DB32T 4972.11-2024 傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范 第11部分：細(xì)菌類應(yīng)急檢測技術(shù)

ICS13.100CCSC50江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T4972.11—2024傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處技術(shù)規(guī)范 第11部分細(xì)菌類應(yīng)急檢測技術(shù)Technicalspecificationforemergencyresponseofpublichealthemergenteventcausedbyinfectionsdisease—Part11Emergencydetectionmethodsofpathogenicbacterium2024-12-27發(fā)布 2025-01-27實(shí)施江蘇省市場監(jiān)督管理局 發(fā) 布中國標(biāo)準(zhǔn)出版社 出 版DB32/T4972.11—2024目 次前言 Ⅲ引言 Ⅳ范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1實(shí)驗(yàn)室生物安全要求 1準(zhǔn)備工作和質(zhì)量控制 2常用顯微鏡檢查技術(shù) 2分離培養(yǎng) 2分子生物學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù) 3免疫學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù) 5參考文獻(xiàn) 6ⅠDB32/T4972.11—2024前 言本文件按照GB/T1.1—202標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)的規(guī)定起草。本文件是DB32/T497《傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范》的第11部分。DB32/T4972已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：監(jiān)測預(yù)警；——第2部分：事件報(bào)告和管理；——第3部分：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；——第4部分：現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查；——第5部分：恢復(fù)評(píng)估；——第6部分：應(yīng)急消毒處置及應(yīng)急人員個(gè)人防護(hù)；——第7部分：媒介生物應(yīng)急監(jiān)測、評(píng)估與控制；——第8部分：標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸；——第9部分：應(yīng)急檢測流程；——第10部分：病毒類應(yīng)急檢測技術(shù)；——第11部分：細(xì)菌類應(yīng)急檢測技術(shù)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會(huì)提出并組織實(shí)施。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所、無錫市疾病預(yù)防控制中心。ⅢDB32/T4972.11—2024引 言傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件是江蘇省公共衛(wèi)生安全的主要威脅，對(duì)社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和人群健康存在巨大影響。本文件為貫徹落實(shí)《中華人民共和國傳染病防治法生事件應(yīng)急條例》等法律法規(guī)對(duì)傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處置要求，提升江蘇省傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處置能力，保障人民群眾的生命安全和社會(huì)穩(wěn)定的目標(biāo)而制定。DB32/T497《傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范》由以下11個(gè)部分構(gòu)成：——第1部分：監(jiān)測預(yù)警；——第2部分：事件報(bào)告和管理；——第3部分：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；——第4部分：現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查；——第5部分：恢復(fù)評(píng)估；——第6部分：應(yīng)急消毒處置及應(yīng)急人員個(gè)人防護(hù)；——第7部分：媒介生物應(yīng)急監(jiān)測、評(píng)估與控制；——第8部分：標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸；——第9部分：應(yīng)急檢測流程；——第10部分：病毒類傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測技術(shù)；——第11部分：細(xì)菌類傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測技術(shù)。