食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)課件

第六章食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)第一節(jié)免疫學檢測技術(shù)第二節(jié)PCR檢測技術(shù)第三節(jié)轉(zhuǎn)基因食品的檢測技術(shù)食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)第一節(jié)免疫學檢測技術(shù)一、概述抗原與抗體的結(jié)合反應是一切免疫測定技術(shù)的最基本原理。在此基礎(chǔ)上結(jié)合一些生化或理化方法作為信號顯示或放大系統(tǒng)即可建立免疫測定法，如放射免疫測定法、酶免疫測定法、熒光免疫測定法等。一個成功的免疫測定法必須具備3個要素：性能優(yōu)良的抗體、靈敏和專一性的標記物和高效的分離手段。按照是否使用標記物分為標記免疫測定法和非標記免疫測定法，后者又稱為經(jīng)典免疫測定法；按反應介質(zhì)分為均相或非均相(免疫復合物需分離后檢測)免疫測定法；按反應狀態(tài)分為平衡態(tài)或非平衡態(tài)免疫測定法。按照標記物種類，標記免疫測定法又分為放射性標記測定法和非放射性標記測定法。食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)目前最常用的免疫學檢測技術(shù)如下：（1）放射免疫測定技術(shù)（2）酶免疫測定技術(shù)（3）熒光免疫測定技術(shù)（4）發(fā)光免疫測定技術(shù)（5）膠體金免疫測定技術(shù)食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)（一）ELISA的基本原理

ELISA(Enzyme-Linkedimmunosorbentassay)的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。這一方法的基本原理如下。（1）使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，井保持其免疫活性；（2）使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性．又保留酶的活性。（二）ELISA的類型

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型。1雙抗體夾心法測抗原2雙抗原夾心法測抗體3間接法測抗體4競爭法測抗體5競爭法測抗原食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)（三）ELISA的材料與試劑完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；酶標記的抗原或抗體（結(jié)合物）；酶的底物；陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；結(jié)合物及標本的稀釋液；洗滌液；酶反應終止液。1免疫吸附劑2結(jié)合物3酶的底物4洗滌液5酶反應終止液6陽性對照品和陰性對照品7參考標準品食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)三、磺胺二甲嘧啶的間接競爭ELISA檢測（一）人工完全抗原的合成（二）合成抗原的鑒定（三）抗體的制備與純化（四）標準競爭抑制曲線的制作（五）畜產(chǎn)品中SM2殘留的ELISA檢測（六）方法評價1特異性2靈敏度3準確度4精確度食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)第二節(jié)PCR檢測技術(shù)一、概述

PCR又稱聚合酶鏈式反應(Polymerasechainreaction)，是1985年由美國的KaryMullis首創(chuàng)并由美國Cetus公司開發(fā)的一項體外擴增DNA的方法。應用該方法可使極微量的特定DNA片段在幾小時內(nèi)迅速擴增至百萬倍，因而一經(jīng)問世便在短短的數(shù)年內(nèi)就得到了迅速發(fā)晨和實際應用，并在原有基礎(chǔ)上結(jié)合各種生化分子生物學技術(shù)衍生出了許多改良技術(shù)。這些技術(shù)顯示出了巨大的潛力，發(fā)揮著越來越大的作用，也正因為如此它們被譽為20世紀80年代分子生物學革命和生物技術(shù)的飛躍。（一）PCR原理

PCR是依據(jù)DNA模板的特性，模仿體內(nèi)的復制過程，在體外合適的條件下以單鏈DNA為模板，以人工設計和合成的寡核苷酸為引物，利用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶延5’-3’方向摻人單核苷酸來特異性的擴增DNA片段的技術(shù)。（二）PCR反應體系

PCR反應體系主要由引物、dNTP、DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、緩沖液、Mg2+和核酸模板組成。食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)（三）PCR反應參數(shù)在PCR反應中每輪循環(huán)的各步反應時間不應過長，以免降低TaqDNA聚合酶的活性。下面介紹PCR反應中的一些具體參數(shù)。1.變性2.退火3.延伸4.循環(huán)次數(shù)

（四）常見的PCR種類1.熱啟動PCR2.一步單管PCR3.多重PCR4.依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)5.PCR-單鏈構(gòu)想多態(tài)性分析6.mRNA差異顯示技術(shù)7.隨機引物擴增DNA多態(tài)性（RAPD）8.以微衛(wèi)星DNA介導的PCR技術(shù)9.基因間重復性回文片段（REP）和基因內(nèi)重復性一致序列（ERIC）的擴增10.擴增片段長度多態(tài)性分析（AFLP）11.限制性長度多態(tài)性分析（RFLP）12.用于RNA病毒檢測的核酸擴增技術(shù)食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)（五）PCR技術(shù)用于檢測的主要步驟（1）運用化學手段對目標DNA進行提取。（2）設計并合成引物，引物設計或合成的好壞直接決定PCR擴增的成效。（3）進行PCR擴增。（4）克隆并篩選鑒定PCR產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物進行電泳、染色，在紫外光照射下可見擴增特異區(qū)段的DNA帶．根據(jù)該帶的不同即可鑒定不同的DNA。（5）DNA序列分析食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)第三節(jié)轉(zhuǎn)基因食品的檢測技術(shù)一、概述轉(zhuǎn)基因食品又稱遺傳修飾食品（geneticallymodifiedfood），簡稱GMF或GM食品。轉(zhuǎn)基因食品大體上分為如下三類。（1）轉(zhuǎn)基因植物食品由轉(zhuǎn)基因植物如轉(zhuǎn)基因的玉米、大豆、水稻、馬鈴薯、番茄、香蕉、蘋果、菠菜等生產(chǎn)加工而成。（2）轉(zhuǎn)基因動物食品如轉(zhuǎn)基因的魚、雞、牛、羊等。目的主要通過導入外源基因或?qū)ψ陨砘蚣右孕揎梺硎故荏w動物降低結(jié)締組織交聯(lián)度、改善肉質(zhì)．或使受體生物個體肥大，或生產(chǎn)營養(yǎng)價值高的蛋、肉、乳等。（3）轉(zhuǎn)基因微生物食品如轉(zhuǎn)基因微生物發(fā)酵而制得的葡萄酒、啤酒、醬油等，此類食品是利用轉(zhuǎn)基因微生物（如轉(zhuǎn)基因酵母和酶）的作用而生產(chǎn)出來的食品。后兩類轉(zhuǎn)基因食品目前在市場上還很少。食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)（一）ELISA技術(shù)與轉(zhuǎn)基因食品檢測

