人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊第五版

arti?cialinseminationwithdonorsemenarti?cialinseminationwithhusbanamplitudeoflateralheaddisplacementanalysisofvariancealkalinephosphatase–anti-alkalinephoARARTN-benzoyl-L-arginineethylebeat-crossfrequencycomputer-aidedspermmorphometricongenitalbilateralabsenceofthevasdeferensclusterofdetermination46(acrosomalantigen)Dulbecco’sphosphate-bethylenediaminetetra-acgameteintrafallopianHanks’balancedsaltsolhumanchorionicgonadotrophhumanimmunode?ciencyhamsteroocytepenethorseradishperoxidintracytoplasmicspermlowerlimitofquanti?cationmeanangulardisplacemmultipleanomaliesinNAnumericalapertureNPpregnantmareserumgonadotrop-nitrophenolglucopyranosidePisumsativumagglutininteratozoospermiainstraight-line(rectili2.6.1應(yīng)用伊紅-苯胺黑的精子存活率試驗(yàn)2.7.2改良Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板2.11.1在整個(gè)改良Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)2.14.3用于精子形態(tài)學(xué)分析的Shorr染色程序5.6HIV感染精液標(biāo)本的制備A4.4Ham’sF-10培養(yǎng)液206附錄6精液和宮頸黏液分析記錄表格附錄8精液分析的國家外部質(zhì)量控制項(xiàng)目精子濃度測量值Youden圖監(jiān)視器上顯示的鏡臺測微尺錄像和覆蓋在監(jiān)方框7-2確定Xbar圖的警戒限和處置限1且在提供另一種分析方法時(shí)，對其原理進(jìn)行了解釋。建議實(shí)驗(yàn)室發(fā)表研究結(jié)果差和獲得準(zhǔn)確數(shù)字結(jié)果的重要性。編輯委員會認(rèn)為，每份射出精液的總精子數(shù)比精子濃度能更準(zhǔn)確地評估睪丸功能，但是必須精確測量這份精液的間，因?yàn)槿魏尉簠?shù)的高值對生育力不可能是有害的。5%定為參考值的5和稀釋，形成了精液。精液分成數(shù)段射出。比較輸精管切除術(shù)前后的精液體積，陰道內(nèi)。與此不同，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境場所中，全部的整份精液采集在一個(gè)容器里，精子是以前射精時(shí)存留的。這種情況影響了精液中精子老化程度和精子質(zhì)量這些大量不可控制的易變因素解釋了眾所周知的精液成分個(gè)體內(nèi)變異的原志愿者，采用WHO推薦的方法檢測。對于解釋精液分析的結(jié)果，注意這種變異（DatacourtesyofScheringPloughandBayel檢測2～3份精液標(biāo)本有助于獲取基線數(shù)據(jù)（Polandetal.，1985；Bermanet30～60分鐘：l標(biāo)本容器應(yīng)該保持在20～37℃環(huán)境中，以避免精子射入容器后，由于大的選擇數(shù)份精子濃度高和活力好的精液標(biāo)本，將每份標(biāo)本的一半放在已知無毒性的容器2.2.3用于輔助生殖的精液無菌采集2.2.4用于微生物學(xué)分析的精液無菌采集注釋：注釋：從精液標(biāo)本采集到開始在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測的時(shí)間不能超過2.2.5在家采集精液l受檢者應(yīng)該記錄獲取精液的時(shí)間，并在采集后的1小時(shí)之內(nèi)將標(biāo)本送至實(shí)2.2.6使用避孕套采集精液l受檢者應(yīng)該記錄獲取精液的時(shí)間，并在采集后的1小時(shí)之內(nèi)將標(biāo)本送至實(shí)精液或許會丟失。此外，標(biāo)本可能受到細(xì)胞和細(xì)菌的污2.2.7標(biāo)本的安全處理病毒或者單純皰疹病毒，因此應(yīng)視為生物危險(xiǎn)品處理。如果標(biāo)本用于生物檢測、或者進(jìn)行精液培養(yǎng)（見2.2.4節(jié)處理標(biāo)本過程中必須使用無菌物品和無菌技術(shù)。應(yīng)該嚴(yán)格遵守附錄2所列的安全指南，良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范（goodlaboratory精液射到收集容器后很快呈現(xiàn)典型的半固體凝膠的團(tuán)塊。通常在室溫下幾2.精液反復(fù)（6～10次）緩慢地通過接在注射器上的18號鈍性針頭（內(nèi)徑2.3.3精液外觀2.3.4精液體積 評述1：精液體積小是射精管阻塞或先天性雙側(cè)輸精管缺如（CBAVDdela2.3.5精液pH值精液pH值反映了不同附性腺分泌液pH值之間的平衡，主要是堿性的精囊評述1：如果精液pH值<7.0，并伴隨體積小和精子數(shù)量少，可能存在射精管精液的液化狀態(tài)使得為精液分析而進(jìn)行代表性取樣成為問題。