DB32/T4972的制定是對(duì)傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件處置工作相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的有力補(bǔ)充，為開展傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的監(jiān)測預(yù)警消毒處置和個(gè)人防護(hù)、媒介生物的應(yīng)急監(jiān)測評(píng)估與控制、標(biāo)本的采集和檢測等應(yīng)急處置工作提供有力的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐，對(duì)保障公眾健康和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。ⅣDB32/T4972.11—2024傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處技術(shù)規(guī)范 第11部分細(xì)菌類應(yīng)急檢測技術(shù)范圍本文件規(guī)定了細(xì)菌類應(yīng)急檢測的實(shí)驗(yàn)室生物安全要求、準(zhǔn)備工作和質(zhì)量控制、常用顯微鏡檢查技術(shù)、分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)和免疫學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)等。本文件適用于傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置中細(xì)菌類傳染病病原體的應(yīng)急檢測。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文包括所有的修改單適用于本文件。GB19489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求WS233 病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則WS288 肺結(jié)核診斷術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。致病菌 pathogenicbacterium能引起人類疾病的細(xì)菌，統(tǒng)稱為致病菌或病原菌。高通量測序 high?throughputsequencing可在較短時(shí)間內(nèi)確定目標(biāo)區(qū)域中核苷酸的順序，用于細(xì)菌全基組或病原宏基因測的大規(guī)模并行測序技術(shù)?！跋乱淮?Next?generationsequencing。實(shí)驗(yàn)室生物安全要求實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)根據(jù)GB19489和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的要求，配備不同類型傳染病感染的個(gè)人防護(hù)裝備，包括但4h更換一次。在發(fā)生意外暴露時(shí)，根據(jù)應(yīng)急處置預(yù)案采取必要措施。實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)場所、感染性標(biāo)本處置及消毒滅菌等應(yīng)符合WS233中的實(shí)驗(yàn)室生物安全管理要求。醫(yī)療廢物處置應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》規(guī)定執(zhí)行。1DB32/T4972.11—2024準(zhǔn)備工作和質(zhì)量控制準(zhǔn)備工作根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇相應(yīng)的生物安全柜、移液器、漩渦震蕩儀、離心機(jī)等儀器和檢測試劑耗材。質(zhì)量控制每一批次反應(yīng)過程中應(yīng)至少設(shè)置一個(gè)陰性和陽性對(duì)照，必要時(shí)增加空白對(duì)照。常用顯微鏡檢查技術(shù)生理鹽水濕片鏡下檢測在玻片上滴加適量生理鹽水用暗視野顯微鏡觀察等。革蘭氏染色顯微鏡檢查直接在玻片上涂抹標(biāo)本，涂片應(yīng)薄且均勻。自然干燥或恒溫干燥器上干燥后，經(jīng)甲醇固定或火焰快速固定3革蘭染色脫色時(shí)間因選用不同的脫色劑而異。使用革蘭氏染色儀染色，應(yīng)按照廠家操作說明書進(jìn)行?？顾崛旧@微鏡檢查抗酸染色鏡檢操作流程應(yīng)按照WS288執(zhí)行。熒光染色顯微鏡檢查熒光染色顯微鏡檢查步驟如下：“O染色劑蓋滿玻片，染色30min，流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水；3min或至無色，流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑；復(fù)染：加復(fù)染劑復(fù)染1min鏡檢：玻片涂膜面向上置于熒光或LED顯微鏡載物臺(tái)，并以卡尺固定后，以低倍鏡搜索發(fā)現(xiàn)疑為致病菌的熒光物質(zhì)，使用40其他特殊染色顯微鏡檢查法進(jìn)行顯微鏡檢查。