基因工程知識點總結(jié)歸納(更)

基因工程

緒論1、克隆(clone):作名詞：含有目的基因的重組DNA分子或含有重組分子的

無性繁殖。作動詞：基因的分別和重組的過程。

2、基因工程(geneengineering:體外將目的基因插入病毒、質(zhì)粒、或其他載體分

子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之摻入到原先沒有這些基因的宿主細(xì)胞內(nèi)，

且能穩(wěn)定的遺傳。供體、受體和載體是基因工程的三大要素。

3、基因工程誕生的基礎(chǔ)

三大理論基礎(chǔ)：40年月發(fā)覺了生物的遺傳物質(zhì)是DNA；50年月弄清楚DNA的雙

螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機理；60年月確定遺傳信息的遺傳方式。以密碼方式每三

個核甘酸組成一個密碼子代表一個氨基酸。

三大技術(shù)基礎(chǔ)：限制性內(nèi)切酶的發(fā)覺；DNA連接酶的發(fā)覺；載體的發(fā)覺3、基因

工程的技術(shù)路線：切：DNA片段的獲得；接：DNA片段與載體的連接;轉(zhuǎn)：外源

DNA片段進(jìn)出受體細(xì)胞；選：選擇基因；表達(dá)：目的基因的表達(dá)；基因工程的工

具酶1、限制性內(nèi)切酶(restrictionenzymes):主要是從原核生物中分別純化出來

的，是一類能識別雙鏈DNA分子中某種特定核昔酸序列，并由此切割DNA雙鏈

的核酸內(nèi)切酶。

2、限制前的命名：屬名(斜體"種名+株系+序數(shù)3、II型限制性內(nèi)切酶識別特定

序列并在特定位點切割4、同裂酶：來源不同，其識別位點與切割位點均相同的

限制酶。

5、同尾酶：來源不同，識別的靶序列不同，但產(chǎn)生相同的黏性末端的酶形成的

新位點不能被原來的酶識別。

6、限制性內(nèi)切酶的活性：在適當(dāng)反應(yīng)條件下，1小時內(nèi)完全酶解lug特定的DNA

底物，所需要的限制性內(nèi)切酶的量為1個酶活力單位。

7、星號活性：轉(zhuǎn)變反應(yīng)條件，導(dǎo)致限制酶的專一性和酶活力的轉(zhuǎn)變。

8、DNA連接酶的特點：具有雙鏈特異性，不能連接兩條單鏈DNA分子或閉合單

鏈DNA,連接反應(yīng)是吸能反應(yīng)，最適反應(yīng)溫度是4至15度，最常用的是T4連接

0

9、S1核酸酶:特異性降解單鏈DNA或RNA。

10、RNAH降解與DNA雜交的RNA,用于cDNA文庫建立時除去RNA以進(jìn)行其

次鏈的合成。

11、DNA聚合酶：

⑴、DNA聚合酶I：5'—3'外切酶活性、3'—5'外切酶活性，5,一3,聚合酶活

性，用途：除去3'端突起。補齊5'端突起。合成cDNA其次鏈。切口移位探針

的制備。

⑵、Klenow大片段：沒有5-3,外切酶活性，而保留了5-3，DNA聚合酶活性和

3f外切酶活性。用途:用同位素標(biāo)記具5端突起的DNA片段末端。補平S粘性

末端。DNA序歹U測定。合成cDNA其次鏈。

(3)、Taq酶：75度為最適反應(yīng)溫度，95度仍具有穩(wěn)定性，不具有外切酶活性，

主要用于PCR。

12、主要修飾酶：

(1)堿性磷酸酶：除去核酸分子3'和5'端的磷酸基團。

(2)T4多聚核昔酸磷酸激酶：催化ATP中的Y位的磷酸基轉(zhuǎn)移5,-0H上末端脫

氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶：在3'端高效添加脫氧核甘酸。

分子克隆載體1、分子克隆載體：是一類可供外源DNA片段插入并攜帶重組分子

進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴增或表達(dá)的DNA分子。

2、分子克隆載體的功能：

為外源基因供應(yīng)進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移力氣為外源基因供應(yīng)在受體細(xì)胞中復(fù)制或整

合的力氣為外源基因供應(yīng)在受體細(xì)胞中擴增和表達(dá)的力氣3、載體的分類：

按用途分：克隆載體、表達(dá)載體、整合載體按來源分：原核生物載體：質(zhì)粒載

體、九噬菌體載體、M13噬菌體載體、cosmid載體、phagemid載體；真核病毒載

體4、載體的特點：(1)至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一個生物體中自主復(fù)