如果精液混當(dāng)重復(fù)取樣的結(jié)果一致時(shí)才能認(rèn)可此測定值。應(yīng)用Poisson分布來確定重復(fù)取樣精子計(jì)數(shù)結(jié)果之間的一致性（方框2-7，表2-4和2-5應(yīng)用二項(xiàng)分布確定百分率3因此，取10μl體積的精液置于一張潔凈的載222.4.3精子聚集2.4.4精子凝集精子凝集特指活動(dòng)精子以頭對頭、尾對尾或混合型相互黏附在一起的現(xiàn)象。2.4.5非精子細(xì)胞成分l比較兩個(gè)重復(fù)樣本值，核查兩值的接近程度是否可以接受。如果可以接受，速度>25μm/s界定為a級。然而，技術(shù)人員很難無偏差地精確界定前向運(yùn)動(dòng)l為防止干燥影響觀察精子活力的效果，應(yīng)在距離蓋玻片邊緣至少5mm的區(qū)樣本仍不能獲得可接受的差異。在這種情況下，計(jì)算所有重復(fù)樣如何確定所評估的百分率，不僅取決于計(jì)數(shù)到的精子數(shù)量（N還取決于一個(gè)真實(shí)的、但是未知的百分?jǐn)?shù)（p二項(xiàng)分布）。如果百分率在20%～80%，大概的標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）是p（100-p/N。超出這個(gè)范圍，更合適的方法是使用角轉(zhuǎn)換（反正弦平方根z=sin-1（p/100帶有一個(gè)1/66～76977～83884～88789～92693～95596～97498399235～650123～45～717～2324～34123456789對一個(gè)給出的平均百分率，如果重復(fù)百分率的差異小于或等于表2-1中列出的相對應(yīng)要從精液中重新取樣來制備新鮮的重復(fù)樣本。對于評估精子形態(tài)學(xué)和用伊紅-苯胺黑涂片2.5.3樣例例2重復(fù)計(jì)數(shù)200個(gè)精子評估精子活力的結(jié)果為：前向運(yùn)動(dòng)是37%和2.5.4參考值下限評述2：活的但不活動(dòng)的精子占有很大比例可能提示精子鞭毛有結(jié)構(gòu)缺陷頭更易辨別。也可以保存玻片用于再次評估和作為質(zhì)量控制用途（Bj?rndahlet2.6.1.3評定2.6.2.3評定3.如果很難分辨染成淡粉紅色的精子頭部，使用苯胺黑以提高背景的對比度2.6.3應(yīng)用低滲膨脹的精子存活率試驗(yàn)2.6.3.3評定圖2-6人精子在低滲透壓作用下的特征性形態(tài)變化的示意圖ofReproductionandFertility，70：219-228.?SocietyforReproductionandFertility每次射精的精子總數(shù)和精子濃度與妊娠時(shí)間（Slamaetal.，2002）和妊娠率 精液的精子總數(shù)可以通過精液評估中測定的精子濃度來計(jì)算。對于正常射因此精子總數(shù)可以衡量睪丸產(chǎn)生精子的能力和男性輸精管道暢通的程度。精液中精子濃度與受精率和妊娠率相關(guān)，精子濃度受精囊腺和前列腺分泌液量的影響一次性計(jì)數(shù)板得出的結(jié)果可能與改良的Neubauer計(jì)數(shù)板的結(jié)果不同。計(jì)數(shù)板的淺池是借助毛細(xì)作用填充液體，由于液體流動(dòng)可能使精子分布不均勻（Douglas-改良Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板有兩個(gè)獨(dú)立的計(jì)數(shù)池，每個(gè)計(jì)數(shù)池有一個(gè)刻在蓋在網(wǎng)格上，由計(jì)數(shù)池突起0.1mm的玻璃柱支撐著。每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)域劃分為9個(gè)2.7.3使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板網(wǎng)格2.7.4計(jì)數(shù)板的保養(yǎng)2.7.5稀釋精液的固定液2.7.6計(jì)數(shù)足夠精子的重要性評估精子數(shù)的精確性取決于所數(shù)的精子數(shù)目。在Poisson分布中，計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤（SE） 注釋：這些數(shù)值只是近似值，因?yàn)閲@估值，可信區(qū)間不總是對稱的。根據(jù)就會顯著降低。如果每個(gè)重復(fù)樣本計(jì)數(shù)的精子數(shù)目<200個(gè)，按照表2-2所給252030354045505560657075801270.7357.7450544.7640.8737.8835.4933.331.625.82022.48590958.22002506.33005.83505.340054504.75004.5在這種情況下，r=250μm，r2=62500μm2，τr2=19637如果顯微鏡物鏡為20倍，10倍目鏡孔徑為20mm目鏡，每個(gè)視野直徑約為1000μm >40450950改良Neubauer血細(xì)64～40050200改良Neubauer血細(xì)8～605050改良Neubauer血細(xì)<2<85050改良Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板或大容積所有9個(gè)網(wǎng)格l緩慢按下移液器的活塞，利用毛細(xì)作用使精液填滿計(jì)數(shù)池。