DB32-T 4395-2022 小麥土傳病毒病病原檢測技術(shù)規(guī)程

江蘇省地方標準DB32/T4395—2022小麥土傳病毒病病原檢測技術(shù)規(guī)程Codeofpracticefordetectionofpathogenofsoil-bornewheatviraldiseases江蘇省市場監(jiān)督管理局ⅠDB32/T4395—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省作物標準化技術(shù)委員會提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、寧波大學(xué)、江蘇省植物保護植物檢疫站。1DB32/T4395—2022小麥土傳病毒病病原檢測技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了小麥黃花葉病毒和中國小麥花葉病毒檢測原理、設(shè)備和試劑、間接酶聯(lián)免疫吸附劑測定、斑點酶聯(lián)免疫吸附劑測定及RT-PCR測定方法。本文件適用于小麥黃花葉病毒和中國小麥花葉病毒的檢測。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2.1小麥黃花葉病wheatyellowmosaicdisease小麥的一種土傳病毒病，自然界中由禾谷多黏菌（polymy∞agraminis）在土壤中傳播，病原為小麥黃花葉病毒(wheatyellowmosaicvirus)。2.2中國小麥花葉病chinesewheatmosaicdisease小麥的一種土傳病毒病，自然界中由禾谷多黏菌（polymy∞agraminis）在土壤中傳播，病原為中國小麥花葉病毒(chinesewheatmosaicvirus)。3縮略語CWMV：中國小麥花葉病毒(ChineseWheatMosaicVirus)Dot-ELISA：斑點酶聯(lián)免疫吸附劑測定(DotEnzyme-linkedImmunosorbentAssay)ELISA：酶聯(lián)免疫吸附劑測定(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay)間接ELISA：間接酶聯(lián)免疫吸附劑測定(IndirectEnzyme-IinkedImmunosorbentAssay)PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式擴增反應(yīng)(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)WYMV：小麥黃花葉病毒(WheatYellowMosaicVirus)4.1間接ELISA原理將酶分子與抗體共價結(jié)合，得到同時具有免疫活性和酶的生物活性的酶標抗體。檢測時，將已知的抗體吸附在固相載體表面，若受檢樣本中含有相應(yīng)的抗原，則會與固相載體上的抗體發(fā)生特異性結(jié)合從而隨之固定在固相載體上，然后洗滌除去未結(jié)合及多余的其他蛋白，再加入酶標抗體，使其與吸附在固相載體上的抗原特異性結(jié)合，最后加入酶反應(yīng)底物，底物被酶催化出現(xiàn)顏色反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)。顏色反應(yīng)的深淺與受檢樣品中抗原的量呈正比，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。2DB32/T4395—2022間接ELISA,首先將受檢樣品包被固相載體，經(jīng)洗滌，加入特定的抗體，若受檢樣品中含有相應(yīng)的抗原，則會形成待測抗原-抗體復(fù)合物，再經(jīng)洗滌后，加入酶標抗體，以形成抗原-抗體-酶標抗體復(fù)合物，然后加入酶反應(yīng)的底物，通過測定顏色反應(yīng)的深淺，定性或定量分析受檢樣品中的抗原量。4.2Dot-ELISA原理硝酸纖維素膜具有很強的靜電吸附力，在中性條件下可有效地吸附蛋白質(zhì)等生物大分子，并保持其免疫活性。