飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測

1飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于含有益微生物丁酸梭菌的各種飼料添加劑中丁酸梭菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動物飼料試樣的制備T/CSWSL006-2019飼料添加劑丁酸梭菌3稀釋液、培養(yǎng)基及試劑除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑，實驗室用水采用蒸餾水或去離子水，或相當(dāng)純度的水。3.10.85%滅菌生理鹽水。3.2丁酸梭菌培養(yǎng)基：見附錄A中的A.1。3.3革蘭氏染色液：見附錄A中的A.2。3.4細(xì)菌生化鑒定試劑盒。3.5細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。3.6標(biāo)準(zhǔn)菌株：丁酸梭菌CICC10390。4設(shè)備和玻璃器皿除常用微生物實驗室設(shè)備外，其他設(shè)備和玻璃器皿如下。4.1恒溫培養(yǎng)箱：37℃±1℃。4.2漩渦震蕩器：0~2800rmp/min。4.3顯微鏡：1000倍。24.4無菌玻璃或塑料培養(yǎng)皿Φ=90mm、無菌錐型瓶、無菌玻璃或塑料涂布棒。4.5無菌吸管：1mL（具0.1mL刻度）和10mL（具0.5mL刻度）。4.6玻璃或塑料涂布棒。4.7天平：感量為0.1g、0.01g、0.0001g。4.84℃冰箱。4.9pH計：精確度0.1。4.10量筒：250mL。4.11PCR儀。4.12電泳儀。4.13凝膠成像儀。5檢驗程序丁酸梭菌檢驗程序見下圖。36采樣實驗室樣品真實，具有代表性。采樣工具，如鏟子、匙、采樣器、試管、廣口瓶、剪子等，應(yīng)是無菌器皿。采樣后，樣品應(yīng)及時送至微生物檢驗室進(jìn)行檢測。采樣數(shù)量和方式按照GB/T14699.1執(zhí)行。7試樣的制備按照GB/T20195進(jìn)行試樣的制備，樣品制備后應(yīng)及時檢驗。8操作步驟8.1檢樣制備以無菌操作稱取試樣25g(mL)，注入盛有225mL0.85%滅菌生理鹽水的錐形瓶中，均質(zhì)1min～2滅菌生理鹽水，經(jīng)充分混勻后制成1：100的稀釋液。根據(jù)樣品含菌量，按上述操作順序做進(jìn)一步的10倍系列遞增稀釋的稀釋度。8.2接種和培養(yǎng)選擇2個～3個適宜稀釋度，每個梯度3個平行，用無菌移液器分別吸取0.1mL稀釋液，接種到改良FTG培養(yǎng)基上。使用無菌的涂布棒快速、準(zhǔn)確地涂布接種于培養(yǎng)基表面，涂布棒不應(yīng)接觸平皿邊緣。每個平皿用一支無菌涂布棒。將涂布好的平皿蓋好，室溫中放置15min，使菌液浸入培養(yǎng)基，倒置于37℃士1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h士1h。8.3菌落計數(shù)培養(yǎng)后，選取菌落數(shù)在30個～300個之間的平板計數(shù)，若平板中有較大片狀菌落生長時，則不宜采用；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2以代表全皿菌落數(shù)。培養(yǎng)后的平板內(nèi)的培養(yǎng)基顏色由粉色變成淡黃色，說明厭氧培養(yǎng)環(huán)境符合丁酸梭菌的培養(yǎng)要求。典型丁酸梭菌菌落形態(tài)呈圓形，直徑1mm～3mm，白色，稍凸，不透明，形狀不規(guī)則。9確證試驗9.1概述目前商業(yè)上的生化鑒定試劑盒或生化鑒定管，如果采用的培養(yǎng)基與本標(biāo)準(zhǔn)確證試驗所用的培養(yǎng)基一致，可以按照商品說明書使用這些試劑盒或生化鑒定管進(jìn)行該項確證試驗。9.2菌種制備自平板上挑取單菌落，劃線轉(zhuǎn)接培養(yǎng)于丁酸梭菌改良FTG平板上，37℃士1℃嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)24h士1h，從平板上選取至少5個良好分離的特征菌落，轉(zhuǎn)接保存，進(jìn)行確證試驗。9.3形態(tài)觀察4自平板上挑取典型單菌落，做革蘭氏染色（附錄A.2）鏡檢。丁酸梭菌革蘭氏陽性，顯微鏡觀測菌9.4生理生化確認(rèn)試驗將挑選純化的單一菌落，用生化鑒定試劑盒或者生化鑒定管或者微生物鑒定儀按說明進(jìn)行鑒定試驗。丁酸梭菌生理生化特征見表1。表1丁酸梭菌生理生化特征+++—++——+—9.5PCR確證試驗9.5.1DNA提取9.5.2擴(kuò)增引物序列預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物大小為171bp。