在填充過程中，注釋1：一些計(jì)數(shù)池具有磨砂玻璃柱，在這種情況下，就見不到Newton環(huán)。在每個(gè)磨砂玻璃柱上加上1.5μl水，可使蓋玻片保持在位置上（Braziletal.，2.8.3評估計(jì)數(shù)池內(nèi)的精子數(shù)目應(yīng)該評估血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的兩個(gè)計(jì)數(shù)池內(nèi)的精子數(shù)目。如果兩個(gè)計(jì)數(shù)池得出l首先評估改良Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板一側(cè)計(jì)數(shù)池的中央網(wǎng)格（圖2-7，第5表2-4對于一定總數(shù)的兩個(gè)重復(fù)計(jì)數(shù)可接受的差異2425262728212～22629227～24230243～25831259～27432275～29233293～30934310～32835329～34636347～36637367～38538386～40639407～42640427～44841449～47042471～49243493～51544516～53845539～56246563～58747此，在95%可信區(qū)間內(nèi)N1-N2）/N1+N2的隨機(jī)誤差應(yīng)該<1.96。2.8.4計(jì)算精液中精子濃度建議計(jì)算并報(bào)告精液中精子濃度。盡管精液中精子濃度不是衡量睪丸功能2.8.5樣例兩者之差為245-201=44。根據(jù)表2-4可以看到超出預(yù)期隨機(jī)誤差（41所以需/兩者之差為268-224=44。根據(jù)表2-4可以看出超出預(yù)期隨機(jī)誤差（43所以需兩者之差為224-213=11。根據(jù)表2-4可/2.8.6精子濃度的參考值下限2.8.7計(jì)算每次射出精液的精子總數(shù)液里沒有精子，而不是指睪丸沒有生成精子或作為診斷和治療的依據(jù)。目前普遍接受的是無精子癥這一術(shù)語僅可使用于離心后精液標(biāo)本沉淀物中沒有發(fā)現(xiàn)精子這些標(biāo)本的處理方法主要取決于精子存在和精子活力的主觀數(shù)據(jù)是否足夠l順序地逐個(gè)視野觀察整個(gè)蓋玻片區(qū)域。觀察時(shí)，從蓋玻片的一角開始，沿x軸觀察到蓋玻片的對側(cè)；然后沿y軸下移一個(gè)視野，并在沿x軸觀察同樣2.10.3檢測非離心標(biāo)本中活動(dòng)精子數(shù)目l順序地逐個(gè)視野觀察整個(gè)蓋玻片區(qū)域。觀察時(shí)，從蓋玻片的一角開始，沿x軸觀察到蓋玻片的對側(cè)；然后沿y軸下移一個(gè)視野，并在沿x軸觀察同樣本節(jié)敘述的是不離心而確定低精子濃度的方法。另一種離心沉淀精子的方精子濃度，取樣誤差為20%。如果計(jì)數(shù)所有9個(gè)網(wǎng)格，可以估計(jì)出低至27800精如這里建議的，這些值分別相當(dāng)于500000精子/ml、55600精子/ml和2000精子/ml的未稀釋精液的精子濃度。然而，精液稀釋倍數(shù)這么低會使背景較重。仔如果在最初濕片每4nl高倍鏡視野中有2個(gè)精子，那么從理論上改良Neubauer計(jì)數(shù)池的全部9個(gè)網(wǎng)格容積為900nl，將會有450個(gè)精子。按建議1:2誤差。35～4024329～3463641～4725347～3663748～5426367～3853855～6227386～4063963～7028407～4264071～79212～22629427～4484180～89227～24230449～4704290～98243～25831471～4924320259～27432493～5154421275～29233516～5384522293～30934539～5624623310～32835563～587472.11.1.2精液中低精子濃度的計(jì)算如果每個(gè)計(jì)數(shù)池觀察到的精子少于25個(gè)，精子濃度就<56000精子/ml；當(dāng)2.11.1.4樣例子，而重復(fù)樣本2中在2個(gè)網(wǎng)格內(nèi)觀察到250個(gè)精子。4個(gè)網(wǎng)格中精子總數(shù)為200+250=450，兩者之差為250-200=50。根據(jù)表2-5可以看出超出預(yù)期隨機(jī)誤例2稀釋倍數(shù)是1:2（1+1重復(fù)樣本1在3個(gè)網(wǎng)格內(nèi)觀察到210個(gè)精子，而重復(fù)樣本2中3個(gè)網(wǎng)格內(nèi)觀察到200個(gè)精子。6個(gè)網(wǎng)格中精子總數(shù)為210+200=410，兩者之差為210-200=10。根據(jù)表2-5可以看出小于預(yù)期隨機(jī)誤2.11.1.5每次射精的精子總數(shù)的計(jì)算推薦計(jì)算和報(bào)告每次射精的精子總數(shù)，因?yàn)檫@一參數(shù)可以評價(jià)睪丸產(chǎn)生精子的能力和男性輸精管道的通暢性。精子濃度乘以整份精液體積可以得出精子利用大容量、100μm深的計(jì)數(shù)池可以提方框2-12在100μm深的大容量一次性計(jì)數(shù)板上，每個(gè)重低取樣誤差。6.順序地逐個(gè)視野觀察整個(gè)蓋玻片區(qū)域。觀察時(shí)，從蓋玻片的一角開始，沿x2.11.2.2精液中低精子濃度的計(jì)算如果顯微鏡物鏡是40倍、10倍目鏡的孔徑為20mm，每個(gè)視野直徑約為500μm2=62500μm23或大約20nl。