ELISA定性試驗室內質控及定性試驗性能驗證

ELISA定性試驗室內質控方法及失控后處理概要質量控制概述、目的1目前質控的難點和方法2失控后的原因分析及處理3質量控制小結4概述從1949年美國CollegeofAmericanPathologists（簡稱CAP）首先開始研究臨床實驗室室內質量控制（簡稱質控）問題，美國學者Levery和Jenning于1950年發(fā)表第一篇關于使用質控圖的實驗室室內質控，臨床檢驗實驗室的室內質控工作正式拉序幕。衛(wèi)生部臨床檢驗中心免疫質控室從1988年開始在全國范圍內開展乙肝標志物檢驗的質量評價活動。

目的臨床檢驗結果每次或每天之間不可能沒有誤差，以臨床上不造成誤診與漏診為基準，選擇合適的室內質控方法以及失控后及時處理，保證檢驗質量。所以質控的目的：保證結果的可靠性、一致性。目前質控的難點“灰區(qū)”的設定灰區(qū)(又稱盲區(qū)、域值)，簡單解釋：在Cutoff值附近上、下波動的吸光度值。它是一個范圍，不是一個具體的數(shù)值。但是，“灰區(qū)”的范圍為多少存在爭議，到目前為止全國還沒有統(tǒng)一定論，設置過寬或過窄都涉及一系列問題，如重復檢測率、報告時間、檢測人員的增加等等。有學者認為外部對照質控血清OD值以試劑盒臨界值的2～3倍為宜。國外ELISA試劑通常定義一段“灰區(qū)”的檢測范圍，結果報告“可疑”，而國內無一廠家對灰區(qū)進行設定，各醫(yī)療機構對灰區(qū)的理解也未達成共識，在報告模式上則只報告陰性和陽性，因此普遍存在結果不一致的現(xiàn)象。能否“借用”生化成熟的質控方法？定性試驗室內質控方法有其特殊性，不能照搬生化檢測常用的室內質控方法和規(guī)則。目前常用質控方法“即刻法”L-J質控圖法2025/2/118“即刻法”由于ELISA法試劑盒有效期短，批號更換較頻繁，短時間內難以積累20次質控物的檢測結果，所以對同一批號試劑做L-J質控圖易造成數(shù)據(jù)不足，難做出完整的質控圖，不能“即時”進行試驗監(jiān)控，失去質控意義。舉例1：“即刻法”計算SI上限值和下限值。

SI上=（Xmax-X）/S

SI下=（X

-Xmin）/S對照SI表，檢查是否失控，

SI上、下限≤規(guī)定值，在控；

SI上、下限>規(guī)定值，失控。

2025/2/1110SI值表

NN3sN2sNN3sN2s31.151.15122.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.662.3761.941.82152.712.4172.11.94162.752.4482.222.03172.792.4792.322.11182.822.5102.412.18192.852.53112.482.23202.882.56舉例1：“即刻法”在實際工作中，只要有3個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在，但是，當檢測數(shù)據(jù)>20次時，其質控結果會出現(xiàn)較大誤差。宋宏先等學者已指出，從理論上講“即刻法”不適用于ELISA法的室內質量控制。即使使用“即刻法”，筆者也曾經討論過，只有在一定條件下才能使用。宋宏先，張吉才，郭建華.“即刻法"室內質控存在的問題探討.檢驗醫(yī)學,2004，19(3):269-270丁海明,潘婉儀.ELISA定性實驗“即刻法"室內質控的評價與應用.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2009,24（3）：28-302025/2/1112應用“即刻法”應注意的幾個問題易受前3次質控數(shù)據(jù)影響

CV值；不能有相同的值：SI上限=1.155SI下限=0.577“遲后異常值”的出現(xiàn)剔除“極值”非“末次值”舉例2：L-J質控圖法舉例2：L-J質控圖法從圖中可以直觀判斷：所有質控值均在控（質控規(guī)則為X±3SD）“半固定”范圍法（個人觀點）以HBsAg、HBeAb為例

