7-3第七章食品微生物檢驗-大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌計數(shù)

三、大腸菌群計數(shù)（一）大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌1、大腸菌群在一定培養(yǎng)條件下(一般是37℃24小時)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。（GB4789.3—2010）大腸菌群不是細菌學上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學方面的要求，提出的與糞便污染有關(guān)的細菌，即作為食品、水體等是否受過人畜糞便污染的指示菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。根據(jù)進一步的生化試驗，可將這群細菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、枸櫞酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。2025/1/2422、糞大腸菌群根據(jù)生長溫度的差異，將能在37

C生長的稱為總大腸菌群，而在44.5

C仍能生長的大腸菌群稱為耐熱大腸菌群(thermo-tolerantcoliformgroup)或糞大腸菌群（faecal

coliform

Fc），在人和動物糞便中所占的比例較大，而且在自然界容易死亡。因此，糞大腸菌群對糞便污染的指示作用更為直接和貼切，主要就是大腸艾希氏菌，但也包括克雷伯氏菌屬，正是由于包括了克雷伯氏菌屬，使其與糞便污染的相關(guān)性受到了影響。3、大腸埃希氏菌（也稱大腸桿菌）分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。大腸艾希氏菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗）為++--或-+--的細菌。與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。產(chǎn)氣克雷白氏菌ETEC

EIEC

陰溝腸桿菌EHEC

大腸菌群耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）大腸桿菌產(chǎn)氣克雷白氏菌大腸埃希氏菌檸檬酸桿菌O157：H7大腸桿菌是人和溫血動物腸道內(nèi)普遍存在的細菌，是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病，但它侵入人體一些部位時，可引起感染。大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛(wèi)生細菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。一般認為可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。

總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24小時能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。耐熱大腸菌群即糞大腸菌群，作為一種衛(wèi)生指標菌，耐熱大腸菌群中很可能含有糞源微生物，因此耐熱大腸菌群的存在表明可能受到了糞便污染，可能存在大腸桿菌。但是，耐熱大腸菌群的存在并不代表對人有什么直接的危害。致病性大腸桿菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細胞，具有痢疾桿菌樣致病力。腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸毒素性大腸桿菌（ETEC）和腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）等。O157:H7（EHEC)腸出血性大腸桿菌，感染性腹瀉是近年來新發(fā)現(xiàn)的危害嚴重的腸道傳染病，已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。4.大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的從屬關(guān)系5.大腸艾希氏菌的生物學特性（1）基本形態(tài)：此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。（2）培養(yǎng)特性：A.大腸艾希氏菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46℃。B.在普通營養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)：

1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；

2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝；

3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。C.大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征：大腸桿菌呈黑色中心,有或無金屬光澤.6.大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸桿菌的衛(wèi)生學意義1)大腸菌群和大腸艾希氏菌是評價衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標，作為食品中的糞便污染指標。第一，它可作為糞便污染食品的指示菌，第二，它可以作為腸道致病菌污染食品的指示菌。當食品中檢出的大腸菌群數(shù)量多，腸道致病菌存在的可能性就愈大。2)大腸菌群中包含的菌種可以在人、畜糞便中檢出，而其檢測方法簡單，計數(shù)容易，菌群中包括的菌種類多，檢出幾率高，但有少數(shù)菌種可在營養(yǎng)豐富的水體、土壤、腐敗的植物等外環(huán)境中檢出，即在非糞便污染的情況下，也有檢出符合大腸菌群定義細菌的可能性，故在結(jié)果分析時應當慎重。而耐熱大腸菌群的菌絕大多數(shù)均為埃希菌屬的成員，更能表示樣品被糞便污染的情況。3)大腸艾希氏菌在外界存活時間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國際上公認的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來，有些國家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸艾希氏菌檢測作為微生物污染狀況的監(jiān)測指標和HACCP實施效果的評估指標。