如果顯微鏡物鏡是25倍、10倍目鏡的孔徑為25mm，每個(gè)視野直徑約為1000μm2=250000μm22=785500μm23或約80nl。如果每個(gè)計(jì)數(shù)池觀察到的精子數(shù)目少于200個(gè)，取樣誤差將超過5%。如果2.11.2.4樣例而重復(fù)樣本2在300個(gè)視野內(nèi)觀察到300個(gè)精子。600個(gè)視野內(nèi)計(jì)數(shù)的精子總數(shù)而重復(fù)樣本2在400個(gè)視野內(nèi)觀察到230個(gè)精子。800個(gè)視野內(nèi)計(jì)數(shù)的精子總數(shù)而重復(fù)樣本2中的整個(gè)計(jì)數(shù)池內(nèi)觀察到70個(gè)精子。兩個(gè)重復(fù)樣本中計(jì)數(shù)的精子如果稀釋倍數(shù)是1:2（1+1并且檢測了兩個(gè)計(jì)數(shù)池的整個(gè)區(qū)域（總?cè)莘e而重復(fù)樣本2在整個(gè)計(jì)數(shù)池內(nèi)觀察到18個(gè)精子。由于所計(jì)數(shù)到的精子總數(shù)少于2.11.2.5每次射精精子總數(shù)的計(jì)算2.12.3樣例計(jì)數(shù)200個(gè)精子觀察到39個(gè)圓細(xì)胞。兩份樣本圓細(xì)胞數(shù)目之和為21+39=60，例2重復(fù)樣本1中每200個(gè)精子觀察到24個(gè)圓細(xì)胞，而重復(fù)樣本2在每染色的精子。可以觀察到這些精子幾乎沒有頭部、中段或主段的缺陷。尾部可能有彎曲但沒有呈銳利 后有意義。和不育的正常形態(tài)精子百分率的范圍大致為0～30%，很少有精液標(biāo)本的正常形2.13.2.2精子濃度低的標(biāo)本2.13.2.3黏稠的精液標(biāo)本2.13.2.4對于碎片多或黏稠的精液標(biāo)本，以及為計(jì)算機(jī)輔助評估精子形態(tài)EA-50便必要時(shí)再次評估，而且可以用于內(nèi)質(zhì)量控制。已封片的涂片干燥后的折射率（RI1.50~已證明這種改良染色技術(shù)適用于分析精子形態(tài)學(xué)和檢查未成熟生精細(xì)胞和非精2.14.2.4封片前對已染色精液涂片的處理l使用不溶于乙醇的封片劑，將涂片從上述染色程序的第19步直接進(jìn)入到以2.14.3用于精子形態(tài)學(xué)分析的Shorr染色程序7.Shorr溶液3～5分鐘2.14.4精子形態(tài)的快速染色程序快速染色方法對于需要當(dāng)天提供分析結(jié)果的臨床實(shí)驗(yàn)室尤為適用。有幾種注釋2：如果涂片的背景染色很深，應(yīng)取一定量的該精液標(biāo)本進(jìn)行洗滌（見2.13.2.4節(jié)制備新涂片并染色。洗滌標(biāo)本可能影響精子形態(tài)，必須記錄下洗片的載玻片或蓋玻片之間時(shí)，可以獲得更清晰的圖像。這種液體通常是一種浸油錄異常形態(tài)精子的異常部位。在評估精子正常形態(tài)時(shí)，應(yīng)采用以下的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)2%～7%得到以下數(shù)據(jù)：長度的中位數(shù)為4.1μm，95%可信限區(qū)間為3.7~人類精液標(biāo)本中含有各種各樣畸形的精子。精子異常發(fā)生和一些附睪的病表2-6精子形態(tài)學(xué)彩圖中注釋的解釋頂體<40%頂體區(qū)小于精子頭部的40%退化的精子細(xì)胞顯而易見的異常上皮細(xì)胞來自男性泌尿生殖管道插入尾部插入頭部長軸的一側(cè)的位置正常類似在宮頸黏液中觀察到的精子vac1ifPPOK2ifPPOK3ifPPOK4ifPPOK5ifPPOK6ifPPOK7ifPPOK8ifPPOK9ifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOKifPPOK20ifPPOK1粗2345678粗9粗20粗21粗222324粗2526粗27粗28粗29粗30粗31粗32粗33粗3435粗36粗彩圖31粗2345678粗9粗————粗粗20212223242526272829303132粗33粗34頂體區(qū)<40%粗3536彩圖41粗23粗45粗6粗78粗9粗粗頂體區(qū)<40%20頂體區(qū)<40%12345粗6789粗彩圖61頂體區(qū)<40%粗2粗34粗567粗89頂體區(qū)<40%粗粗頂體區(qū)<40%粗20ifPPOK212223粗24粗25262712vac23粗45ifPPOK6粗78<1/39ifPPOK頂體區(qū)<40%粗頂體區(qū)<40%ifPPOK粗短20粗212223242526272829303132ifPPOK3334ifPPOK35粗36ifPPOK37ifPPOK3839404142粗43頂體區(qū)<40%4445464748ifPPOK123456ifPPOK7ifPPOK8粗9ifPPOKifPPOK20212223粗242526粗27粗28293031123頂體區(qū)<40%4ifPPOK5ifPPOK6789粗ifPPOK粗20212223242526ifPPOK2728ifPPOK293031ifPPOK32ifPPOK33ifPPOK34粗3536頂體區(qū)<40%3712ifPPOK345粗67893vacifPPOK20ifPPOK2122ifPPOK23粗24252627粗28粗2930粗31粗32粗333435粗36頂體區(qū)<40%37粗38ifPPOK39粗40頂體區(qū)<40%41粗42ifPPOK43444546粗123粗45粗6789粗頂體區(qū)<40%粗粗粗20212223242526272829303132331234ifPPOK5粗67粗89粗粗20粗21222324252627粗28ifPPOK29303132333435363738彩圖131234567892021222324彩定正常精子的比例可能已足夠了。