（高清版）DB37∕T 3127-2018 禽波氏桿菌凝集試驗和間接ELISA抗體檢測技術(shù)規(guī)范

DB37DB37/T3127—2018禽波氏桿菌凝集試驗和間接ELISA抗體檢測技術(shù)規(guī)范2018-022018-02-2018-03-山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB37/T3127—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省動物疫病預(yù)防與控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：朱瑞良、魏凱、胡莉萍、黃河、楊萍萍、柳洪潔、劉紅紅、王敏。1DB37/T3127—2018禽波氏桿菌凝集試驗和間接ELISA抗體檢測技術(shù)規(guī)范本規(guī)范規(guī)定了禽波氏桿菌凝集試驗和間接ELISA抗體檢測技術(shù)的術(shù)語和定義、試劑或材料、儀器設(shè)備，利用平板凝集試驗、試管凝集試驗和間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(iELISA)檢測禽波氏桿菌抗體的方法和技術(shù)要求。本規(guī)范適用于禽場禽波氏桿菌的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和疫情監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T603化學(xué)試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB14925實驗動物環(huán)境及設(shè)施下列術(shù)語和定義適用于本文件。是波氏桿菌屬(ThegenusBordetella)四個種中的一個新種，1984年由Kersters確認。試管凝集試驗tubeagglutinationtest常用已知已定量的抗原與一系列稀釋的禽的血清混合，在保溫放置后觀察結(jié)果，以判定受檢血清有無相應(yīng)抗體及其效價。多用于半定量和定量試驗。間接酶聯(lián)免疫吸附實驗indirectenzyme-linkedimmunosorbentassay,iELISAELISA是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行的技術(shù)。iELISA是基于ELISA反應(yīng)原理設(shè)計的，包被抗原后加入待測抗體，反應(yīng)后洗板，加入酶標(biāo)二抗，反應(yīng)后再洗板，加入底物顯色。2禽波氏桿菌P5株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。4.2禽波氏桿菌陽性血清SPF雞經(jīng)免疫禽波氏桿菌抗原三次后獲得的血清，每次免疫間隔兩周。4.3陰性血清從SPF雞分離的血清。4.4待檢禽血清采集禽的血液，于37℃溫箱中靜置2h,收集析出的血清。4.5生化試劑滅菌0.5%石炭酸生理鹽水、PBS、PBST、Tris-HC1、牛血清白蛋白(BSA)、底物反應(yīng)液(具體配制方法見附錄A)。5儀器設(shè)備5.1平板(玻板、白瓷板或載玻片)。5.3接種環(huán)。5.4試管架。5.5小試管(口徑8mm～10mm)。5.6滅菌吸管(1mL)。5.7恒溫培養(yǎng)箱。5.8勻速振蕩器。5.996孔ELISA酶標(biāo)板。5.10酶標(biāo)儀(波長范圍340nm～850nm)。6禽波氏桿菌抗體檢測平板凝集試驗6.1用20μL微量移液器分別吸取三滴禽波氏桿菌P5株標(biāo)準(zhǔn)抗原于平板上。6.2再分別取禽波氏桿菌陽性抗體、陰性血清和待檢禽血清各一滴加入上述抗原液中，并用接種環(huán)混合均勻，3min～5min觀察結(jié)果。6.3平板凝集試驗可參考圖1:陽性抗原陽性抗原標(biāo)陽性血清陰性血清待檢血清3DB37/T3127—2018圖1平板凝集試驗圖示6.4.1陽性血清與陽性抗原作用后出現(xiàn)明顯凝集顆粒，陰性血清與果有效。6.4.2待檢禽血清與陽性抗原作用后出現(xiàn)明顯凝集顆粒，則判為陽性。6.4.3待檢禽血清與陽性抗原作用后均勻混濁，則判為陰性。6.4.4待檢禽血清與陽性抗原作用后介于陰陽性之間，判為可疑。7禽波氏桿菌抗體檢測試管凝集試驗通常情況下，用1:25、1:50、1:100、1:200四個稀釋度；大規(guī)模檢疫時，可只用前兩個稀釋度。7.2血清的稀釋及抗原的加入7.2.1.1為每份血清準(zhǔn)備小試管5支，第一管加入2.3mL石炭酸生理鹽水，第二管不加，第三、四、五管各加入0.5mL石炭酸生理鹽水。7.2.1.2用1mL吸管吸取被檢血清0.2mL,加入第一管中，并混合均勻，然后用吸管吸取混合液0.5mL,加入到第二管中，混合均勻，再吸取混合液0.5mL加入到第三管，同樣混勻，從中吸取0.5mL加入第四管混勻，再從第四管吸取0.5mL加入第五管，第五管混勻后棄去0.5mL。這樣稀釋之后，從第二管到第五管，血清稀釋度分別為1:12.5、1:25、1:50、1:100。7.2.2加入抗原先用含0.5%石炭酸生理鹽水，將抗原原液作20倍稀釋，然后從第二管起每管加入抗原稀釋液0.5mL (第一管不加，作血清蛋白凝固對照),振蕩均勻。