4檢測步驟E.4.1樣本制備收集生長狀態(tài)良好且數(shù)量合適的人胃腸癌類器官，并通過50%基質(zhì)膠進(jìn)行重懸，置于4℃?zhèn)溆?。E.4.2皮下移植用接種針將人胃腸癌類器官注射到周齡為4-6周的免疫缺陷小鼠皮下，每個類器官樣本需要保證至少兩個生物學(xué)重復(fù)，并在注射后觀察和記錄小鼠皮下腫瘤的生長情況。E.4.3皮下腫瘤收集對皮下腫瘤進(jìn)行收集，記錄并拍照。E.5結(jié)果分析E.5.1皮下腫瘤大小計算E.5.1.1皮下腫瘤體積計算皮下腫瘤體積按照公式（E.1）進(jìn)行計算：V（cm3）=1/2×長徑×短徑2（E.1）式中：V—腫瘤體積；長徑—腫塊最長兩點(diǎn)的距離短徑—腫塊最短兩點(diǎn)的距離。E.5.1.2計算與分析計算多次腫瘤大小結(jié)果的平均值，記為腫塊的大小。E.5.2皮下腫瘤組織病理學(xué)檢測按照附錄A檢測。參?考?文?獻(xiàn)[1]國家衛(wèi)生計生委.涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究理論審查辦法，2016[2]科技教育司-國衛(wèi)科教.涉及人的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法，2023[3]GB/T37864-2019生物樣本庫質(zhì)量和能力通用要求[4]GB/T42466-2023生物樣本庫多能干細(xì)胞管理技術(shù)規(guī)范[5]T/CSCB0001-2020干細(xì)胞通用要求[6]T/CSCB0005-2022人腸道類器官[7]T/CSCB0006-2022人腸癌類器官[8]T/CSCB0009-2022人干細(xì)胞研究倫理審查技術(shù)規(guī)范[9]中國臨床腫瘤學(xué)會指南工作委員會.中國臨床腫瘤學(xué)會(CSCO)胃癌診療指南2023[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2023.[10]中國抗癌協(xié)會腫瘤多學(xué)科診療專業(yè)委員會,中國抗癌協(xié)會腫瘤內(nèi)分泌專業(yè)委員會.腫瘤類器官診治平臺的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中國專家共識（2022年版）[J].中國癌癥雜志,2022,32(07):657-668.[11]類器官藥物敏感性檢測指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)治療臨床應(yīng)用專家共識(2022年版)[J].中國癌癥防治雜志,2022,14(03):234-239.[12]中華人民共和國藥典（2020年版）[13]CancerGenomeAtlasResearch,N.(2014).Comprehensivemolecularcharacterizationofgastricadenocarcinoma.Nature513,202-209.[14]Yan,H.H.N.,etal.(2018).AComprehensiveHumanGastricCancerOrganoidBiobankCapturesTumorSubtypeHeterogeneityandEnablesTherapeuticScreening.CellStemCell23,882-897e811.[15]LinH,WangY,ChengC,QianY,HaoJ,ZhangZ,ShengW,SongL,DengCX,ZhaoB,CaoJ,WangL,WangL,LiangL,ChenWK,YuC,SunZ,YangY,WangC,ZhangY,LiQ,LiK,MaA#,ZhaoT#,ChenYG#,HuaG#.2023Standard:Humanintestinalcancerorganoids.CellRegeneration,12(1):24.doi:10.1186/s13619-023-00167-6.PMID:37378693(Editorial).[16]WangY,LinH,ZhaoL,HongF,HaoJ,ZhangZ,ShengW,S