4)大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌這三個指標在實際工作中都在應用，但用途有所不同，一般認為大腸菌群是水源的衛(wèi)生指標和食品加工衛(wèi)生狀況的通用指標，糞大腸菌群主要用于貝類和貝類養(yǎng)殖用水的衛(wèi)生指標，大腸桿菌用于指示食品受到近期糞便污染或不衛(wèi)生加工。作為糞便污染的指示菌，大腸埃希菌檢出的意義最大，其次是耐熱大腸菌群，總大腸菌群的檢出意義略差一些。5)大腸菌群常用表示方法：最可能數(shù)-MPN（most

probable

number）/100mL

。1.大腸菌群計數(shù)方法類型A.MPN計數(shù)法（最可能數(shù)法）

(GB4789.3—2010，GB/T5750.12—2006)最常用的，適合于各類樣品。B.平板計數(shù)法(GB4789.3—2010)大腸菌群數(shù)量較多的樣品可使用C.濾膜法(GB／T5750.12～2006)主要用于生活飲用水、瓶裝水和其他清亮液態(tài)樣品。D.測試片法(紙片法)(GBl4934—94)常用于餐具大腸菌群檢測。（二）大腸菌群計數(shù)2.食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)

（GB4789.3—2010）第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法第二法：大腸菌群平板計數(shù)法3.MPN法原理當欲對樣品中某種細菌進行選擇性計數(shù)時，由于樣品中混有其他細菌，無法采用平板菌落計數(shù)的方法進行計數(shù)，在這種情況下可用MPN法計數(shù)菌數(shù)，特別是對菌數(shù)少的樣品進行選擇性計數(shù)很有用處，因為傾注平板法和表面涂布法計數(shù)的加樣量分別為lml和0.1ml。最常用的MPN法是多管發(fā)酵法對水和食品中的大腸菌群的計數(shù)。該法還可用于計數(shù)糞大腸菌群、產(chǎn)氣莢膜梭菌等。最可能數(shù)(mostprobablenumber，MPN)法是基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法，又稱為多管發(fā)酵法，是采用多次稀釋直至無菌(multipledilutiontoextinction)的方式進行。首先將被檢樣品盡量混合或研磨，使其中的細菌分布均勻，混合的樣品通過系列稀釋和等量分配為小樣品，有些小樣品最后含菌量極少，或不再含有待測的目的細菌；分別接種不同的小樣于相應的培養(yǎng)管，培養(yǎng)后觀察有無目的菌生長，查用概率計算方法制成的MPN檢索表，推算原始樣品中待測細菌的可能數(shù)。大腸菌群MPN法是利用大腸菌群細菌能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特性進行檢測即對未知樣品做連續(xù)的10倍稀釋，選擇3個連續(xù)的10倍稀釋液，每種稀釋液接種3管裝有培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，根據(jù)LST初發(fā)酵試驗以及BGLB發(fā)酵證實實驗，證實大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報告每g（mL）樣品中大腸菌群的最可能數(shù)。食品中大腸菌群數(shù)以每g（mL）樣品中大腸菌群的最可能數(shù)來表示，即為大腸菌群MPN值。4.儀器設備

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、

均質(zhì)器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、菌落計數(shù)器等。

5.需要用到的培養(yǎng)基（1）LST肉湯培養(yǎng)基：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL5.0g，乳糖5.0g，K2HPO42.75g，KH2PO42.75g，月桂基硫酸鈉0.1g，蒸餾水1000mL。制法：將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的20mm×150mm試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。最終pH6.8±0.2。（2）BGLB：煌綠乳糖膽鹽肉湯成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛膽粉溶液200mL，0.1%煌綠水溶液13.3mL，蒸餾水800mL，pH7.2±0.1。制法：略抑菌劑的選擇大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。國家標準中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細菌的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產(chǎn)生一些抑制作用。

10-210-310-4大腸菌群的檢驗程序0將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯LST不產(chǎn)氣（-）

小導管里無氣泡LST產(chǎn)氣（+）

1）樣品的稀釋（1）稱取25g樣品，放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min-10000r/min均質(zhì)1min-2min，或放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min-2min，制成1:10的樣品勻液。（2）樣品勻液的pH值應在6.5-7.5之間，必要時分別用1mol/L氫氧化鈉NaOH或1mol/L鹽酸HCl）調(diào)節(jié)。（3）用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。6.操作步驟1）樣品的稀釋（1）

固體和半固體樣品-稱取25g

樣品，放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min-10000r/min均質(zhì)1min-2min，或放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min-2min，制成1:10

的樣品勻液。

（2）液體樣品以無菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10

的樣品勻液。6.操作步驟（3）樣品勻液的pH值應在6.5-7.5

之間，必要時分別用1mol/L氫氧化鈉（NaOH

）或1mol/L鹽酸（HCI）調(diào)節(jié)。（4）用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10

樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:100

的樣品勻液。

（5）根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min

。2）初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進行復發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進行復發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。LST結(jié)果判斷大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管。3）復發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。接種樣本大腸菌群MPN法測定的操作流程

根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN表，報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。注意：當檢樣的量與表中的量有增加或減少時，表內(nèi)的數(shù)也應相應減少或增加。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應相應降低或增加10倍。

4）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告陽性管數(shù)0.100.010.001LST發(fā)酵管BGLB證實管表B.1大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表5）填寫原始記錄

樣品名稱樣品編號大腸菌群計數(shù)（GB4789.3-2010）初發(fā)酵陽性管數(shù)復發(fā)酵陽性管數(shù)結(jié)果MPN/ml(g)6）MPN檢索表的應用（1）MPN（最可能數(shù)）是表示樣品中活菌密度的估測。因此MPN值只是活菌密度的估算值，并不是樣品中活菌數(shù)的真值。注1：本表采用3個稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每個稀釋度接種3管。注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1g（mL）、0.1g(mL)和0.01g(mL)時，表內(nèi)數(shù)字應相應降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)時，則表內(nèi)數(shù)字應相應增高10倍，其余類推。（2）使用MPN檢索表還應注意這個MPN檢索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北歐等標準通用的；表里的數(shù)字是有小數(shù)點的；報告單位不同?，F(xiàn)報告單位為g/ml，而原報告單位是100g/ml；原標準MPN表有64個組合，而現(xiàn)標準MPN表只有40個組合；當實驗結(jié)果在MPN表中無法查找到MPN值時，如：陽性管數(shù)為122，123，232，233等時，建議增加稀釋度(可做4~5個稀釋度)，使樣品的最高稀釋度能達到獲得陰性終點，然后再遵循相關(guān)的規(guī)則進行查找，最終確定MPN值。7）08和10版大腸菌群MPN計數(shù)較03版的優(yōu)勢有：（1）名稱更改，以大腸菌群計數(shù)代替原來的大腸菌群測定。（2）增加了大腸菌群的平板計數(shù)法和紙片檢測法（10版刪除了）。（3）大腸菌群的MPN法以乳糖為主改為以月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯為主的要培養(yǎng)基的MPN法。（4）大腸菌群的MPN法中原“報告每100ml（或g）大腸菌群的MPN值”改為“報告每1ml（或1g）大腸菌群的MPN值”。（5）08和10版操作更簡單，適合批量檢測；（6）08和10版檢出的概率大乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基基本上不具備修復已損傷的細胞的作用，而月桂基硫酸鹽胰蛋白胨則可以；（7）08和10版減少了人為的誤差

03版需要挑選菌落，受人主觀的影響很大，沒有挑對或挑取的不夠多都會導致假陰性結(jié)果，而08版采取增菌液接種，會減少假陰性。為規(guī)范食品中大腸菌群指標的檢測工作，現(xiàn)公告如下：現(xiàn)行食品標準中規(guī)定的大腸菌群指標以“MPN/100克或MPN/100毫升”為單位的，適用《食品衛(wèi)生微生物學檢驗大腸菌群測定》（GB/T4789.3-2003）進行檢測；以“MPN/克或MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”為單位的，適用《食品衛(wèi)生微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》（GB/T4789.3-2008）進行檢測。特此公告。

二○○九年十月二十六日衛(wèi)生部關(guān)于規(guī)范食品中大腸菌群指標的檢測工作的公告(2009年第16號)

03版大腸菌群MPN法測定的操作流程8）注意事項（1）兩步法進行了兩次乳糖發(fā)酵試驗。初發(fā)酵和證實實驗所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長，這個緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slowlactosefermentations）”來促進菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細菌。（2）初發(fā)酵陽性管，只能經(jīng)過復發(fā)酵實驗后，才有可能成為陽性。（3）在實際工作中，有時遇到初發(fā)酵時產(chǎn)酸，但導管內(nèi)無氣泡產(chǎn)生，復發(fā)酵卻證實為大腸菌群陽性。有時導管內(nèi)無氣體，但在液面及管壁卻可看到小氣泡。（4）LST發(fā)酵管和BGLB發(fā)酵管在滅菌以后要檢查小導管內(nèi)有無氣泡,如果有氣泡就不能再用了。（5）計算產(chǎn)氣管的數(shù)量時以BGLB發(fā)酵管產(chǎn)氣管的數(shù)量為準。平板計數(shù)證實試驗7.第二法大腸菌群平板計數(shù)法