加入抗原后，第二至第五管各管混合液的容積均為1mL,血清稀釋度依次變?yōu)?:25、1:50、1:100、1:200。每次試驗均須作陽性血清(Ab*)對照、陰性血清(Ab?)對照、抗原(Ag)對照。試管凝集試驗操作過程可參考表1:12345血清終稀釋度1:12.50.5%石炭酸生理鹽水0.5.0.50.5(Ab)0.5(Ab)舍去0.5待檢血清陽性抗原(1:20)4DB37/T3127—20187.2.4凝集反應(yīng)全部試管于勻速振蕩器充分振蕩后置于37℃~38℃溫箱中22h～24h,然后檢查并記錄結(jié)果。根據(jù)各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集塊的形狀，來判定凝集反應(yīng)的程度。7.3.2凝集程度判定標(biāo)準(zhǔn)100%抗原凝集(++++):抗原全部凝集，呈傘狀沉于管底，上清液完全清亮透明；75%抗原凝集(+++):約有3/4的抗原被凝集，管底凝集物與++++相同，只是上清液稍混濁；50%抗原凝集(++):約1/2的抗原被凝集，管底有中等量的凝集物，上清液混濁半透明；25%抗原凝集(+):約1/4的抗原被凝集，管底有少量凝集物，上清液完全混濁不透明；0%抗原凝集(-):抗原完全未凝集，上清液完全混濁不透明，但由于菌體抗原自然下沉，在管底中央出現(xiàn)規(guī)則的菌體自沉圓點。試管底部凝集程度判定可參考圖2:502凝集75%凝集1002凝集7.3.3凝集價判定能使50%抗原凝集的血清最高稀釋度稱為該血清凝集價(或稱滴度)。血清凝集價大于或等于1:50,判為陽性；血清凝集價為1:25,判為疑似反應(yīng)。疑似反應(yīng)者，3周后須重新采血，再次進行試驗，如果仍為疑似反應(yīng)時，可判為陽性。8禽波氏桿菌間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(iELISA)抗體檢測方法8.1.1將保存的禽波氏桿菌株接種于200mL肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜后，離心收集過夜培養(yǎng)的細菌。8.1.2用10倍體積的含有10mMMgCl?的Tris-HCl(100mMpH7.8)緩沖液懸浮，超聲波破碎(功率為500W、破碎時間60s、間隙60s、反復(fù)破碎10次)。8.1.4含全膜蛋白的沉淀，用同體積的含2%TritonX-100的Tris-MgCl?緩沖液溶解，室溫下孵育30min降解內(nèi)膜蛋白后，再進行100000×g,30min超速離心。8.1.5沉淀用緩沖液再懸浮，置-20℃保存?zhèn)溆谩?DB37/T3127—20188.2.1將提取的禽波氏桿菌OMP蛋白液與弗氏不完全佐劑混合(V:V=1:1),用漩渦振蕩器乳化，制備8.2.2選取體重1kg以上的健康雞4只，肌肉注射免疫OMP抗原，共免疫4次，每次間隔1周，OMP8.2.3最后1次免疫后7d采血，用上述試管凝集試驗檢測血清中雞抗禽波氏桿菌抗體的凝集價，凝集價高于1:256以上時采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?.3陰性血清制備8.4間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(iELISA)檢測方法8.4.1包被將禽波氏桿菌OMP用包被液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，p用PBST洗滌酶標(biāo)板5次。每孔加入封閉液(含1%BSA的PBS)200μL,置濕盒內(nèi)，4℃封閉過夜。用PBST洗滌酶標(biāo)板5次。取1孔加入1:10倍稀釋雞抗禽波氏桿菌高免血清(作陽性對照),取1孔加入1:10倍稀釋的雞陰性血清(作陰性對照);其它孔加1:10稀釋的待檢血清，置濕盒內(nèi)37℃作用60min。抗體稀釋液為1%BSA的PBS。用PBST洗滌酶標(biāo)板5次。加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG(抗體稀釋液為1%BSA的PBS),用PBST洗滌酶標(biāo)板5次。加底物反應(yīng)液，置濕盒內(nèi)37℃避光顯色20min。用2mol/L的H?SO?溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測反應(yīng)孔的OD490值。以待測孔的OD值大于或等于陰性對照孔的2倍者，即P/N大于或等于2判為陽性，重復(fù)3次計算平均值。6AA(資料性附錄)溶液的配置A.1試管凝集試驗中滅菌0.5%石炭酸生理鹽水的配制稱取9g氯化鈉(NaCl)溶于水，定容到1L,再加入5mL苯酚。配制后高壓滅菌器滅菌后使用。A.2禽波氏桿菌間接酶聯(lián)免疫吸附實驗中相關(guān)試劑的配制A.2.1磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制氯化鈉(NaCl)氯化鉀(KCL)磷酸氫二鈉(Na?HPO?)磷酸二氫鉀(KH?PO?)雙蒸水(H?O)A.2.2PBST緩沖液的配制A.2.3牛血清白蛋白(BSA)A.2.4Tris-Hcl緩沖液的配制濃鹽酸(1mol/LHC1)42.0mL雙蒸水定容至