單源抗體制備與應(yīng)用學(xué)習(xí)資料

單源抗體製備與應(yīng)用李龍湖國(guó)立中興大學(xué)獸醫(yī)學(xué)系教授95年10月12日抗體（Antibody,Ab）抗原（Antigen,Ag）半抗原（Hapten）抗原決定位（Epitope）多價(jià)抗體（PolyclonalAb）抗體溶液中含有兩種以上不同抗體分子單源（株、價(jià)）抗體（MonoclonalAb）抗體溶液中僅含一種抗體分子抗原特異性抗體（monospecificAb）屬於多價(jià)抗體抗體共同確認(rèn)特定抗原抗體特性比較特性單源抗體多價(jià)抗體抗原特異性抗體特異性高低高/低濃度高低低供應(yīng)限制無(wú)有有MAb製備流程圖1.細(xì)胞融合（脾臟細(xì)胞＋骨髓瘤細(xì)胞）抗原BALB/C小白鼠PEG融合劑培養(yǎng)液（RPMI1640,DMEM）HAT試藥骨髓瘤細(xì)胞（NS1,SP2）2.陽(yáng)性細(xì)胞株篩選與確認(rèn)ELISAIFAWesternblot雙重確認(rèn)3.細(xì)胞株化極限稀釋（Limiteddilution）餵飼細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞再確認(rèn)4.單源抗體定性Isotype鑑定免疫沈澱（和抗原特異性結(jié)合）抗體濃度生物活性測(cè)定（如中和作用）和抗原決定位結(jié)合（線狀或構(gòu)型抗原決定位）5.單源抗體生產(chǎn)與純化A細(xì)胞上清液收集及抗體純化抗體濃度低（小於1mg/ml）不含胎牛血清培養(yǎng)液BBALB/C小白鼠生產(chǎn)抗體Pristane處理，一週後注射融合瘤細(xì)胞採(cǎi)集腹水，純化抗體抗體濃度高（通常為數(shù)個(gè)mg/ml）6.細(xì)胞保存和解凍保存液含胎牛血清和抗凍劑10%DMSO連續(xù)降溫溫度越低，保存越久迅速解凍隔天觀察生長(zhǎng)情形及換液7.細(xì)胞污染或生長(zhǎng)不良處理黴漿菌污染抗生素，抗黴菌劑使用小鼠腹腔接種單源抗體應(yīng)用研究治療：濃度高，動(dòng)物使用多免疫藥理學(xué)，免疫基治療等檢驗(yàn)試劑:病原食品藥（毒）物蛋白質(zhì)等實(shí)例家禽Reovirus非結(jié)構(gòu)蛋白σNS抗原決定位分析細(xì)菌表現(xiàn)蛋白σNS免疫細(xì)胞融合抗體篩選：ELISA，間接螢光抗體染色細(xì)胞株化及確認(rèn)抗體定性Table1.PropertiesofmonoclonalantibodiesdirectedagainstthenonstructuralproteinσNSofARV-S1133*ConcentrationofasciticimmunoglobulinprecipitatedwithammoniumsulfatewasdeterminedaccordingtoBio-RadStandardAssayProcedures.N:NativeσNSPC:PolyclonalantibodyD:DenatureσNSNC:NormalcontrolserumV:Virus-infectedcellextractsC:Mock-infectedcellextracts1to10:ImmunoprecipitateswithMAbs1:47C,2:4A21,3:4A125,4:4A23,5:1F9,6:4B9,7:Gall,8:4A123,9:5F9,10:H1E1Competition(%)=()100%A:ODwithoutacompetitingAbB:ODwithahomologousAbn:ODwithacompetitorA–nA–BTable2.ResultsofcompetitivebindingassaybetweenmonoclonalantibodiestoARV-S1133nonstructuralproteinσNSCompetitionmorethan60%,++;competitionbetween35%and60%,+;competitionlessthan35%,-.EpitoperecognizedbyMAbs5F9andGa11wasnotclassified(U).1.Poly(A)-sepharose+σNS2.σNS+MAbs(1:5)3.σNS+MAbs(1:500)4.σNS+MAbs(1:5000)5.Normalserum+σNS6.σNS+anti-σNSAb7.Sepharose+σNS8.Sepharose+σNS+MAb1F9MAbcaptureELISAfordetectingAbtoARVσNSMAb1E1Antigen1.ExpressedARVσNS(eσNS)

CoatingMAb+CrudeeσNSpreparationCoatingpurifiedeσNS

2.Virus-infectedCEFlysate

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