包括且不限于細(xì)胞壁染色分離培養(yǎng)無菌部位標(biāo)本一般應(yīng)在患者使用抗生素之前采集無菌部位標(biāo)本如血液標(biāo)本直接接種血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，陽性血培養(yǎng)2DB32/T4972.11—2024物進(jìn)行固體培養(yǎng)基分離純化，并進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步鑒定，對(duì)血培養(yǎng)陰性的標(biāo)本盲傳一代。非無菌部位標(biāo)本非無菌部位標(biāo)本，通過直接培養(yǎng)或選擇性增菌培養(yǎng)的方式，針對(duì)不同細(xì)菌采用不同培養(yǎng)基和分離程序，得到細(xì)菌純培養(yǎng)物。分子生物學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)核酸提取試劑盒法提取核酸根據(jù)標(biāo)本類型選擇相應(yīng)商品化離心柱法或磁珠法基因組核酸提取試劑盒。選擇非人源性內(nèi)參時(shí)提取標(biāo)本中宜加入相應(yīng)的內(nèi)參模板。常溫一步法提取核酸根據(jù)標(biāo)本類型選擇相應(yīng)商品化的裂解試劑，將試劑加入標(biāo)本中，常溫裂解。煮沸法提取核酸標(biāo)本離心、重懸后使用煮沸法進(jìn)行簡易模板制備：12μL~5擴(kuò)大培養(yǎng)物放入裝有500μL純水或TE1.5mL100℃加熱10min；12000r/min10min；吸取上清即為PCR模板。選擇非人源性內(nèi)參時(shí)，在待提取標(biāo)本中宜加入相應(yīng)的內(nèi)參模板。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)體系配制后置于指定溫度下℃~65℃步驟即可完成。具體參照相應(yīng)細(xì)菌核酸檢測試劑盒說明書。濁度檢測：肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)出現(xiàn)白色渾濁判定為陽性，未渾濁判為陰性；實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)反應(yīng)體系配制（PCR及反應(yīng)程序設(shè)置反應(yīng)溫度、循環(huán)數(shù)及熒光通應(yīng)參照相應(yīng)細(xì)菌核酸檢測試劑盒說明書。結(jié)果成立時(shí)，進(jìn)行結(jié)果判斷：陰性顯示無CtS形擴(kuò)增曲線；陽性顯示Ct值小于或等于細(xì)菌核酸檢測試劑盒說明書規(guī)定值，且有S形擴(kuò)增曲線。數(shù)字PCR技術(shù)根據(jù)PCR儀器和試劑的要求制備反應(yīng)體系，將體系分配到微小分區(qū)或微滴中并封蓋，進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用熒光染料或探針監(jiān)測目標(biāo)核酸的擴(kuò)增，配套軟件統(tǒng)計(jì)分析各反應(yīng)中的陽性液滴數(shù)。如有3DB32/T4972.11—2024標(biāo)本中每個(gè)熒光通道的濃度、精度、誤差，依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判讀。微流體芯片檢測技術(shù)參照相應(yīng)的多病原檢測試劑盒微流體芯片法說明書。如有結(jié)果成立時(shí)，進(jìn)行結(jié)果判斷，查看各標(biāo)本擴(kuò)增曲線的形態(tài)及對(duì)應(yīng)的Ct值，對(duì)照試劑盒說明書規(guī)定值進(jìn)行判讀。確定各個(gè)病原體靶點(diǎn)陽性擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的標(biāo)本編號(hào)，報(bào)告該標(biāo)本為對(duì)應(yīng)病原體檢測項(xiàng)目陽性。高通量宏基因組測序測序時(shí)機(jī)傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測中，出現(xiàn)且不限于多病原核酸檢測陰性、分離培養(yǎng)陰性、免疫學(xué)檢測陰性等情況時(shí)，宜使用宏基因組測序。實(shí)驗(yàn)過程對(duì)符合要求的核酸進(jìn)行文庫構(gòu)建、上機(jī)測序、數(shù)據(jù)分析等。具體反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照相應(yīng)測序平臺(tái)及試劑盒說明書，根據(jù)應(yīng)急檢測實(shí)際選擇是否執(zhí)行去宿主操作。數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)質(zhì)量控制數(shù)據(jù)質(zhì)量控制要求如下：標(biāo)本經(jīng)過高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)，應(yīng)該在去除接頭、低質(zhì)量數(shù)據(jù)和宿主基因組序列后再進(jìn)行下一步分析；測序完成后對(duì)Q20和Q30進(jìn)行統(tǒng)計(jì)標(biāo)本測序的堿基質(zhì)量應(yīng)同時(shí)符合Q20≥90 Q3085 ；每個(gè)標(biāo)本的高質(zhì)量序列數(shù)目應(yīng)大于2×107條，對(duì)于宿主含量較多而又未在核酸提取步驟進(jìn)行去宿主操作的標(biāo)本4107~8107條。