(高清版)DB32∕T 4395-2022 小麥土傳病毒病病原檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

小麥土傳病毒病病原檢測(cè)技術(shù)規(guī)程Codeofpracticefordetectionofpathogenofsoil-bornewheatviral發(fā)布I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省作物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、寧波大學(xué)、江蘇省植物保護(hù)植物檢疫站。1CWMV:中國(guó)小麥花葉病毒(ChineseWheatMosaicVirus)Dot-ELISA:斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(DotEnzyme-linkedImmunosorbentAssay)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay)間接ELISA:間接酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(IndirectEnzyme-IinkedImmunosorbentAssay)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)RT-PCR:逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(ReverseTranscription-WYMV:小麥黃花葉病毒(WheatYellowMosaicVirus)4原理4.1間接ELISA原理可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)。顏色反應(yīng)的深淺與受檢樣品中抗原的量呈正比，24.3RT-PCR原理將逆轉(zhuǎn)錄(RT)和聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。逆轉(zhuǎn)錄是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板合成與之互補(bǔ)的DNA(complementaryDNA,cDNA)的過(guò)程，再利用特異性引物以cDNA為模板在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，依據(jù)是否能擴(kuò)增出目的片段大小的PCR產(chǎn)物進(jìn)田間采集疑似小麥黃花葉病和中國(guó)小麥花葉病產(chǎn)物長(zhǎng)度為182bp的小麥樣品則認(rèn)定為感染CWMY的陽(yáng)性樣品；則認(rèn)定為陰性樣品，陽(yáng)性樣品和陰性樣品存放于-80℃低溫冰箱；間接酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定和斑點(diǎn)酶6間接ELISA6.1取樣待檢測(cè)樣品按1:10(克：毫升)加入包被緩沖液，用研缽研磨成漿，8000r/min離心3min,上清3100μL,加蓋，37℃孵育1h或4℃冰箱孵育過(guò)夜，每個(gè)樣品重復(fù)3次。孵育結(jié)束后，用聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PBST)清洗酶標(biāo)板3次~5次。每孔每次加PBST洗液6.5加抗血清用相應(yīng)病毒抗血清和抗體稀釋緩沖液按照1:2000的比例稀釋，每孔加入稀釋好的抗體液同6.4。的OD?值<0.15,陰性對(duì)照孔的OD?05值<0.15,當(dāng)陰性對(duì)照孔的OD4?5值<0.05時(shí)，按0.05計(jì)算。陽(yáng)6.12.2在滿足了6.12.1質(zhì)量控制要求后，可根據(jù)如下數(shù)據(jù)判斷結(jié)果：樣品OD4o?值/陰性對(duì)照OD405值>2,判為陽(yáng)性；樣品OD4o?值/陰性對(duì)照OD?<2,判為陰性；樣品OD?05值陰性對(duì)照OD45值在47.1取樣待測(cè)樣品和對(duì)照樣品按1:10(克：毫升)加入硫化鉛(PBS)磷酸鹽緩沖液，用研缽研磨成漿，8000r/min離心3min,上清液即為制備好的檢測(cè)樣品。對(duì)照樣品做相同處理。預(yù)先用鉛筆將硝酸纖維素膜劃成7mm×7mm大小的正方格，分別取2μL7.2中制備好的待檢測(cè)用相應(yīng)病毒抗血清和抗體稀釋緩沖液按照1:2000的比例稀釋，并將硝酸纖維素膜浸入其中，室將平皿中抗體液倒出，加入PBST20mL洗膜3次～4次，每次3min。7.8顯色顯色底物氯化硝基四氮唑蘭(NBT)66μL和BCIP33μL加到10mL底物緩沖液中混勻，洗好的7.9結(jié)果8.1植物總RNA提取MiniKit)的操作步驟提取病葉RNA,然后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定所提RNA的濃度和純度。5參照FirstStrandcDNA加入RNaseFreeH?O至液體總體積為12μL,混勻后于PCR儀中，65℃反應(yīng)5min后迅速冰浴RT反應(yīng)液的配制：向變性后的RNA中加入5×M-MuLVbuffer4μL,10mol/LdNTP2μL,RNaseInhibitor(40U/μL)1μL,M-M于-20℃?zhèn)溆没蜻M(jìn)行后續(xù)PCR。termix10μL,上游引物0.5μL,下游引物0.5μL,cDNA1μL,ddH?O8μL,于PCR儀中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95℃3min;95℃15s,58℃15s,72℃30s(30個(gè)循環(huán));72℃,6(規(guī)范性)間接ELISA試劑氯化鈉(NaCl)8.0g,磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.2g,磷酸氫二鈉(Na?HPO?)1.15g,氯化鉀(KCD0.2g,0.5mLTween-20,溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4,蒸餾水定容PVP(MW24～4000)2g,脫脂奶粉1g,溶解于100mLPBST中。A.4抗血清病毒特異性抗體，抗體效價(jià)：1:2000,-20℃保存。堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，抗體效價(jià)：1:2000,-20℃保存。二乙醇胺9.7mL,氯化鎂(MgCl?)0.01g,溶解于80mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至9.8,用蒸餾A.7底物溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)1mgPNPP(對(duì)-硝基苯磷酸鈉)溶于1mL底物緩沖液中。7(規(guī)范性)Dot-ELISA試劑氯化鈉(NaCD8.0g,磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.2g,磷酸氫二鈉(Na?HPO?)1.15g,氯化鉀(KCD)氯化鈉(NaCD)8.0g,磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.2g,磷酸氫二鈉(Na?HPO?)1.15g,氯化鉀(KCD)0.2g,0.5mLTween-20,溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4,蒸餾水定容至1000mL。B.3封閉液取脫脂奶粉5g加入到100mLPBST,充分溶B.4抗血清病毒特異性抗體，抗體效價(jià)：1:2000,-20℃保存。堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，抗體效價(jià)：1:2000,-20℃保存。鈉調(diào)節(jié)pH至9.5,