制

(2)至少有一個克隆位點，可供外源DNA插入

(3)至少有一個標(biāo)記基因，以學(xué)問載體或重組DNA分子是否進(jìn)入受體細(xì)胞

(4)具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)5、標(biāo)記基因的作用：外源基因是否插入

載體分子形成重組子；外源載體是否進(jìn)入宿主細(xì)胞6、標(biāo)記基因的種類：抗性標(biāo)

記基因；養(yǎng)分標(biāo)記基因；生化標(biāo)記基因；噬菌斑7、常用的遺傳標(biāo)記基因：四環(huán)

素抗性基因(Tc)；氨節(jié)青霉素抗性基因(Ap)；氯霉素抗性基因(Cm)；卡那

霉素（Kan）；新霉素（Neo）；曠半乳糖甘酶基因（LacZ）；葡萄糖甘酸酶基因

（Gus）；熒光素酶基因；發(fā)光蛋白質(zhì)基因。

8、按復(fù)制起點劃分克隆載體：

1）質(zhì)粒復(fù)制型一復(fù)制起點來自質(zhì)粒或線粒體和葉綠體（有低拷貝和高拷貝）2）

ARS復(fù)制型一染色體復(fù)制型（一般拷貝數(shù)比較高）3）病毒復(fù)制型一復(fù)制起點來自

病毒，若為RNA必需反轉(zhuǎn)錄為cDNA（高拷貝）4）混合復(fù)制型：不同種生物復(fù)制

起點混合（穿梭載體）9、依據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分：質(zhì)粒載體、病毒型載

體、混合型載體10、依據(jù)載體功能分類：

1）一般型載體：至少有一個以上的克隆位點和兩個標(biāo)記基因。如PBR322和

pUC載體

2）表達(dá)型載體：3類：1型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列+啟動子）+終止子；H型：

轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子）+終止子；I口型：轉(zhuǎn)

錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)+信號肽鏈編碼區(qū)+終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體）

3）失控型質(zhì)粒載體（Run-awayplasmidvector）：是一些低拷貝質(zhì)粒，其復(fù)制

把握是溫度敏感型或藥物敏感型，在不同溫度或不同藥物濃度下，質(zhì)?？截悢?shù)會

顯著變化。

4）探針型載體：該類載體主要特點是含有一些特殊的DNA序列，用于特定的

爭論目的，如分別基因啟動子、終止子、DNA復(fù)制起點等。

5）定序型載體：主要用于核甘酸的序列測定

6）整合型載體：主要用于基因治療，穩(wěn)定表達(dá)外源基因。

9、標(biāo)記基因與拷貝的關(guān)系：若標(biāo)記基因的表達(dá)效率較高，宿主細(xì)胞可能小大量表

達(dá)標(biāo)記基因以滿足選擇壓力的要求，因而載體的拷貝數(shù)會降低，可實行相應(yīng)方法

提高拷貝數(shù)。如：對于藥物抗性標(biāo)記基因，可提高藥物的濃度。對于養(yǎng)分標(biāo)記基因，

可降低該基因的表達(dá)效率。

大腸桿菌分子克隆載體1、E.col克隆載體的種類

1）質(zhì)粒載體一復(fù)制起點來自一些自然質(zhì)粒。

2）噬菌體載體一入，P1和M13、fd載體，復(fù)制起點來自噬菌體。

3）COS質(zhì)粒載體一質(zhì)粒載體中插入入cos片段，以利于體外包裝

4）噬粒載體（phagemid）—有質(zhì)粒和M13、fd的復(fù)制起點，以質(zhì)?；蚴删w方

式復(fù)制。

2、質(zhì)粒的特點：

1）質(zhì)粒DNA的復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)2）質(zhì)粒DNA以超螺旋形式存在3）質(zhì)粒

DNA可以結(jié)合轉(zhuǎn)移4）質(zhì)粒的不相容性和不相容群5）質(zhì)粒DNA的消退6）質(zhì)粒

的整合3、大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制：以RNAII為引物合成，RNAI與RNAII結(jié)合可

削減質(zhì)粒的拷貝數(shù)，使RNAI復(fù)制起點上游一個核甘酸處G突變?yōu)門,使得拷貝

數(shù)增多。

4、質(zhì)粒的不親和性：在沒有選擇壓力的狀況下，兩種親緣關(guān)系親熱的不同質(zhì)