應(yīng)用精子形態(tài)評估的示范圖片來考慮例1重復(fù)計(jì)數(shù)200個(gè)精子，正常形態(tài)精子百分率分別為182.17.3參考值下限2.17.4異常精子形態(tài)的評估對所有異常形態(tài)精子進(jìn)行分類，可能對診斷或研究工作是有益的。如果需l通過對400個(gè)精子的分析，可以得到正常和異常精子百分率（兩者相加應(yīng)等2.17.5樣例2.17.6特定精子缺陷的評估大多數(shù)人精液中存在白細(xì)胞，主要是多形核白細(xì)胞（PMN，中性粒細(xì)胞）白細(xì)胞與精液涂片的精子細(xì)胞和精母細(xì)胞區(qū)分開來（見2.14.2節(jié)）。分辨白細(xì)胞主要基于著色、核的大小及形態(tài)的不同（Johanissonetal.，2000附彩圖6、10、 大小也有助于鑒別：單核白細(xì)胞核大小的波動(dòng)范圍較大，從大約7μm的淋巴細(xì)胞，到大于15μm的巨噬細(xì)胞。這些大小僅作為參考，因?yàn)橥嘶头至褧绊懞说拇笮?。還有幾種技術(shù)可以定量測出精液中白細(xì)胞的數(shù)目。由于過氧化物酶陽性的另外，可通過更耗時(shí)和更耗資的針對普通白細(xì)胞抗原和精子抗原的免疫細(xì)計(jì)數(shù)人精液中白細(xì)胞的傳統(tǒng)方法是用組織化學(xué)方法鑒定粒細(xì)胞特有的過這項(xiàng)試驗(yàn)可用于鑒別多形核白細(xì)胞與不含過氧化物酶的多核精子細(xì)胞基礎(chǔ)。此試驗(yàn)已有商品化的試劑盒。2.18.1.2試劑442O22.18.1.4在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上檢測過氧化物酶陽性細(xì)胞的數(shù)目8.轉(zhuǎn)換至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的第二個(gè)計(jì)數(shù)池，計(jì)數(shù)與第一個(gè)計(jì)數(shù)池相同的網(wǎng)格數(shù)，2.18.1.5精液中過氧化物酶陽性細(xì)胞濃度的計(jì)算細(xì)胞/nl。2.18.1.6方法的靈敏度如果計(jì)數(shù)池中的過氧化物酶陽性細(xì)胞數(shù)少于200個(gè)，取樣誤差將超過5%。如果每個(gè)計(jì)數(shù)池中所計(jì)數(shù)的過氧化物酶陽性細(xì)胞數(shù)少于25個(gè)，濃度將2.18.1.7樣例應(yīng)報(bào)告為“樣本中未見過氧化物酶陽性細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)過少，不能準(zhǔn)確測定濃度2.18.1.8參考值目前還沒有來自有生育力男性精液中過氧化物酶陽性細(xì)胞的參考范圍。在白細(xì)胞濃度0.5×106到1.0×106/ml或總的白細(xì)胞濃度從1×106到2×106/ml精液中的抗精子抗體（ASAs）幾乎都是屬于兩類免疫球蛋白：IgA和IgG。IgM抗體由于其分子量較大，在精液中極少發(fā)現(xiàn)。IgA抗體可能比IgG抗體更具的結(jié)果與檢測血清抗體的制動(dòng)試驗(yàn)的結(jié)果相關(guān)性很好。IB試驗(yàn)和MAR試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方案有些不同，但這兩種試驗(yàn)的精子/微珠制備均在顯微鏡下檢查。微珠黏附于帶有表面結(jié)合抗體的活動(dòng)和不活動(dòng)精子上；記錄黏附有微珠活動(dòng)精子的百液中未洗滌精子表面露出的IgG或IgA相接觸。直接IgG和IgA的MAR試驗(yàn)，精子抗體陰性精液玻片作為對照。對照精液應(yīng)該分別從先前直接MAR1次。2.20.1.2評分這項(xiàng)試驗(yàn)的目的是測定黏附有微珠的活動(dòng)精子的百分率。出現(xiàn)的一個(gè)普遍1.僅評定活動(dòng)精子和測定黏附有2個(gè)或2個(gè)以上乳膠顆粒的活動(dòng)精子的百分率。2.為了獲得可接受的低取樣誤差（方框2-5每次重復(fù)測試至少評價(jià)200個(gè)活2.20.1.3參考值球蛋白的微珠直接與洗滌過的精子相混合。帶有抗人IgG或IgA的微珠結(jié)合到2.20.2.3制備精子6/ml>50 0.221～50>400.421～50<40>100.810～20>4010～20<40>102.0<10>5>2.0每次試驗(yàn)應(yīng)該包括抗精子抗體陽性精子和抗精子抗體陰性精子作為對照。2.準(zhǔn)備2張載玻片，分別滴上5μl抗精子抗體目前尚沒有來自有生育力男性精液的IB試驗(yàn)結(jié)合抗體精子的參考值。在等2.20.3間接免疫珠試驗(yàn)2.20.3.3制備供者精子4.在每次間接試驗(yàn)中，包括已知陽性和陰性的標(biāo)本用作每次間接試驗(yàn)的對照。例如，從帶有和不帶有抗精子抗體的男性中分別取得的血清，先前用間接免疫珠實(shí)驗(yàn)檢測過這些血清。已經(jīng)結(jié)扎輸精管的男性，血清如果陽性可以2.20.3.6免疫珠試驗(yàn)4.003.00200200200464646232323284212545252544646392266324C/BD/BD/A2.55主段缺陷，44個(gè)有過多殘留胞漿。