HBsAgS/C.O值采用質控下限1.0（固定），上限為X+3SD；HBeAb的S/C.O質控上限1.0（固定），下限為X-3SD值。（固定相當于容忍底線）丁海明，潘婉儀.ELISA定性實驗室內質控方法探討.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2011,26（3）：159-164舉例3：“半固定”范圍法（一）舉例3：“半固定”范圍法（一）70次弱陽性質控品（HBsAg），有4次S/C.O為0.9，這4次中HBsAg介于0.8-1.0之間病人標本有13份（4批次共檢測病人標本360份），經過重新檢測這13份標本（弱陽性質控品HBsAg的S/C.O為1.5），有8份HBsAg的2.0>S/C.O>1.0,用電化學發(fā)光檢測，結果與復檢結果一致。舉例3：“半固定”范圍法（二）舉例3：“半固定”范圍法（二）共70批次，有6批次HBeAbS/C.O大于1.0(介于1.0-1.4)，在這6批次中，HBeAb的S/C.O介于1.0-1.4之間的病人標本有31份（6批次共檢測病人標本540份）,乙肝血清標志物HBsAg和HBcAb陽性9例，單獨HBcAb陽性22例，經過重新檢測這31份標本（弱陽性質控品HBeAb的S/C.O為0.8），有17份HBeAb的S/C.O<1.0,將這31例血清用電化學發(fā)光檢測結果與重新檢測結果一致。定性試驗特有質控方法按照ISO15189對定性試驗質控要求：每批試驗，要求有陰性、弱陽性質控品同步檢測。質控品來源：購買、自制（要求穩(wěn)定性）方法：每批試驗均帶質控品記錄：“在控”、“失控”，無需作圖“弱陽性”的界定：目前行業(yè)比較一致的觀點2025/2/1121《醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在臨床免疫學檢驗領域的應用說明》自查/核查表(2013.4)內部質量控制體系用數(shù)值判定結果的項目如ELISA、發(fā)光技術等質控物的類型（宜選擇人血清基質，避免工程菌或動物源性等的基質）、濃度（弱陽性質控物濃度宜在2倍臨界值左右，陰性質控物濃度宜0.5倍臨界值左右）。質控位置不能固定，隨機放置。質控判定規(guī)則可以使用下列之一：

①純定性規(guī)則：陰、陽性質控物的檢測結果分別為陰性和陽性即表明在控，相反則為失控。

②用數(shù)值判定結果的項目如ELISA、發(fā)光技術等可使用Levey-Jennings質控圖。定性試驗特有質控方法失控后的處理關鍵：失控原因的分析原則：實事求是失控原因的分析與處理1.人為因素

工作人員在工作中專業(yè)技能不足、責任心不強和沒有嚴格執(zhí)行SOP等導致失控。

分析：回顧操作過程，找出失控的具體原因

處理：人員培訓、考核，內部比對后方可上崗2.不同方法間不一致:

分析：不同方法靈敏度、特異性差異處理：如果試劑都經過評價、合格，結果可以不一致,但是不能相差太遠；灰區(qū)結果要復檢。失控原因的分析與處理3.ELISA檢測主要影響因素:

①標本的質量分析：常見是離心不好，有凝塊處理：去除后重新檢測②加酶結合物前放置不同時間對競爭法的影響

分析：加樣時間太長引起（手工法影響大）處理：熟練操作，盡量在5分鐘時間內加完失控原因的分析與處理③溫育分析：溫育時間是否滿足試驗條件處理：水孵育時間與空氣孵育時間應該不同（需驗證）④洗板分析：洗板不徹底往往陽性成片出現(xiàn)或弱陽性太多處理：觀察洗板機，及時解決，標本重新檢測失控原因的分析與處理4.結果不一致另外的主要原因:“張冠李戴”

分析：抽血沒有核對相關信息處理：重新抽血5.實驗室操作時差的影響（手工操作）

分析：質控與以前的質控結果相差太遠處理：部分標本需重新檢測或復核6.邊緣效應：聚苯乙烯屬不良熱導體，使得在溫育的

時間內加熱不均勻，產生熱力學梯度，使得周邊顏色

深，中間淺（一般用水浴基本可以排除改因素影響）。

失控原因的分析與處理“灰區(qū)”結果的處理對策①建立進一步檢測的程序;②標本的重復檢測;③第二份標本的檢測(另取標本);④數(shù)周或數(shù)月后采取標本檢測;⑤可能的話,用另一個更敏感特異的方法檢測;⑥檢測標準化。失控后相應處理（舉例）以HBsAg為例（弱陽性質控品失控）