將抗原吸附在硝酸纖維素膜表面，利用膜作為固相載體進行抗原抗體反應(yīng)，通過與相應(yīng)的抗體和酶標抗抗體的一系列免疫反應(yīng)，形成抗原-抗體-酶標抗抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被催化出現(xiàn)顏色反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)并沉著于抗原抗體復(fù)合物吸附的部位，呈現(xiàn)出肉眼可見的斑點，可通過肉眼觀察斑點的出現(xiàn)與否和顏色深淺程度判定受檢樣品中是否存在特定抗原及其濃度。4.3RT-PCR原理將逆轉(zhuǎn)錄(RT)和聚合酶鏈式擴增反應(yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。逆轉(zhuǎn)錄是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板合成與之互補的DNA(complementaryDNA,cDNA)的過程，再利用特異性引物以cDNA為模板在DNA聚合酶的作用下進行PCR擴增，依據(jù)是否能擴增出目的片段大小的PCR產(chǎn)物進行結(jié)果判定。5設(shè)備和試劑間接ELISA的檢測試劑，按照附錄A。Dot-ELISA的檢測試劑，按照附錄B。RT-PCR的檢測試劑，按照附錄C。除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純或生化試劑。田間采集疑似小麥黃花葉病和中國小麥花葉病的小麥病株，采用附錄C中的特異性引物進行RT-PCR檢測，得到的擴增產(chǎn)物長度為124bp的小麥樣品則認定為感染W(wǎng)YMV的陽性樣品，得到的擴增產(chǎn)物長度為182bp的小麥樣品則認定為感染CWMY的陽性樣品；沒有出現(xiàn)目的產(chǎn)物的小麥植株葉片則認定為陰性樣品，陽性樣品和陰性樣品存放于-80℃低溫冰箱；間接酶聯(lián)免疫吸附劑測定和斑點酶聯(lián)免疫吸附劑測定中，樣品提取緩沖液作空白對照，RT-PCR檢測方法中無菌水作為空白對照。6間接ELISA田間剪取待測樣品葉片，錫箔紙包裹后放入0℃冰盒中。待檢測樣品按1∶10（克∶毫升）加入包被緩沖液，用研缽研磨成漿，800液即為制備好的檢測樣品。對照樣品做相同處理。3DB32/T4395—2022在96孔酶標板上加入6.2制備好的待檢測樣品、陰性對照、陽性對照及樣品提取緩沖液，每孔加樣孵育結(jié)束后，用聚對苯二甲酸乙二醇酯(PBST)清洗酶標板3次~5次。每孔每次加PBST洗液用相應(yīng)病毒抗血清和抗體稀釋緩沖液按照1∶2000的比例稀釋，每孔加入稀釋好的抗體液6.7加酶標抗體用抗體稀釋緩沖液按說明將酶標抗體稀釋至工作濃度，并加入到酶聯(lián)板中，100μL/孔，加蓋，37℃6.9加底物緩沖液將現(xiàn)配的底物緩沖液按100μL/孔，加入到酶聯(lián)板中，室溫避光孵育15min~30min。用酶標儀在405nm波長下測定各孔的吸光值(OD405)。6.12.1首先讀取對照孔的OD405值（緩沖液、陰性對照、陽性對照應(yīng)該在質(zhì)量控制范圍內(nèi)。緩沖液孔性對照有明顯的顏色反應(yīng)，且陽性對照OD405值／陰性對照OD405值＞2,孔的重復(fù)性基本一致。6.12.2在滿足了6.12.1質(zhì)量控制要求后，可根據(jù)如下數(shù)據(jù)判斷結(jié)果：樣品OD405值／陰性對照OD405值＞2,判為陽性；樣品OD405值／陰性對照OD405<2,判為陰性；樣品OD405值陰性對照OD405值在1.5~2.0,判為可疑樣品，需重新檢測一次，或用其他方法驗證。4DB32/T4395—20227Dot-ELISA田間剪取待測樣品葉片，錫箔紙包裹后放入0℃冰盒中。待測樣品和對照樣品按1∶10（克∶毫升）加入硫化鉛(PBS)磷酸鹽緩沖液，用研缽研磨成漿，8000r/min離心3min,上清液即為制備好的檢測樣品。對照樣品做相同處理。預(yù)先用鉛筆將硝酸纖維素膜劃成7mm×7mm大小的正方格，分別取2μL7.2中制備好的待檢測樣品、陰性對照、陽性對照、空白對照的上清液點于膜上正方格中，室溫干燥10min。重復(fù)3次。在平皿中加入20mL封閉液，并將干燥好的硝酸纖維素膜浸入，室溫下封閉30min。用相應(yīng)病毒抗血清和抗體稀釋緩沖液按照1∶2000的比例稀釋，并將硝酸纖維素膜浸入其中，室將平皿中抗體液倒出，加入PBST20mL洗膜3次~4次，每次3min。7.7加酶標抗體將硝酸纖維素膜浸入稀釋至工作濃度的酶標抗體溶液中，室溫孵育30min~60min。