重復(fù)樣本2的結(jié)果是：3有主段缺陷，36個(gè)有過多殘留胞漿。為了得出TZI，將所檢出的缺陷總數(shù)（140+即TZI=604/322=1.88。表3-2顯示就診臨床不育門診的男性以及近3年內(nèi)生育1個(gè)孩子的男性的TZI2TZI20.370.30.20.23.92.642.382.075TZI2TZI2255075902.44952.65N4930994胞、巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞，不能應(yīng)用檢測細(xì)胞過氧化物酶的鄰甲苯胺實(shí)驗(yàn)來評估單克隆抗體來檢測CD45。如果對它們感興趣的話，可以通過改變第一抗體的種t3.2.3步驟2.空氣干燥的細(xì)胞在純丙酮中固定10分鐘，或者在丙酮/甲醇/甲2.用蘇木精復(fù)染幾秒鐘；自來水沖洗，并用水性封固液封片（見2.14.2.4和1.用亮視野以200或400放大倍數(shù)檢查整個(gè)已染色區(qū)域。CD45陽性細(xì)胞（白5.計(jì)算2張涂片CD45陽性細(xì)胞數(shù)的總數(shù)和差異。3.2.3.6精液中CD45陽性細(xì)胞濃度的計(jì)算計(jì)算CD45陽性細(xì)胞的濃度與玻片上的精子濃度相關(guān)。如果N表示在同樣如果標(biāo)本中CD45陽性細(xì)胞數(shù)目比精子少（例如，<400取樣誤差會3.2.3.8樣例3.2.3.9參考值目前沒有源自生育力男性精液的CD45陽性細(xì)胞的性交后試驗(yàn)的目的是測定宮頸黏液中的活動(dòng)精子數(shù)目，以及評估性交幾小3.3.1.3對夫婦的指導(dǎo)宮頸管下部的精子數(shù)目取決于性交后的時(shí)間長度。性交后約2～3小時(shí)，宮每個(gè)顯微視野中的黏液體積取決于視野的面積(τr2，τ約為3.142，r是顯微鏡視野的用目鏡孔直徑除以物鏡放大倍數(shù)來估算。例如，40倍物鏡、10倍目鏡的孔直徑是20mm，那么顯微鏡視野的直徑約為500μm（20mm/40計(jì)數(shù)細(xì)胞的總數(shù)少，取樣誤差會高。報(bào)告從表2-2給出的10個(gè)精子的取樣誤差3.3.1.7PR=前向運(yùn)動(dòng)精子；IM=不活動(dòng)精子。性交后9～14小時(shí)子宮頸內(nèi)黏液中存在任何快速前向運(yùn)動(dòng)精子，可以排除評述2：試驗(yàn)陰性可以由選擇實(shí)驗(yàn)時(shí)間不正確所致。對有生育力的婦女來說，在月經(jīng)周期內(nèi)過早或過遲進(jìn)行試驗(yàn)也會出現(xiàn)陰性結(jié)果。有些婦女可能在整個(gè)評述1：可以從預(yù)約進(jìn)行人工授精或輔助生育取卵的月經(jīng)中期婦女獲得供者宮頸黏液。應(yīng)在自然周期或使用促性腺激素誘發(fā)排卵周期的授精前采集宮頸l體外實(shí)驗(yàn)應(yīng)在采集精液后1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，以防止脫水或溫度變化影響精液如果在宮頸管內(nèi)測試pH值，應(yīng)注意方法正確，因?yàn)閷m頸管外的宮頸黏液pH值通常低于宮頸管內(nèi)。還須注意避免陰道分泌物的污染，因?yàn)樗膒Hl精子對宮頸黏液pH值的變化甚為敏感。酸性宮頸黏液可使精子制動(dòng)，而堿性宮頸黏液可提高精子活力。宮頸黏液堿性過強(qiáng)（pH>8.5）對精子存活有不利的影響。在宮頸黏液中精子移動(dòng)和存活的最適pH值是7.0～8.5，這也是月經(jīng)中期正常宮頸黏液的pH值范圍。雖然pH值為6.0～7.0的宮頸黏液可容許精子穿透，但pH值低于6.5常抑制精子活力。如果宮頸黏液的3.3.3體外簡化玻片試驗(yàn)3.3.3.2觀察精漿，但大多數(shù)精子向?qū)m頸黏液縱深移動(dòng)，直至遇到細(xì)胞碎片或白細(xì)胞的3.3.3.3解釋1.正常結(jié)果：精子穿透入宮頸黏液相，并且>90%精子具有明確的前向運(yùn)動(dòng)。②精子沒有穿透入精液-宮頸黏液的分界面。指狀突起可能形成或尚未形3.3.4毛細(xì)管試驗(yàn)7.將穿透計(jì)放回37℃孵箱，24小時(shí)后再次檢查毛細(xì)管內(nèi)前向運(yùn)動(dòng)精子的存在3.3.4.3觀察表3-3精子穿透密度的等級順序精子平均數(shù)/LPF010～52311～20421～50567例1在1cm處的穿透密度是51～100/LPF，在4.5cm處的穿透密度是6~例2在1cm處的穿透密度是21～50/LPF，在4.5cm處的穿透密度是51~3.3.4.4解釋表3-4毛細(xì)管試驗(yàn)結(jié)果的分級順序數(shù)的減少）10——<3或或>3或2差4.5和>50和<3和>24好雖然有時(shí)感染能引起這些標(biāo)志物的分泌減少，但標(biāo)志物的總量仍可以在正常值范圍內(nèi)。感染也能造成分泌上皮不可逆的損傷，以致治療后分泌能力仍然低而且這些標(biāo)志物之間存在很好的相關(guān)性。3.4.1節(jié)敘述了鋅的分光光度檢l精囊腺的分泌能力。精液中果糖反映精囊腺功能。3.4.2節(jié)介紹了檢測果糖3.4.1.2原理鋅結(jié)合，產(chǎn)生顏色變化。3.4.1.3試劑漿于-20℃待分析。去精子的精漿標(biāo)本可與其他精漿標(biāo)本混合在一起，為將3.4.1.5計(jì)算4.重復(fù)樣本測定結(jié)果的一致性應(yīng)在10%之內(nèi)。即兩個(gè)估計(jì)值之差除以估值3.4.1.6參考下限值3.4.2.2原理3.4.2.3試劑3.顯色劑（16μmol/L苯甲酸固定液含2μmol/L吲哚溶解200mg苯甲酸于5.