9.5.3PCR反應(yīng)反應(yīng)體系見表2。5表2PCR反應(yīng)體系513程序設(shè)定如下：①預(yù)變性：95℃5min；②變性：95℃30s；③退火：55℃30s④延伸：72℃30s；⑤保溫：4℃10min。步驟②至④的循環(huán)數(shù)設(shè)為35。9.5.4電泳用電泳緩沖液(1×TAE)制備1.0%瓊脂糖凝膠，加入Gelred染料。取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行點樣。用DNA分子量標(biāo)記物做參照。3V/cm～5V/cm恒壓電泳，電泳30min，電泳檢測結(jié)果用凝膠成像儀記錄并保存。9.5.5確證結(jié)果當(dāng)陽性對照孔出現(xiàn)171bp擴(kuò)增帶，陰性對照孔未出現(xiàn)目的條帶時,試驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)171bp擴(kuò)增帶，丁酸梭菌陽性；未出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶的樣品判為陰性。10結(jié)果計算與報告10.1結(jié)果計算丁酸梭菌活菌數(shù)（CFU/g（mL=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)10.2菌落計數(shù)只計算符合8.3的菌落。菌落計數(shù)后，隨機(jī)挑取5個菌落進(jìn)行鑒定，根據(jù)證實為丁酸梭菌菌落數(shù)計算出該皿內(nèi)的菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每g（mL）樣品中的菌數(shù)，按式（1）計算：式中：A—測定的丁酸梭菌菌落數(shù)，CFU/g(mL)。B—丁酸梭菌的可疑菌落總數(shù)。C—5個鑒定的菌落中確認(rèn)為丁酸梭菌的菌落數(shù)。f—稀釋倍數(shù)。6示例：含有丁酸梭菌的試料中106稀釋液在培養(yǎng)基平板上，生成的丁酸梭菌可疑菌落為100個，取5個鑒定，證實為丁酸梭菌的是4個，1g飼料中含丁酸梭菌菌數(shù)為：7培養(yǎng)基和試劑A.1改良FTG培養(yǎng)基A.1.1成分胰蛋白胨15g酵母粉5g葡萄糖10g硫代乙醇酸鈉3gL-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g氯化鈉2.5g瓊脂20g刃天青0.001g蒸餾水1000mLA.1.2制法將上述成分加于蒸餾水中，調(diào)pH值至7.0±0.2，加熱煮沸，121℃高壓滅菌15min。A.2革蘭氏染色A.2.1結(jié)晶紫染色液A.2.1.1成分結(jié)晶紫95%乙醇1%草酸銨水溶液A.2.1.2制法20mL80mL將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。A.2.2革蘭氏碘液A.2.2.1成分碘碘化鉀蒸餾水A.2.2.2制法300mL將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加人蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。A.2.3沙黃復(fù)染液A.2.3.1成分沙黃0.25g95%乙醇10mL蒸餾水90mLA.2.3.2制法將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。A.2.4染色法8將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染色1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色，約30s，水洗；滴加沙黃復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。9細(xì)菌DNA提取B.1細(xì)菌DNA提取步驟B.1.1細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌接種于5mL液體培養(yǎng)基中，37℃搖床（300rpm/min）培養(yǎng)過夜。B.1.2細(xì)菌收集取1mL培養(yǎng)物于1.5mL無菌EP管中，室溫8000rpm/min離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1mLTE（pH8.0）中或用ddH2O。B.1.3菌體裂解的蛋白酶K3μL，50℃作用3h或37℃過夜（此時菌液