注：測序數(shù)據(jù)中，堿基識(shí)別質(zhì)量值為20的堿基識(shí)別準(zhǔn)確率為991。注2：測序數(shù)據(jù)中，堿基識(shí)別質(zhì)量值為30的堿基識(shí)別準(zhǔn)確率為99.9，或錯(cuò)誤率為0.1。物種注釋數(shù)據(jù)質(zhì)控后對(duì)標(biāo)本數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋，宜選用得到廣泛認(rèn)可的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，包括但不限于FoodandDrugAdministrationdAtabaseforReferenceGrademicrObialSequenceFDA?ARGOWorldDataCentreforMicroorganismWDCGenomeTaxonomyDataBasGTD等。除特殊方法外，對(duì)于已知物種，數(shù)據(jù)庫中序列相似度95以上，覆蓋度90以上。微生物豐度計(jì)算數(shù)據(jù)質(zhì)控后進(jìn)行物種相對(duì)豐度計(jì)算，并記錄計(jì)算方法或軟件。除特殊方法外，應(yīng)將高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)比對(duì)到組裝好的參考基因集或合適的數(shù)據(jù)庫上，按相似度95以上，覆蓋度90以上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到基因水平上的相對(duì)豐度分布情況，再將注釋到同一物種和同一屬的分類水平的基因序列相對(duì)豐度進(jìn)行疊加，得到種水平和屬水平的相對(duì)豐度結(jié)果。4DB32/T4972.11—2024結(jié)果判定結(jié)果判定規(guī)則如下。結(jié)合《人間傳染的病原微生物目錄》或其他相關(guān)的病原微生物目錄篩選出物種注釋中的致病菌和條件致病菌的信息，針對(duì)不同標(biāo)本類型并結(jié)合檢出病原微生物的種類進(jìn)行解讀，確認(rèn)致病微與正常有菌部位。正常有菌部位應(yīng)綜合分析檢出細(xì)菌是否為導(dǎo)致感染的致病病原。對(duì)于條件致病菌，應(yīng)綜合考慮臨床表現(xiàn)和物種豐度等信息謹(jǐn)慎進(jìn)行判斷。對(duì)于致病菌，當(dāng)種特異性序列數(shù)較低時(shí)小于3條一般不考慮為致病病原，但檢出菌為敏感度較低的菌株，如結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，布魯氏菌，諾卡菌等以及烈性傳染病的時(shí)候（包括鼠疫，炭疽等），應(yīng)結(jié)合臨床癥狀考慮感染可能，并使用分離培養(yǎng)、涂片染色或抗體檢測等手段予以確認(rèn)或排除。如果疑似暴發(fā)疫情標(biāo)本大部分都報(bào)告相應(yīng)序列且能夠排除標(biāo)本之間或環(huán)境污染時(shí)即可認(rèn)定其為此次疫情的致病菌。對(duì)于無菌部位檢出病原菌時(shí)免疫學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)膠體金檢測技術(shù)檢測標(biāo)本的類型、上樣體積及操作步驟參照相應(yīng)的試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)完成后按照試劑盒要求的時(shí)間觀察結(jié)果，當(dāng)檢測線和質(zhì)控線均為陽性結(jié)果時(shí)，判定對(duì)應(yīng)的檢酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）參照說明依次加入抗原包被如需要應(yīng)細(xì)菌ELISA檢測試劑盒說明書。以空白對(duì)照調(diào)零，讀取酶標(biāo)儀器上各孔450nmnm等波長的OD值，參照說明書要求設(shè)置參比波長并計(jì)算陽性值化學(xué)發(fā)光技術(shù)參照說明依次加入磁性顆?？乖幻复呋孜镆喊l(fā)光，具體流程參照相應(yīng)細(xì)菌化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒說明書。根據(jù)化學(xué)發(fā)光試劑盒的生物參考區(qū)間判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每一批次化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)做質(zhì)控品，質(zhì)控品結(jié)果成立時(shí)，進(jìn)行結(jié)果判定。凝集試驗(yàn)或抗體結(jié)合產(chǎn)生肉眼可見凝集反應(yīng)。按照試劑盒要求的時(shí)間觀察結(jié)果，出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)判為陽。注：布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗體滴度為100++及以上，或者患者病程持續(xù)一