DB11-T 987-2013 鱘魚種質鑒定規(guī)范

ICS65.150

B50

備案號:38199-2013DB11

北京市地方標準

DB11/T987—2013

鱘魚種質鑒定規(guī)范

Rulesofsturgeongermplasmidentification

2013-06-21發(fā)布2013-10-01實施

北京市質量技術監(jiān)督局發(fā)布

DB11/T987—2013

鱘魚種質鑒定規(guī)范

1范圍

本標準適用于西伯利亞鱘（Acipenserbaerii）種質的檢測和鑒定。

本標準給出了西伯利亞鱘的學名與分類、主要生物學特征、生長與繁殖、遺傳學特征及檢測方法。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB17716青魚

GB/T18654.2養(yǎng)殖魚類種質檢驗第2部分抽樣方法

3學名與分類

3.1學名

西伯利亞鱘（Acipenserbaerii）

3.2分類地位

屬鱘形目（Acipenseriformes）,鱘科（Acipenseridae）,鱘屬(Acipenser)。

4生物學特征

4.1外部形態(tài)

魚體修長，呈紡錘形，橫切呈五角形，向尾部延伸變細，吻長尖，口腹位，口裂較小，一字形。歪

形尾，鰓蓋骨愈合為一,鰓蓋膜彼此不相連而與頰部相連。體裸露無鱗具五列骨板，1列背骨板，2兩列

側骨板，2列腹骨板；第一背骨板不是最大的骨板,身體最高點不在第一骨板處；側骨板通常與軀干部顏

色相似；腹骨板與背骨板間具有許多星狀薄骨板或微小顆粒，吻須4根，介于吻突與口裂之間，稍靠近

口裂。鰓耙有結節(jié)，一般為3個。

魚體背部呈淡灰黑色或暗褐色，兩側較淡，腹部為白色。

西伯利亞鱘的外部形態(tài)見圖1。

1

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圖1西伯利亞鱘外部形態(tài)圖（引自FAO）

4.2可數(shù)性狀

背鰭鰭式：D.30～56。

臀鰭鰭式：A.17～33。

背骨板數(shù)：10～20。

側骨板數(shù)：37～56，通常為42～47。

腹骨板數(shù)：7～16。

第一鰓弓（左）外側鰓耙數(shù)：20～49，通常為27～32。

4.3可量性狀比例

西伯利亞鱘魚種、成魚和親魚的可量性狀比例見表1。

表1西伯利亞鱘的可量性狀比例（平均值±標準差）

年齡

項目

魚種（8月齡）成魚（3齡）親魚（10齡）

全長/體長a1.31±0.041.25±0.061.28±0.04

體長/體高6.65±0.646.15±0.045.53±0.51

體長/頭長3.69±0.253.79±0.344.09±0.28

頭長/吻長1.74±0.172.09±0.182.09±0.17

頭長/眼徑22.13±1.9723.52±6.7223.70±4.21

頭長/眼間距3.59±0.483.17±0.393.29±0.30

頭長/尾柄高8.47±1.236.39±1.515.75±1.01

尾柄長/尾柄高2.84±0.642.28±0.572.5±0.52

a采用從吻端到尾鰭基部的長度

5生長與繁殖

5.1生長

2

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在人工養(yǎng)殖條件下,不同年齡組的西伯利亞鱘魚體長和體重范圍見表2。

表2西伯利亞鱘各年齡組體長和體重范圍

年齡a12345

體長cm40～5050～7070～8590～100100～120

體重g400～6001500～20003000～40005000～70007000～9000

a依據北方地區(qū)流水養(yǎng)殖模式，年齡以周年計

5.2繁殖

性成熟年齡：自然條件下雌魚為19齡～20齡，雄魚為17齡～18齡；人工養(yǎng)殖條件下雌魚為7齡以上，

雄魚為5齡以上。繁殖周期：野生狀態(tài)下為2年以上；人工養(yǎng)殖條件下為1年以上。懷卵量占體重的10%～

30%。

6遺傳學特征

6.1細胞遺傳學特征

采用流式細胞儀測定西伯利亞鱘魚細胞中DNA含量為N=8.98±0.115pg。

6.2生化遺傳學特征

西伯利亞鱘肝臟酯酶（EST）同工酶有6條酶帶，電泳圖及酶帶電泳模式圖見圖2。

1為電泳圖譜，2為模式圖

圖2西伯利亞鱘肝臟酯酶電泳圖譜及模式圖

6.3分子遺傳學標記

6.3.1西伯利亞鱘特異性RAPD遺傳圖譜的建立及特征標記

RAPD引物（CCGCCCAAAC）PCR擴增的結果如圖3所示。

3

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圖3RAPD引物的擴增產物

1為西伯利亞鱘池，2、3為西伯利亞鱘個體，4為marker

6.3.2西伯利亞鱘微衛(wèi)星DNA分子標記的建立

采用14對微衛(wèi)星引物進行基因型鑒定，西伯利亞鱘在這14對引物的等位基因長度范圍見表3?；?/p>

型數(shù)據分析結果見圖4。

表314個微衛(wèi)星引物序列及其在西伯利亞鱘的等位基因長度范圍

位點名稱引物序列(5’-3’)等位基因長度范圍(bp)