粒，不能夠在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。主要是由于他們在復(fù)制功能之間

的相互干擾造成。

5、入噬菌體的結(jié)構(gòu)特點：線性雙鏈DNA病毒，具有末端互補的12個核昔酸，

感染細(xì)菌后粘端互補成雙鏈環(huán)狀。全長48.5kb。

6、熱誘導(dǎo)表達(dá)：Xclts857,可作為組件插入質(zhì)粒DNA內(nèi)。目的基因插在九

clts857下游，重組體的目的基因在42。（2表達(dá)，306不表達(dá)。

7、入噬菌體載體的缺點：基因組太大；酶切點太多；野生型只能接納確定長度

的DNAo

8、入噬菌體載體的改造：切去非必需片段，加載目的基因去掉太多的酶切位點

增加標(biāo)記基因9、COS質(zhì)粒載體的特點：在一般質(zhì)粒載體中插入一個或兩個來自

久的cos位點片段，雙cos載體比單cos載體易于重組。

10、COS質(zhì)粒載體的優(yōu)點：容量大，用于基因簇的克??；形成的重組DNA分子

可進(jìn)行體外包裝，并能感染大腸桿菌細(xì)胞；操作簡潔，易于轉(zhuǎn)化細(xì)胞；對重組

DNA分子長度具有選擇性包裝。

11＞噬粒載體（phagemid）:在質(zhì)粒載體中插入一段M13或fd的復(fù)制起點，其

插入方向準(zhǔn)備在噬菌體顆粒中形成正鏈還是負(fù)鏈。

基因操作的主要技術(shù)原理1、核酸分別提取的原則：保證核算的一級結(jié)構(gòu)的完整

性；排解其他分子的污染2、質(zhì)粒載體分別的關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒與DNA與宿主染

色體DNA分開

依據(jù)：質(zhì)粒DNA比染色體DNA小得多，在DNA提取過程中，染色體斷裂成片段，

而質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型3、變性法提取質(zhì)粒DNA的原理：

在變性條件（堿性或高溫）下，線狀染色體DNA變性成為單鏈而完全分開，而

cccDNA雖然互補鏈之間的氫鍵斷裂，但雙螺旋主鏈骨架仍彼此纏繞在一起。當(dāng)

變性條件恢復(fù)時，質(zhì)粒DNA快速復(fù)性恢復(fù)自然構(gòu)型，染色體DNA難以復(fù)性，

交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白質(zhì)和RNA纏繞在一起，通過離心沉淀

下來，而質(zhì)粒DNA存在于上清液中。

4、RNA分別純化的關(guān)鍵：防止內(nèi)外源RNase的作用5、RNase的特點：抗酸抗

堿；抗高溫寒冷；抗變性劑，酶活性不需要關(guān)心因子，存在范圍廣。因此操作時

要進(jìn)行高溫滅菌或用焦碳酸二乙酯處理或強蛋白質(zhì)變性劑等。

6、核酸的濃縮：沉淀法：可以除去溶液中某些可溶的鹽離子和雜質(zhì)。

7、核酸凝膠電泳的基本原理：核酸分子中的磷酸基團帶負(fù)電荷，在電場中將向

正極移動，通過凝膠的分子篩作用可以將不同大小和構(gòu)型的核酸分子分別，分子

量小的DNA,具有較緊密的構(gòu)型，在凝膠中移動快；反之，分子量大的DNA移

動慢。

8、核酸凝膠電泳常使用溟酚藍(lán)作為指示劑、漠化乙錠作為染色劑9、脈沖場凝膠

電泳原理：加在凝膠上至少有兩個電場方向，使得DNA分子要不斷地調(diào)整泳動

方向，不同分子量大小的DNA分子用于轉(zhuǎn)變泳動方向的時間不同，則可以得到

分別10、雙脫氧核甘酸終止法的原理：雙脫氧（2'，3’）核甘酸可以象2'脫氧

核甘酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3,端不具0H基，DNA鏈合成至此

中斷。

由于雙脫氧核甘酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，故可依據(jù)不同長度的

DNA片段測定出核甘酸序列H、雙脫氧核甘酸終止法的過程：制備單鏈DNA,與

引物退火，分為4個反應(yīng)體系，每個體系中加入dNTP和一種雙脫氧核甘酸，DNA

聚合酶定序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳，凝膠干燥，放射自顯影，依據(jù)條帶讀出

