A組輪狀病毒檢測(cè)技術(shù)及其質(zhì)量控制

A組輪狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

及其質(zhì)量控制山東省疾控中心傅忠燕博士輪狀病毒概述輪狀病毒檢測(cè)質(zhì)量控制一、輪狀病毒概述History1973Bishopetal.使用電鏡觀(guān)察到了人輪狀病毒因該病毒在電鏡下呈車(chē)輪狀，故命名為

rotavirus(rotainLatin)

傳播途徑fecal-oralroute，mainly呼吸道傳播分類(lèi)學(xué)呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬

無(wú)包膜，分節(jié)段雙鏈RNA輪狀病毒基因組及編碼蛋白HostRangeofRotaviruses感染人的輪狀病毒G/P分型至少12個(gè)G型:G1-6，G8-12，G20至少15個(gè)P型:P[1]-P[11]，P[15]，P[19],P[25],P[28]

最常見(jiàn)的組合:G1P[8],G2P[4],G3P[8],G4P[8],G9P[8]輪狀病毒監(jiān)測(cè)病原

常規(guī)監(jiān)測(cè)：A組輪狀病毒暴發(fā)監(jiān)測(cè)：A組輪狀病毒，B、C組輪狀病毒二、A組輪狀病毒檢測(cè)檢測(cè)方法

分子生物學(xué)檢測(cè)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)熒光定量RT-PCRELISA(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)輪狀病毒聚丙烯酰胺凝膠電泳ELISA原理抗原或抗體吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；抗原或抗體與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在。三個(gè)必要的試劑

固相的抗體/抗原酶標(biāo)記的抗體/抗原（HRP)酶反應(yīng)的底物（TMB）

TMB與HRP作用后產(chǎn)物顯藍(lán)色，加入終止液后藍(lán)色變黃色，吸收波長(zhǎng)450nmELISA類(lèi)型夾心法將第一種抗體（捕獲抗體）包被在固相載體上，封閉后加入待檢抗原，再加入第二種抗體（檢測(cè)抗體），檢測(cè)抗體需要經(jīng)過(guò)酶標(biāo)直接法間接法競(jìng)爭(zhēng)法A組輪狀病毒ELISA實(shí)驗(yàn)流程樣本的稀釋?zhuān)?0%~20%）將0.1g(或0.1ml)標(biāo)本加到1.5mlEP管中，加入1ml標(biāo)本處理液震蕩3次，每次10s靜置10分鐘，再以5000rpm離心5min，吸取上清進(jìn)行下一步試驗(yàn)加樣：每孔100μl稀釋后的樣本，至少設(shè)一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照，每孔100μl酶結(jié)合物（Conjugate）孵育：室溫（20-30℃）孵育60＋/－5min洗板：用稀釋的洗液（每孔約350-400μl）洗五遍顯色：在每孔內(nèi)加2滴底物（Substrate），蓋上蓋子，室溫（20-30℃）孵育10min終止：在每孔內(nèi)加2滴終止液（StopSolution），在30min內(nèi)進(jìn)行OD450讀數(shù)，參比波長(zhǎng)620~650nm流程圖

（ProSpectRotavirusKit,OXOID）

結(jié)果判定實(shí)驗(yàn)成立：陰性對(duì)照OD值小于0.150，陽(yáng)性對(duì)照OD值大于0.500臨界值：陰性對(duì)照OD450值＋0.20陽(yáng)性結(jié)果：OD450值大于臨界值的樣本判定為陽(yáng)性結(jié)果。Attention

洗板機(jī)使用前校準(zhǔn)，確保每次洗板完全充滿(mǎn)和抽干。最后一次洗板之后，將微量滴定板在吸水紙上拍打幾次，以除去孔內(nèi)殘留洗液；打開(kāi)后的96微孔板應(yīng)置于可封口的有干燥劑的口袋中貯存于2～8℃，打開(kāi)后16周內(nèi)用完；終止液中含0.46mol/L硫酸，避免接觸到皮膚和粘膜。如果終止液接觸到這些部位立即用水沖洗；底物液避光保存，不要使用已經(jīng)變藍(lán)的底物液；不同批次的試劑不能混用；避免污染；加入兩種以上的試劑，需要輕輕混勻。購(gòu)買(mǎi)：貨期8~10周輪狀病毒B、C組的檢測(cè)

熒光定量RT-PCR三、質(zhì)量控制樣本種類(lèi)糞便：5g以上，不建議肛拭子嘔吐物環(huán)境標(biāo)本？樣本采集時(shí)間標(biāo)本應(yīng)在發(fā)病5日內(nèi)采集樣本保存及運(yùn)送短期保存：4℃長(zhǎng)期保存：-20℃或-80℃運(yùn)送符合生物安全規(guī)定，附帶相關(guān)的流行病學(xué)資料A組輪狀病毒ELISA檢