Atr-1101F:TATCCCCTCCACTGGAAATR:GTTAAACATCCCTGCCTTCA143～203

Atr-105F:CGATTTGATTGGCTCTTGTAR:TGCAAATAAATTGGAGCTGA157～173

Atr-107F:GGCAGGATTACATCTCCTGAR:TTACTAACTGCTAGATAATACCTCTCT188～242

Atr-109F:ACCCGAGCTGTCACATTACTR:AAAATAACGCGAATTCCTGA162～300

Atr-114F:GCAATTCGTGTTATGTTCATTTR:TGCATTCAGAGAATAACCGA201～251

Atr-117F:TGCATGACACAGGACTTACCR:TGCCTCTCAATAGCAACATC191～259

Abr39F:ACCCGCAATTATTAGGACR:CAGGACAAACTCAGACCC178～276

Abr40F:TCACGCAGTCTCACAAGGR:TTCAATGGCAAACAGCAC384～418

Abr41F:ACACTATCCCGCCACAATR:CCACTGAAGCCATCATCT322～410

Afu19F:CATCTTAGCCGTCTGTGGTACR:CAGGTCCCTAATACAATGGC120～139

Afu22F:TCCACAATCCTGAATAATGACR:GCACCATCTAATACGAAATTG140～242

Afu39F:TTCTGAAGTTCACACATTGR:ATGGAGCATATTGGAAGG119～140

Afu54F:CTCTAGTCTTTGTTGATTACAGR:CAAAGGACTTGAAACTAGG149～221

Afu68F:TTATTGCATGGTGTAGCTAAACR:AGCCCAACACAGACAATATC128～250

4

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表示西伯利亞鱘品種池

表示非西伯利亞鱘樣品

圖4微衛(wèi)星標記基因型數(shù)據分析結果圖

7檢測方法

7.1繁殖力檢測

按照GB17716的生物測定方法。

7.2細胞遺傳學特征測定

7.2.1采鱘魚尾動脈血0.5ml，加入肝素處理過的1.5mL小指管中，低速（1000rpm）離心3min，棄

上清。用0.8%的生理鹽水洗滌三次后，在管中加滿70%的冷乙醇固定過夜，注意固定時使細胞充分散開。

7.2.2取細胞懸液濃度調整到106cell/ml樣品1ml，用RNA酶10μg/ml～20μg/ml37℃水浴消化

0.5h；碘化丙碇50μg/ml4℃染色30min。

7.2.3將處理過的樣品用細絹布過濾后，加入適量的同樣處理的雞血紅細胞，上流式細胞儀測定熒光

強度，計算西伯利亞鱘魚與雞血細胞（N=2.8pg）熒光強度之比，即可得到鱘魚的DNA含量。

7.3生化遺傳學特征測定

7.3.1試驗材料

西伯利亞鱘30尾以上。

7.3.2樣品制備

剪斷魚的尾動脈，放血。隨后解剖，迅速摘取肝組織0.5g左右，置于0℃生理鹽水中，用生理鹽水

洗去組織血污。然后稱重，放入玻璃勻漿器中，按1:5（g/ml）的比例加入0.1MpH7.0的冰冷磷酸緩沖

液中進行冰浴勻漿。勻漿后在4℃冰箱放置1小時，4℃條件下，12000rpm離心30min，吸取上清液，分裝

于0.5ml離心管中，-80℃低溫冰箱中保存，供同工酶電泳分析用。

7.3.3電泳分析

7.3.3.1電泳分離條件：電泳緩沖液0.2Mtris-GlypH8.3，分離膠為10%，濃縮膠為4%，小型雙垂

直電泳槽電泳電壓100V，電泳時間為9h～10h，之后改為電壓60V，電泳時間為6h～7h。

7.3.3.2加樣及電泳：每槽加樣7μl，與等體積的溴酚藍蔗糖液混勻后加樣，在4℃冰箱中進行電泳。

7.3.3.3染色：將α-萘酚0.1g和β-萘酚0.1g溶解于10ml丙酮中，加0.2M磷酸緩沖液至100ml，

加固藍0.1g配成染色液。凝膠板在37℃與染色液，保溫30min～50min，即可呈現(xiàn)棕紅色同工酶區(qū)帶，

用蒸餾水沖洗3次后，7%醋酸固定。

7.4分子遺傳學標記方法

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7.4.1試驗材料

從西伯利亞鱘群體中分別隨機抽取同齡魚30尾以上，進行尾椎靜脈采血，ACD抗凝，去除血漿后-20℃