1）需要用到的培養(yǎng)基VRBA：結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂成分：蛋白胨7.0g，酵母膏3.0g，乳糖10.0g，氯化鈉5.0g，膽鹽或3號膽鹽1.5g，中性紅0.03g，結(jié)晶紫0.002g，瓊脂15g～18g，蒸餾水1000mL，pH7.4±0.12)樣品的稀釋按第一法中的稀釋方法進行。3)平板計數(shù)（1）選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿1mL。同時分別取1mL生理鹽水加入兩個無菌平皿作空白對照。（2）及時將15mL-20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂VRBA）約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL-4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±l℃培養(yǎng)18h-24h。（3）、平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15-150之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。（4）證實試驗從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h-48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。（5）大腸菌群平板計數(shù)的報告

經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以（3）中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105

CFU/g（mL）。四、大腸埃希氏菌的計數(shù)GB/T4789.38–20121.參考標準和范圍本標準采用的定義是大腸埃希氏菌，方法主要參考的是美國FDABacteriologicalAnalyticalManual（2002）中的EnumerationofEscherichiacoliandtheColiformBacteria。本標準規(guī)定了食品中大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）計數(shù)的方法。本標準適用于食品中大腸埃希氏菌的計數(shù)，其中大腸埃希氏菌平板計數(shù)法（第二法）不適用于貝類產(chǎn)品。2.國標定義2.1大腸埃希氏菌Escherichiacoli

大腸桿菌廣泛存在于人和溫血動物的腸道中，能夠在44.5℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC（靛基質(zhì)、甲基紅、VP試驗、檸檬酸鹽）生化試驗為＋＋――或－＋――的革蘭氏陰性桿菌。以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。2.2大腸埃希氏菌的某些菌株對人有致病性。相對于大腸菌群和糞大腸菌群，大腸埃希氏菌與糞便污染的相關(guān)性最好，應用也最悠久。自1892年被提議作為糞便污染的指示菌以來，已被應用了100多年。2.3方法大腸埃希氏菌MPN計數(shù)（第一法）大腸埃希氏菌平板計數(shù)法（第二法）3.設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：3.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。3.2冰箱：2℃～5℃。3.3恒溫水浴箱：44.5℃±0.2℃。3.4天平：感量為0.1g。3.5均質(zhì)器。3.6振蕩器。3設備和材料3.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。3.8無菌錐形瓶：容量500mL。3.9無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。3.10pH計或pH比色管或精密pH試紙。3.11菌落計數(shù)器。3.12紫外燈：波長360nm～366nm，功率≤6W。4培養(yǎng)基和試劑4.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯。4.2EC肉湯（E.coli

broth）。

4.3蛋白胨水。

4.4緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)和V-P試驗用]。4.5西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基。4.6磷酸鹽緩沖液。4培養(yǎng)基和試劑

4.7伊紅美藍（EMB）瓊脂。

4.8營養(yǎng)瓊脂斜面。

4.9結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）。

4.10VRBA-MUG。

4.11革蘭氏染色液。

4.12Kovacs靛基質(zhì)試劑。

4.13無菌1mol/LNaOH。

4.14無菌1mol/LHCl。大腸埃希氏菌MPN計數(shù)初發(fā)酵復發(fā)酵伊紅美藍平板分離培養(yǎng)營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)生化試驗5操作步驟5.1樣品的稀釋5.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，制成1:10樣品勻液。5.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。5.1樣品的稀釋5.1.3樣品勻液的pH值應在6.5～7.5之間，必要時分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。5.1.4用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管或吸頭反復吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。5.1樣品的稀釋5.1.5根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。5.2初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進行復發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)48h±2h。產(chǎn)氣者進行復發(fā)酵試驗。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果。5.3復發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于已提前預溫至45℃的EC肉湯管中，放入帶蓋的44.5℃±0.2℃水浴箱內(nèi)。水浴的水面應高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng)24h±2h。檢查小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未有產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h。記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的EC肉湯管數(shù)。如所有EC肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進行EMB平板分離培養(yǎng)。EC肉湯