標(biāo)準(zhǔn)曲線：將2.24mmol/L果糖標(biāo)準(zhǔn)液加純水稀釋，得到另外4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液：漿于-20℃待分析。去精子的精漿標(biāo)本可與其他精漿標(biāo)本混合在一起，為將3.4.2.5計(jì)算4.重復(fù)樣本測定結(jié)果的一致性應(yīng)在10%之內(nèi)。即兩個(gè)估計(jì)均值之差除以估3.4.2.6參考下限值3.4.3精漿中性α-葡糖苷酶的測定3.4.3.2原理 Na2CO33.4.3.3試劑檢測精液中附睪中性α-葡糖苷酶含量有商品化試劑盒。建議使用含SDS和castanospermine的試劑盒測定精液中附睪中性α-葡糖苷酶。替代的方法是準(zhǔn)備漿于-20℃,待分析。去精子的精漿標(biāo)本可與其他精漿標(biāo)本混合在一起，為3.用正向置換式移液器重復(fù)取15μl精漿標(biāo)本分別加入2個(gè)1.5ml試管中。包3.4.3.5計(jì)算5.2份重復(fù)測定結(jié)果的一致性應(yīng)在10%之內(nèi)。例如或兩個(gè)估計(jì)值之差除以3.4.3.6參考值中性α-葡糖苷酶的參考下限值是每次射精20mU（Cooperetal.，1991and的應(yīng)用，使得精子濃度以及前向活動(dòng)精子濃度的測定成為可能（Zinamanetal.，一些還能夠檢測精子的濃度。有幾種產(chǎn)品還有半自動(dòng)化的形態(tài)學(xué)分析模塊。用在使用CASA分析儀檢測精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)時(shí)，每份標(biāo)本至少要分析200個(gè)活CASA分析儀應(yīng)當(dāng)鏈接到那些能進(jìn)行數(shù)據(jù)整合和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的計(jì)算機(jī)軟件。3.5.2.2標(biāo)本的制備每個(gè)計(jì)數(shù)池檢測6個(gè)視野（一共12個(gè)視野）通?？梢缘玫娇煽康慕Y(jié)果。每個(gè)計(jì)數(shù)池至少需檢測200個(gè)精子。采用2.5.2節(jié)中相同的質(zhì)量控制原則，用于精子活3.5.2.3CASA術(shù)語動(dòng)的時(shí)均速率。平均路徑是根據(jù)CASA儀器的算法將實(shí)際的曲線軌跡平滑3.5.3CASA用于評估精子濃度雖然使用DNA熒光染色，CASA分析儀可以精確地測定活動(dòng)精子濃度和精3.5.4計(jì)算機(jī)輔助精子形態(tài)學(xué)計(jì)量分析優(yōu)于由熟練操作人員所做的人工評估。然而，方法學(xué)上的不一致如聚焦、照明、分精子頭部和精液碎片的技術(shù)難度（尤其是精子濃度很低時(shí)Garrett&Baker，兩項(xiàng)研究已經(jīng)報(bào)道了CASMA結(jié)果與生育力評價(jià)的終點(diǎn)指標(biāo)之間的顯著相子功能調(diào)控的分子機(jī)制的深入了解，有助于發(fā)展新的精子功能診斷方法。例如，最近的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了精子核DNA致密化及其完整性對于人精子功能的重要性，該數(shù)據(jù)受到關(guān)注，一些報(bào)道也提示了精子核DNA完整性及染色質(zhì)的組裝與生育力與之類似，調(diào)控精子功能的信號傳導(dǎo)通路方面的研究進(jìn)展，對于發(fā)展精子功能診斷方法，闡明不育男性精子異常的具體機(jī)制，也有著極其重要的意義。為研究導(dǎo)致男性不育深層次的生物學(xué)基礎(chǔ)，已經(jīng)開發(fā)了一系列的功能試驗(yàn)，以融合等。氧化亞氮等。過高濃度的活性氧可以誘導(dǎo)細(xì)胞的脂類、蛋白和DNA氧化損傷，維生素E當(dāng)精子中的抗氧化系統(tǒng)被破壞，精子功能就會受損（Agarwaletal.，的信號是白細(xì)胞特異性的?？捎煤阎獢?shù)量的多形核白細(xì)胞懸液來校準(zhǔn)數(shù)據(jù)4.1.2.2試劑A4.5節(jié)。13.將配制的懸液凍存于-20℃待用。4.1.2.4檢測自發(fā)產(chǎn)生的活性氧4.1.2.5FMLP誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（a）在有白細(xì)胞污染時(shí)，加入白細(xì)胞特異性探針FMLP后，產(chǎn)生一個(gè)尖銳的活性氧信號峰。再加入Aitken）4.1.2.6酵母多糖誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生活性氧4.1.2.7PMA刺激白細(xì)胞和精子產(chǎn)生活性氧4.2人精子-卵母細(xì)胞相互作用試驗(yàn)受精失敗的沒有活性和未受精的人卵母細(xì)胞。這些試驗(yàn)可使用鹽溶液中儲存的精子結(jié)合卵透明帶后，在卵透明帶上發(fā)生生理性頂體反應(yīng)。所以，可用從卵透明帶表面取下的精子，或用人卵透明帶分離出的蛋白處理精子，來檢測卵透子癥和少精子癥的患者中，盡管一些患者的精液分析結(jié)果可能正常，但其精子在卵透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)方面存在缺陷，或者是能與卵透明帶結(jié)合，但頂體反應(yīng)較由于精子與卵透明帶結(jié)合的種屬特異性，也不可用其他靈長類的卵透明帶替代 分裝，凍存于-20℃。