①S/CO>2.0

檢測“陽性”結果的標本，建議采用快速檢測方法（如金標）復檢，結果一致可發(fā)報告，不一致需復檢。②S/CO<1.0

檢測為“陰性”結果的標本，如果其它幾項標志物均為陰性、或HBsAb陽性，可發(fā)“陰性”報告，其余情況需復檢。③1.0<S/CO<2.0

重新檢測；HBVDNA；重新抽血復查質量保證1.人員的培訓(定期比對)2.試劑的選擇3.儀器設備的檢定和維護移液器、恒溫箱（水浴箱）、酶標儀4.樣本的選取避免溶血、脂血、凝集不全、污染標本5.樣本的保存6.室內質控、室間質評小結總之，做好質控，首先要嚴格按照操作規(guī)程進行操作，然后應選好合適的質控品和質控規(guī)則，定期總結，才能不斷提高，做好室內質控是提高實驗室檢驗質量的最基本措施。當然，單純靠室內質控還不行，還要建立健全的各項實驗室規(guī)章制度，操作人員掌握質量控制知識，做好預防性質量控制，保證標準品的質量等全過程的質量控制，從而提高檢驗質量。2025/2/1132ELISA定性試驗的性能驗證2025/2/1133性能驗證的內容定量（略）定性1.重復性

2.測量再現(xiàn)性

3.中間精密度

4.陰陽性符合率

5.檢出低限（檢出限）6.cutoff值驗證2025/2/1134重復性在一組測量條件下的測量精密度，包括相同測量程序、相同操作者、相同測量系統(tǒng)、相同操作條件和相同地點，并且在短時間段內對同一或相似被測對象重復測量。方法：采取病人新鮮血清，分高（陽性）、中（弱陽性）、低（陰性）濃度各1份，再將標本分成20份，一批檢測，計算批內陰陽性符合率。判斷標準：陰陽性符合率>80%

應用：人員：考核；實驗組的所有操作者的比對（每年）試劑：試劑批號間、貨號間，廠商間的比對2025/2/1135測量再現(xiàn)性在包括了不同地點、不同操作者、不同測量系統(tǒng)的測量條件下對同一或相似被測對象重復測量的測量精密度。留樣再測：人員間、試劑批號間、貨號間，廠商間的比對判斷標準：

陰陽性符合率>80%

應用：主要應用于人員考核、試劑的更換后評估2025/2/1136中間精密度在一組測量條件下的測量精密度，這些條件包括相同的測量程序、相同地點并且對相同或相似的被測對象在一長時間段內重復測量，但可包含其它相關條件的改變。

應用：綜合評估試劑的穩(wěn)定性2025/2/1137陰陽性符合率用來反映試劑診斷效能方法1：

用臨床診斷明確病人新鮮血清（最好包括目標標志物的陽性、弱陽性樣品）20份，健康體檢者新鮮血清20份。舉例方法2：

不同方法比對。判斷標準：

陰陽性符合率>80%

應用：試劑的評估、室內質控品濃度的選擇2025/2/1138檢出限能檢測出目標物質的最低值。方法：

檢測目標物質的定值血清，用陰性血清稀釋，至檢測S/CO值基本平均分布在1.0兩側止。然后將此稀釋濃度增加20%，分裝成60支樣品，再檢測：每天檢測5支，連續(xù)檢測12天，分別得到60個檢測結果。

判斷標準：

陰陽性符合率>80%應用：試劑的評估2025/2/1139Cutoff值的定義cutoff值：是分析物量值，用于確定結果高于還是低于臨床或分析決斷點。

cutoff值設置涉及的人群：感染疾病的人，沒有疾病的健康人和非目標疾病患者的病人。針對不同的人群應用可設置不同的cutoff值。2025/2/1140依據(jù)CNAS-CL39:2012可以選擇以下方法之一驗證a）陰性來源：選擇60份健康人新鮮血清和60份目標標志物陰性而有其他免疫標志物陽性的患者新鮮血清，共120份，分3-5批3-5天進行檢測，計算X、s，CUTOFF驗證值為：X+3s；b）陽性來源：選擇弱陽性（CUTOFF值±20%,±應均勻分布）新鮮血清或質控血清共120份，分3-5批3-5天進行檢測，計算X、s，CUTOFF值驗證值為：X-3s。2025/2/1141

第一天第二天2025/2/1142

第三天第四天2025/2/1143判斷cutoff驗證值

符合

:可沿用廠家的cutoff值例：如果試劑盒說明書cutoff為2.1×NC=0.105，cutoff驗證值為0.108

，偏倚<5%不符合：建立cutoff本實驗例：如果試劑盒說明書cutoff為0.10+NC=0.15,本實驗HbsAgcutoff驗證值為“均值+3S”=