堿基序列，再依據(jù)堿基互補配對原則寫出DNA鏈的序列。（留意：要自己寫一個

序列，然后寫上每個體系中消逝片段的序列，然后依據(jù)序列畫出電泳圖，考試考

的可能性大，書上有步驟）12、MaxamGilbert化學(xué)法原理：DNA鏈上的不同堿

基可以和堿基修飾劑發(fā)生反應(yīng)，在堿性環(huán)境下硫酸二甲酯能使堿基G發(fā)生甲基

化，在酸性環(huán)境下哌咤甲酸使A和G脫喋吟，堿性環(huán)境下腫使C和T發(fā)生開環(huán)，

在高鹽濃度下朋只使C開環(huán)。然后發(fā)生1~2個堿基的脫落或取代，最終發(fā)生鏈斷

裂，不同位置斷裂的DNA分子經(jīng)凝膠電泳就可確定其核甘酸序列13、化學(xué)法測

序的優(yōu)點、不需要模板、引物和DNA聚合酶。

14、Southern雜交（Southernblot）：用一種或多種限制性內(nèi)切酶對基因組

DNA加以切割，通過瓊脂糖凝膠電泳分別酶切片段，隨后，使DNA在原位變

性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至固相膜，用已知核甘酸片段加以標(biāo)記作為探針，通過分子雜

交來檢測0

待測樣品中是否存在互補的核酸序列

Southern雜交的一般步驟：DNA的制備一DNA酶切f電泳（瓊脂糖凝膠電泳）

fDNA原位轉(zhuǎn)膜f探針雜交f放射自顯影f結(jié)果分析15、Northern雜交檢測的是

RNAo步驟與southern類似，不需要酶切。

16、Western雜交：雜交的對象是蛋白質(zhì)，先將蛋白質(zhì)從SDSPAGE中轉(zhuǎn)移到一

固相支持物上，通過與附著于固相支持物上的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原抗體特異反應(yīng)

進(jìn)行檢測。主要用于基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的檢測。

Western雜交的一般步驟：蛋白質(zhì)制備fSDSf電轉(zhuǎn)移至膜上f一抗的制備f

一抗與膜結(jié)合（lh）f洗膜（30min）f二抗與膜的結(jié)合f洗膜f顯色反應(yīng)f結(jié)果

分析17、PCR反應(yīng)體系：模板、引物、dNTP、buffer,taq醐、超純水。

18、引物設(shè)計的一般原則：引物的長度常為17至30個堿基；GC含量為40%至

60%；Tm值高于55；兩條引物之間配對堿基數(shù)小于5；引物自身配對的堿基數(shù)小

于3。

基因文庫的建立1、基因組文庫：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的

克隆總和。

2、建立基因組文庫的一般程序：

1）載體DNA片段的制備：DNA分別，限制酶切割，脫磷酸化反應(yīng)2）供體DNA片

段的制備：總DNA純化，再進(jìn)行機械或酶切割成特定大小的DNA片段。

3）供體和載體DNA的連接:要留意混合的比率和濃度4）重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和

基因組文庫的擴增5）基因組文庫質(zhì)量的評價：文庫規(guī)模、重組頻率3、接受久載

體構(gòu)建基因組文庫：

1）載體DNA片段的制備的方法：左右臂DNA片段的獲得2）供體DNA片段的制

備：限制酶部分酶切，機械剪切法3）重組DNA分子的形成：把握混合的比率

4）重組DNA分子的包裝：制備包裝物，然后進(jìn)行包裝5）基因組文庫的擴增4、

為提高文庫的質(zhì)量，實行以下措施：

1）雙酶切載體產(chǎn)生不同末端以避開其自身形成串狀體2）供體DNA脫磷酸化以避

開供體DNA間的連接導(dǎo)致重排3）載體和供體DNA末端修飾以避開上述兩種情形

發(fā)生:載體補CT,供體補GA4）接受文庫快速構(gòu)建法以避開擴增文庫時DNA丟失

5、基因組文庫的載體可載入DNA大小

1）質(zhì)粒最大15kb適合構(gòu)建cDNA文庫；亞克

2）噬菌體最大25kbcDNA文庫

3）C0S質(zhì)粒30-45kb基因組文庫

4）噬粒最大12kbcDNA文庫

5）P170-90kb基囚組文庫

6)BAC100-500kb基因組文庫

7)YAC250-1000kb基因組文庫

6＞鳥槍法克隆目的基隨機克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過快

有效的篩選程序從眾多克隆中分別出含有目的基因的重組子，進(jìn)而獲得目的基

因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分別。

7、鳥槍法克隆基因的步驟：染色體DNA的切斷；與載體連接；轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞；