保存。或剪取西伯利亞鱘鰭條約0.5g，置于75%酒精中常溫保存。

7.4.2基因組DNA的制備

利用常規(guī)苯酚/氯仿法抽提個體基因組DNA，利用紫外分光光度法確定DNA濃度，將個體基因組DNA

液稀釋至濃度10ng/μl；從每個個體基因組的DNA稀釋液中取出10μl集于一管中，制成品種的池DNA。

7.4.3PCR擴增反應

擴增反應總體積為25μl，其中包括摸板DNA30ng、10×PCR緩沖液（含Mg2+）2.5μl、dNTPS（2.5mM

each）2μl、Taq酶（5u/μl）0.3μl、引物1pM（RAPD法和微衛(wèi)星DNA法分別使用各自的引物）。

RAPD法反應程序為：95℃預變性5min，94℃45s、36℃45s、72℃90s，45cycles,72℃延伸5min。

微衛(wèi)星DNA法反應程序為：94℃變性45s、退火45s（各引物退火溫度詳見表4）、72℃延伸45s，40

cycles,72℃再延伸5min。

擴增反應結束后，取5μl產物與1μl上樣緩沖液混合點樣，在含溴化乙錠的1.4%瓊脂糖凝膠中電泳

1h～2h，電壓80v，紫外燈下觀察結果并拍照記錄。

表414個微衛(wèi)星位點重復序列結構和退火溫度

位點名稱重復序列結構退火溫度(℃)

Atr-1101(TATC)1055

Atr-105(GATA)1550

Atr-107(TAGA)1757

Atr-109(GA)5(TAGA)2055

Atr-114(TAGA)2360

Atr-117(GATA)855

Abr39(TATC)1858

Abr40(TCTA)6(TAGA)1261

Abr41(TCTA)1765

Afu19(TTG)553

Afu22(TAAA)5(GAA)1952

Afu39(CAA)1455

Afu54(GATA)2(GACA)255

Afu68(GATA)2155

7.4.4結果分析

7.4.4.1RAPD法結果分析

向PCR產物中加入上樣緩沖液，94℃解鏈5min，迅速置于冰中冷卻至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用95%酒精把長板擦洗一遍，待酒精揮發(fā)后涂1.5mL親和溶液；再使用95%酒精把短板也擦洗一遍，

待酒精揮發(fā)后涂200μL剝離溶液。取6%變性聚丙烯酰胺溶液80mL，加入60μL四甲基乙二胺，180μL的10%

過硫酸銨（現(xiàn)用現(xiàn)配），充分混勻后灌入兩塊玻璃之間。用鯊魚齒梳子的背面沿兩玻璃板縫隙水平插入

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膠中約5mm～6mm。等約1.5h待凝膠聚合后，拔出梳子，用自來水將玻璃板表面沖洗干凈，擦干后裝在電

泳槽上。向電泳槽的上下緩沖液槽中加入0.5×TBE緩沖液，使緩沖液沒過短板。1800V恒壓預電泳20min。

預電泳之后，在每個加樣孔中加入5μL解鏈后樣品，1800V恒壓電泳1.5h～2.5h。

電泳結束后，小心分離兩塊玻璃板，將粘有凝膠的長板浸入染色液中，染色5min～15min，用蒸餾

水漂洗30s，浸入在顯影液中顯影至帶型清晰，再用蒸餾水漂洗5min。晾干長板后，拍照紀錄結果。

7.4.4.2微衛(wèi)星DNA法結果分析

使用普通微衛(wèi)星引物進行PCR擴增時，基因型判讀同上述RAPD法。

使用熒光微衛(wèi)星引物進行PCR擴增時，直接使用基因分析儀進行基因型判讀。

使用軟件STRUCTURE2.3對基因型數(shù)據進行綜合分析。

8檢測規(guī)則

8.1檢測分類

檢測分為鑒定檢測和質量一致性檢測。

8.2檢測項目

鑒定檢測項目包括外部形態(tài)特征、可量性狀、可數(shù)性狀。質量一致性檢測項目包括細胞遺傳學特征、

生化遺傳學特征、分子遺傳學特征。

8.3取樣

樣品魚的抽樣按GB/T18654.2規(guī)定執(zhí)行。

8.3.1組批

以同齡期的西伯利亞鱘為同一批。

8.4判定規(guī)定

各項檢測指標在標準范圍內則判定為西伯利亞鱘。

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參考文獻

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