顯色底物氯化硝基四氮唑蘭(NBT)66μL和BCIP33μL加到10mL底物緩沖液中混勻，洗好的膜放入底物顯色液中反應(yīng)，顯色5min~20min,在蒸餾水中漂洗終止反應(yīng)，肉眼觀察并記錄結(jié)果。顯色后，首先觀察對照的顏色反應(yīng)，陽性對照應(yīng)顯棕紅色或深褐色，陰性對照及空白對照應(yīng)不顯色，若出現(xiàn)陽性對照不顯色或陰性對照顯棕紅色或深褐色，則應(yīng)分析原因，并重新進行試驗。對照結(jié)果正確的情況下，再觀察樣品的顏色反應(yīng)，如檢測樣品出現(xiàn)棕紅色或深褐色圓形斑點者，判為陽性；如檢測樣品與陰性對照相同，不出現(xiàn)可見斑點，判為陰性；介于兩者之間判為可疑樣品，需重新檢測一次，或用其他方法驗證。8RT-PCR8.1植物總RNA提取每株小麥樣品取0.2g病葉剪碎，置于液氮中研磨，參照植物總RNA提試劑盒(HiPurePlantRNAMiniKit)的操作步驟提取病葉RNA,然后在紫外分光光度計上測定所提RNA的濃度和純度。5DB32/T4395—2022參照FirstStrandcDNASynthesisKit說明書的操作步驟對植物材料總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作步驟如下：RNA的熱變性：向無RNase的PCR管中，依次加入植物總RNA1μg,RandomPrimer1μL,最后加入RNaseFreeH2O至液體總體積為12μL,混勻后于PCR儀中，65℃反應(yīng)5min后迅速冰浴RT反應(yīng)液的配制：向變性后的RNA中加入5×M-MuLVbuffer4μL,10mol/LdNTP2μL,RNaseInhibitor(40U/μL)1μL,M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)1μL,用移液槍輕輕吸打混勻后，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。于-20℃?zhèn)溆没蜻M行后續(xù)PCR。8.3PCR以8.2獲得的cDNA作為模板，利用相應(yīng)引物進行PCR鑒定。20μLPCR反應(yīng)體系：2×TaqMas-8.4瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。預(yù)期的PCR擴增在陽性對照在預(yù)期位置產(chǎn)生明顯條帶，陰性對照和空白對照在預(yù)期位置未產(chǎn)生條帶的前提下：a)如果檢測樣品出現(xiàn)與陽性對照大小一致的條帶，則為陽性；b)如果檢測樣品沒有出現(xiàn)與陽性對照大小一致的條帶，則為陰性。6DB32/T4395—2022附錄A（規(guī)范性）間接ELISA試劑碳酸鈉(Na2CO3)1.59g,碳酸氫鈉(NaHCO3)2.93g,溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至A.2PBST緩沖液（PH7.4)A.3抗體緩沖液PVP(MW24~4000)2g,脫脂奶粉1g,溶解于100mLPBST中。A.4抗血清A.5酶標抗體堿性磷酸酶標記抗體，抗體效價：1∶2000,-20A.6底物稀釋緩沖液（PH9.8)二乙醇胺9.7mL,氯化鎂(MgCl2)0.01g,溶解于80mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至9.8,用蒸餾水定容至100mL。A.7底物溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）1mgPNPP（對-硝基苯磷酸鈉）溶于1mL底物緩沖液中。7DB32/T4395—2022附錄B（規(guī)范性）Dot-ELISA試劑B.1PBS磷酸鹽緩沖液（PH7.2)氯化鈉(NaCl)8.0g,磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2g,磷酸氫二鈉(Na2HPO4)1.15g,氯化鉀(KCl)0.2g,溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸(HCl)調(diào)節(jié)pH至7.2,蒸餾水定容至1000mL。B.2PBST緩沖液（PH7.4)氯化鈉(NaCl)8.0g,磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2g,磷