4.4.1.4精子涂片制備1.頂體完整（acrosome-intact，AI精子頭部一半以上熒光染色明亮且均勻頂體反應(yīng)發(fā)生在精子與卵透明帶結(jié)合之后的胞吐過程。且在精子穿透卵母4.4.2.4質(zhì)量控制生頂體反應(yīng)。由于體外孵育不及生物學(xué)過程有效，而且可能涉及多種不同機(jī)隨著精子-卵透明帶的相互作用，啟動(dòng)頂體反應(yīng)的兩個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)信號是鈣流入和胞漿堿化作用。這兩種細(xì)胞內(nèi)信號均可用二價(jià)陽離子載體人工產(chǎn)生膜促性腺激素（hCG）溶液。小瓶分裝。使用前儲存在-20℃。在性未成熟倉鼠懸液散在滴布于小的Petri培養(yǎng)皿中。用一支一次性塑料吸管，吸取經(jīng)CO25.測定精子團(tuán)中的精子濃度（見2.7和2.8節(jié)用新鮮BWW液稀釋為5×1067.用鑷子夾住子宮角最遠(yuǎn)的部分，緊貼著鑷子下方剪斷子宮末端。剪下卵巢，2平衡的BWW液。3.用火焰燒拉制成的玻璃移液管（方框4-2從透明質(zhì)酸酶液中轉(zhuǎn)移已分離出7.37℃預(yù)熱分離出的卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞移入精子懸液中。另一種方法在Bunsen火焰燈上方轉(zhuǎn)動(dòng)玻璃毛細(xì)管或巴氏移液管，用雙手分別持著玻璃管的兩端，7.記錄至少有1個(gè)精子穿透的卵母細(xì)胞百分率。記錄穿透每個(gè)卵母細(xì)胞的精圖4-4含有人精子的去卵透明帶倉鼠卵母細(xì)胞的相差顯微鏡照片寬箭頭指示胞漿中解凝聚的精子頭；窄箭頭指示在卵母細(xì)胞表面未穿透的精子Media］4.5.1.9質(zhì)量控制或流式細(xì)胞儀檢測。較新的方法包括DNA鏈斷裂的檢測，例如脫氧核糖核苷酸間。當(dāng)精子數(shù)目極低時(shí)，可能需要改變離心力和離心時(shí)間，以盡可能回收精子。對推薦的離心力和離心時(shí)間做出改變時(shí)，需要經(jīng)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)論證才可臨床應(yīng)用。5.1.3將精子與精漿和感染性微生物分離的效率染的水平也不同。用前列腺分泌的鋅作為可溶性的精漿成分標(biāo)志物，Bj?rndahl等液中鋅的濃度比密度梯度法高。2，培養(yǎng)液最好以碳酸氫鈉或類似成分作為緩沖系4.血清的用量：46ml培養(yǎng)液中添加4ml熱滅活（56℃20分鐘）的患者血清，利用精子從精液上游到培養(yǎng)液中的能力來優(yōu)選精子，這種方法稱為“上游由于是依靠精子的活力進(jìn)行的優(yōu)選，因此適合于精液中活動(dòng)精子百分率低的情4.血清的用量：46ml培養(yǎng)液中添加4ml熱滅活（56℃20分鐘）的患者血清，非連續(xù)密度梯度法能很好地將精子和其他細(xì)胞及碎片分開，是分離高質(zhì)量這種方法是將精液放置于由硅烷包被的膠體二氧化硅構(gòu)成的密度梯度液的在管底形成一個(gè)松軟的沉淀團(tuán)。應(yīng)用最廣泛的是一種簡單的兩步法非連續(xù)密度4.血清的用量：46ml培養(yǎng)液中添加4ml熱滅活（56℃20分鐘）的患者血清，一般而言，附睪穿刺取精的適應(yīng)證是梗阻性無精子癥而非睪丸生精功能低睪丸精子可用開放式活檢或經(jīng)皮穿刺活檢來獲取。睪丸精液標(biāo)本不可避免分離附著在精曲小管上的長形精子細(xì)胞（睪丸精子需要采用酶學(xué)或機(jī)械方1.將睪丸組織與膠原酶孵育（如每毫升培養(yǎng)液含0.8mg的1A型溶組織梭菌）5.7.3處理精子懸液用于ICSI射出的精液和尿液都應(yīng)該進(jìn)行分析。由于尿液體積大，需要離心濃縮標(biāo)本精子免受冷凍損傷，由此開始了應(yīng)用-79℃干冰凍存人精子（Polgeetal.，1949；性精子庫或協(xié)調(diào)性國家服務(wù)機(jī)構(gòu)的建立，精液冷凍保存在很多國家得以迅速發(fā)展人精子可以耐受一定范圍內(nèi)的冷凍和解凍速率。精子對初始階段迅速降溫（冷休克）引起的損害不很敏感，可能緣于脂質(zhì)雙層不飽和脂肪酸膜的高流動(dòng)性更能耐受冷凍保存造成的損傷。然而，冷凍保存確實(shí)對人精子功能有不良效應(yīng)，儲存已知或假定有生育力的健康供精者的精液以備將來使用。臨床或精子庫可以招募供精者，并且匿名使用他們的精子。接受精液捐贈者也可選擇了解供精者的情況。供精者l對沒有活精子或沒有適合做ICSI的長形精子細(xì)胞的不育男性，或是在治療失敗或不能應(yīng)該遵循國家及地方有關(guān)遺傳基因篩查和傳染性疾當(dāng)男性暴露于可能導(dǎo)致生育力受損的有害因素或進(jìn)行某種可能損害其生育力的治療之幾種現(xiàn)成的精子冷凍及精子庫管理方案可以采用（Mortimer，2004；Wolf，6.2.1.2將冷凍保護(hù)劑加入精液1.0.5ml塑料麥管由于其熱傳導(dǎo)性能好和易于儲存而比較常用，塑料冷凍小瓶2.將精液-GEYC的混合液吸入0.5ml塑料麥管或裝入冷凍小瓶。可在麥管上6.2.1.4精液麥管的密封6.2.1.5使用程控冷凍儀冷卻和冷凍精液分鐘降溫6℃直到-100℃。整個(gè)過程大約需要40分鐘。儀器冷凍室溫度在6.2.1.6精液的人工降溫和冷凍1.把麥管置于冰箱冷凍室（-20℃)中30分鐘，然后放入干冰（-79℃)上30分小液氮罐頸部液氮蒸氣與空氣的混合氣中，溫度-80℃~-100℃,放置15分6.2.1.7