篩選含有目的基因的目的重組子。

8、鳥槍法的改進(jìn)：目的基因的酶切圖譜已知；在連接前將DNA片段進(jìn)行分級分

別9、鳥槍法克隆基因的局限性：工作量較大，需要了解目的基因的背景學(xué)問不

能獲得最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)果10、cDNA

文庫：從確定生長階段或條件的某種細(xì)胞分別到的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后

再重組和增值所產(chǎn)生的無性繁殖系的總和。

11、cDNA文庫的特點：基因特異性；器官特異性；代謝或發(fā)育特異性；不均勻

性；cDNA均可獲得表達(dá)12、建立cDNA文庫的一般程序1）載體DNA片段的制備

2）多聚（A）RNA的分別制備3）雙鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法合成單鏈cDNA,堿

解或酶解除去RNA合成其次鏈4）ds-cDNA與載體DNA相連：人工接頭、同聚物

加尾、cDNA的定向插入5）重組cDNA分子的轉(zhuǎn)移和文庫的建立:質(zhì)粒載體則轉(zhuǎn)化

大腸桿菌、噬粒則包裝感染13、其次鏈合成的方法：自身引導(dǎo)法、置換合成法、

引導(dǎo)合成法。前兩者5'端會有幾個堿基缺失。

目的基因的分別和鑒定1、獲得基因的一般方法：

1）化學(xué)合成法:主要用于較小基因的合成或需要轉(zhuǎn)變堿基2）半化學(xué)合成法：

mRNA*cDN—c加人工接頭或合成一段DNA-與載體相連、3）篩選法：用各種方法

從基因文庫或cDNA文庫中選擇目的基因2、基因篩選的方法：

1）遺傳互補法原理：當(dāng)一外源DNA片段引入一受體細(xì)胞后，假如受體細(xì)胞獲得

某種新的性狀，那么此片段上攜帶著準(zhǔn)備新性狀的遺傳基因。養(yǎng)分缺陷型受體細(xì)

胞轉(zhuǎn)入外源DNA片段之后，涂布在合成培育基上可以生長；無某種表型的細(xì)胞會

有新性狀；某些產(chǎn)酶細(xì)胞則可能過度產(chǎn)酶。

釀酒酵母MFa基因的篩選：基因組文庫DN—轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞斗在缺乏亮氨酸

的培育基上培育f能生長的重組子即含合成亮氨酸的基因2）核酸雜交法原理：

接受核酸探針與待分別DNA的同源序列可進(jìn)行雜交的特點分別目的基因。

分別步驟：基因（基因組或cDNA）文庫一制備DNA樣品膜一與標(biāo)記探針雜交

一雜交斑點邙日性克?。ゝ分別重組DNA分子一作斑點雜交一陽性克隆一

Southern雜交以確認(rèn)雜交結(jié)果一DNA進(jìn)一步證明利鑒定：核酸序列分析，與蛋白

質(zhì)一級結(jié)構(gòu)比較；分別插入片段進(jìn)行基因表達(dá)，用免疫方法或其他方法檢測表達(dá)

產(chǎn)物。

3）免疫法原理:外源DNA引入宿主細(xì)胞后表達(dá)出蛋白質(zhì)，以此蛋白質(zhì)為抗原與相

應(yīng)抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，然后接受二抗與一抗反應(yīng)，用二抗偶聯(lián)的酶反應(yīng)篩選目的

基因。

分別步驟:基因文庫-蛋白質(zhì)樣品膜制備-免疫法篩選-有色斑點邙日性克?。ゝ進(jìn)

一步證明：分別陽性克隆無細(xì)胞抽提物，作斑點印跡，western印跡免疫分析；

分別重組DNA,檢測插入片段大小，測序等。

4）染色體巡查法5）蛋白質(zhì)-DNA雜交法6）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合法，即酵母雙雜

交法原理：接受釀酒酵母的GAL4蛋白質(zhì)N端和C端分別融合的兩種蛋白質(zhì)相互

作用可激活具有UAS（上游激活序列）報告基因表達(dá)篩選目的基因的方法。

GAL4蛋白質(zhì)基因是一個調(diào)控基因，把握半乳糖接受酶類基因的表達(dá)，其5'