EC肉湯主要成分：乳糖、膽鹽、胰蛋白胨。大腸埃希氏菌因分解乳糖而產(chǎn)氣，使小倒管中可見氣泡。5.4伊紅美藍平板分離培養(yǎng)輕輕振搖各產(chǎn)氣管，用接種環(huán)取培養(yǎng)物分別劃線接種于EMB平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。觀察平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。EMB瓊脂

主要成分：乳糖、營養(yǎng)物質(zhì)。指示劑系統(tǒng)：伊紅和美藍。原理：大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸，使伊紅與美藍結(jié)合而形成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，并可產(chǎn)生金屬光澤。黑色程度與光澤產(chǎn)生情況與伊紅、美藍二者的比例有關(guān)。不發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的細菌，在堿性環(huán)境中不能使伊紅、美藍結(jié)合，因而形成無色的菌落。部分大腸菌群的菌株在EMB上可形成紅色或粉紅色的菌落。（應注意非典型的菌落）。EMB瓊脂上的大腸埃希氏菌

典型菌落：具黑色中心有光澤或無光澤的菌落。非典型的可疑菌落：粉紅色，無黑心。5.5營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)從每個平板上挑5個典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上36℃±1℃，培養(yǎng)18h～24h。取培養(yǎng)物進行革蘭氏染色和生化試驗生化鑒定取培養(yǎng)物進行靛基質(zhì)試驗、MRVP試驗和檸檬酸鹽利用試驗。大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌的生化鑒別見表1。

表1大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌得生化鑒別靛基質(zhì)（I）甲基紅（MR)VP試驗（VP)檸檬酸鹽（C）鑒定（型別）+-++----典型的大腸埃希氏菌非典型大腸埃希氏菌+-++--++典型中間型非典型中間型-+--++++典型產(chǎn)氣腸桿菌非典型產(chǎn)氣腸桿菌生化鑒定注1：如出現(xiàn)表1以外的生化反應類型，表明培養(yǎng)物可能不純，應重新劃線分離，必要時做重復試驗。注2：生化試驗也可以選用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)等方法，按照產(chǎn)品說明書進行操作5.6大腸埃希氏菌MPN計數(shù)的報告大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無胞桿菌，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，IMViC生化試驗為＋＋――或－＋－－。只要有1個菌落鑒定為大腸埃希氏菌，其所代表的LST肉湯管即為大腸埃希氏菌陽性。依據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌MPN值。5.7填寫原始記錄檢樣量的選擇注1：本表采用3個稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每個稀釋度接種3管。注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1g（mL）、0.1g(mL)和0.01g(mL)時，表內(nèi)數(shù)字應相應降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)時，則表內(nèi)數(shù)字應相應增高10倍，其余類推。6.大腸埃希氏菌平板計數(shù)法

（第二法）6.1基本原理4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷，英文縮寫MUG。是一種不產(chǎn)生熒光的底物。由于96%的大腸埃希氏菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解β-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基傘形酮游離出來，在366nm紫外光下產(chǎn)生藍色熒光。觀察到藍色熒光即可認為是大腸埃希氏菌陽性。MUG對大腸埃希氏菌的生長繁殖既沒有抑制作用也沒有促進作用，對菌落形態(tài)也沒有影響。大腸埃希氏菌VRB-MUG平板計數(shù)法檢驗時用已知MUG陽性菌株（如大腸桿菌ATCC25922）和產(chǎn)氣腸桿菌（如ATCC13048）做陽性和陰性對照6.2操作步驟6.2.1樣品的稀釋，按5.1進行。6.2.2平板計數(shù)6.2.2.1選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL稀釋液加入無菌平皿做空白對照。6.2操作步驟6.2.2.2將10mL～15mL冷至45℃±0.5℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。6.2.2.2…待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA-MUG覆蓋平板表層。凝固后翻轉(zhuǎn)平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。6.2操作步驟檢驗時用已知MUG陽性菌株（如大腸埃希氏菌ATCC25922）和產(chǎn)氣腸桿菌（如ATCC13048）做陽性和陰性對照。6.3平板菌落數(shù)的選擇

數(shù)在10CFU～100CFU之間的平板，暗室360nm～366nm波長紫外燈照射下，計數(shù)平板上發(fā)淺藍色熒光的菌落。大腸埃希氏菌在VRBA上大腸埃希氏菌在VRBA-MUG上6.4大腸埃希氏菌平板計數(shù)的報告兩個平板上發(fā)熒光菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌數(shù)，以CFU/g(mL)表示。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板