l.ELISA基本原理建立在抗體抗原免疫學反應的基礎(chǔ)上。

ELISA分析法必須具備待檢測的固定相抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體、酶作用的底物三種試劑，且滿足兩個前提條件：待檢測的抗原或抗體能夠結(jié)合到不溶性載體表面并保持活性；標記酶能與抗原或抗體結(jié)合并同樣保持各自生物活性。食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)ELISA分析基本步驟如下：①將抗原（Ag）或抗體Ab結(jié)合到固相載體平板的孔里；②待測溶液的特殊抗原或抗體結(jié)合到敏化載體表面；③加入酶標抗體使之與抗原或抗體化合物相結(jié)合；④結(jié)合物通過標記酶催化底物的顏色改變而被檢測；⑤通過最后溶液的顏色深淺對待側(cè)抗原或抗體進行定量分析。2.ELISA分析法的靈敏度3.ELISA分析法的要點特異性高，獲得結(jié)果快，儀器簡單，易于操作，對人員要求不高。免卻了對樣品進行核酸提取的麻煩，同時可降低檢測的成本，由于酶既有很高的催化效率，可極大的放大反應效果，從而使測定達到很高的靈敏度和穩(wěn)定性。食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)(二）PCR技術(shù)與轉(zhuǎn)基因食品的檢測

1.PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因食品的定性檢測（1）PCR基本原理PCR技術(shù)由美國Centus公司KaryMullis發(fā)明，20世紀90年代逐漸成熟應用。簡單地說PcR就是利用核酸DNA聚合酶、引物和4種脫氧單核苷酸在試管內(nèi)完成模板DNA的快速復制．（2）PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因食品的技術(shù)關(guān)鍵和理論依據(jù)食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)（3）PCR檢測轉(zhuǎn)基因食品的基本步驟①待檢材料DNA提?。和ǔ＠肅TAB法從食品材料中提取核酸；②PCR反應：設計合適引物。PCR擴增待檢樣品中的靶標DNA；③觀測PCR產(chǎn)物：通過凝膠電泳分析將PCR產(chǎn)物展現(xiàn)；④確定結(jié)果：有時為了避免假阻性，還需要對PCR產(chǎn)物進行限制性酶切分析進行質(zhì)量控制。食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)2.PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因食品的定量檢測目前基于GMO特異DNA片段的定性PCR篩選方法已廣泛應用于GMO食品檢測．但是隨著各國有關(guān)GMO標簽法的建立和不斷完善，對食品中的GMO含量的下限已有所規(guī)定。為此，研究者在定性篩選PCR方法的基礎(chǔ)上發(fā)展了不同的定量GMO的PCR檢測方法。目前，國外較為成熟的方法主要有半定量PCR法、定量競爭PCR(QuantitativecompetitivePCR)和Real—timePCR(實時定量PCR)法等三種。食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)（1）半定量PCR法①樣品DNA的提取和定量。按常規(guī)方法提取DNA后，取部分樣品DNA在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，與已知古量的Marker比較，用計算機凝腔成像分析系統(tǒng)處理結(jié)果，以確定所提取的DNA量。例如，一般700mg的玉米粉可提取lμgDNA。②PCR反應。

a.樣品DNA的質(zhì)量分析

b.建立內(nèi)部參照反應體系

c.測定CaMV35S啟動子的定量PCR反應食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)（2）定量競爭PCR法PCR反應實質(zhì)是對特定模板DNA的指數(shù)擴增放大，而在相同的條件下，獲得DNA的量與最初模板DNA的濃度成正相關(guān)，競爭定量PCR就是依據(jù)這種擴增DNA與模板DNA之間的濃度相關(guān)性設計的?；驹硎窍葮?gòu)建含有修飾過的內(nèi)部標準DNA片段(競爭DNA)，競爭DNA由質(zhì)粒組成，帶有一個改造PCR擴增子，改造部分可以是DNA插人序列、缺失序列或者點突變，競爭DNA與待測目標DNA在同一反應管中進行PCR共擴增，因競爭DNA片段和待測DNA的大小不同，經(jīng)瓊脂糖凝膠可將兩者分開，通過比較兩種條帶的量可進行定量分析。食品質(zhì)量與安全實驗技術(shù)-6食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)（三）生物芯片與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測就目前轉(zhuǎn)基因食品檢測中常用的ELISA和PCR技術(shù)而言，最大的缺點是檢測范圍窄，效率低，無法高通量大規(guī)模地同時檢測多種樣品，尤其是對轉(zhuǎn)基因背景一無所知的情況下。對各種候選待檢基因序列或蛋白的逐一篩查幾乎是不可能的。而目前正在研