端存在UASo

GAL4存在兩個結(jié)構(gòu)域：N端具有UAS-DNA結(jié)合域（BD）,C端具有轉(zhuǎn)錄激

活結(jié)構(gòu)域（AD），這兩個結(jié)構(gòu)域可以單獨起作用。

假如AD和BD分別與兩個基因編碼序列融合，且兩種蛋白質(zhì)能相互作用，

就可導(dǎo)致GAL-LacZ基因的表達(dá)。與BD融合的基因稱為釣餌基因，與AD融合的

基因稱為目的基因。

3、用于基因分別和鑒定的關(guān)心方法：抑制消減雜交法；差別雜交法；阻斷翻譯

法；釋放翻譯雜交法植物基因工程1、植物組織培育技術(shù)：愈傷組織培育、細(xì)胞

懸浮培育、原生質(zhì)體、植株再生2、植物基因轉(zhuǎn)移方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍

法、原生質(zhì)體法、電擊法、顯微注射法3、植物轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因：選擇標(biāo)記基因

（kan、Hyg、Bar）、報告基因（Bl、Gus、GFP）>啟動子（CaMVA）4、Ti質(zhì)粒

有六個功能區(qū)：

1）致瘤區(qū)：合成植物生長素和細(xì)胞分裂素2）冠瘦堿合成區(qū)：參與冠瘦堿合成

3）冠瘦堿分解區(qū)：參與冠瘦堿分解4）Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)（tra）：參與在不同農(nóng)桿

菌中的接合轉(zhuǎn)移5）毒性區(qū)（Vir）：直接參與T-DNA的轉(zhuǎn)移和插入植物染色體

6）DNA復(fù)制區(qū)（Rep）：參與Ti質(zhì)粒DNA復(fù)制5、將致瘤區(qū)替換成目的基因即

可取出冠瘦6、根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的一般步驟：

葉盤法：從植物葉片上用打孔器取若干葉片一制備含有目的基因的Ti質(zhì)粒一將

質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌一置于含農(nóng)桿菌的培育基24小時一將葉片轉(zhuǎn)移至篩選培育基上

一誘導(dǎo)愈傷組織一誘導(dǎo)生根一移栽7、轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中的應(yīng)用：抗蟲、抗病

毒、抗真菌、抗除草劑、抗逆、改良作物品種8、轉(zhuǎn)基因植物的問題：轉(zhuǎn)基因緘

默：位置效應(yīng)、轉(zhuǎn)錄水平的基因緘默、轉(zhuǎn)錄后水平的基因緘默。選擇基因平安性

問題；對生態(tài)環(huán)境的影響動物基因工程1、從遺傳學(xué)角度劃分：遺傳性動

物基因工程、非遺傳性動物基因工程2、動物基因工程載體具備的功能：

1）為外源基因供應(yīng)進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移力氣2）為外源基因供應(yīng)在受體細(xì)胞中

復(fù)制或整合的力氣3）為外源基因供應(yīng)在受體細(xì)胞中擴增和表達(dá)的力氣3、動物

基因工程載體：質(zhì)粒型載體、病毒型載體、定向打靶載體（基因敲入基因敲除、

基因下調(diào)）4、哺乳?物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記：

遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機理

APH-氨基糖昔磷酸G418APH滅活G418

轉(zhuǎn)移酶

DHFR二氫葉酸還原氨甲喋吟DHFR突變體抗

酶氨甲喋吟

HPH-潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)潮霉素BHPH滅活潮霉

移酶素B

TK-胸腺喀噬核昔氨基喋吟TK合成TMP

激酶

XGPRT-黃噂吟鳥噪吟磷霉酚酸XGPRT合成

酸核糖轉(zhuǎn)移酶GMP

ADA-腺喋吟核甘脫腺嚓吟木酮ADA滅活Xyl-A

氨酶糖甘

5、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)：

1）物理轉(zhuǎn)染法：電擊法、顯微注射法、基因槍法、超聲波法2）化學(xué)轉(zhuǎn)染法：磷

酸鈣法、脂質(zhì)體法、原生質(zhì)體法3）生物法：病毒感染法6、轉(zhuǎn)基因動物制備程

序：

1）DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠：基因制備一促排卵一結(jié)扎、假孕鼠一取受精

卵f顯微注射DNA一胚胎移植一基因分型分析