磺酸鈉的抗炎活性評價(jià)及機(jī)制研究

濱州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文進(jìn)行抗炎活性及其機(jī)制的探索性研究。通過建立膠原誘導(dǎo)小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(CIA)模型和雨蛙素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)大鼠重癥急性胰腺炎(SAP)兩種動物模型，探討芒藥研發(fā)提供參考。1.雞Ⅱ型膠原聯(lián)合弗氏佐劑誘導(dǎo)C57小鼠建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型。將48只C57小鼠隨機(jī)分成空白對照組(Control)、模型組(Model)、雷公藤多苷組(TG)、 驗(yàn)期間觀察小鼠體重、攝食、足腫脹及關(guān)節(jié)炎評分，全部給藥結(jié)束后用CBA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-10的表達(dá)水平，Westernblot法測定小鼠脾臟組織中p65、p-p65、TIPE2、PCNP、IkB-α的表達(dá)水平，測定各組小鼠的臟器指數(shù)及踝關(guān)節(jié)軟骨組織的病理變化及踝關(guān)節(jié)組織中NF-kBp65陽性表達(dá)情況。2.雨蛙素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)建立重癥急性胰腺炎大鼠模型。將36只SD大鼠隨機(jī)分成空白對照組(Control),模型組(Model),地塞米松組(DXM),芒柄后收集大鼠血液、胰腺標(biāo)本，并稱量胰腺的干濕重，計(jì)算臟器系數(shù)和組織水腫度。淀粉酶(AMS)、脂蛋白脂酶(LPL)表達(dá)量，以及胰腺組織中超氧化物歧化酶(SOD)和髓過氧化物酶(MPO)的含量，H&E染色觀察胰腺病理學(xué)變化，免疫組化檢測各組大鼠胰腺組織中NF-kBp65表達(dá)，Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測各組胰腺中足腫脹程度嚴(yán)重，關(guān)節(jié)炎評分最高(p<0.01),炎癥因子TNF-a、IL-6表達(dá)升高(p<0.01),而IL-10的表達(dá)下降(p<0.01),滑膜組織破壞嚴(yán)重，顯示造模成功。與模型組比較，芒柄花素-3'-磺酸鈉給藥組小鼠體重及食物攝入量有所升高(p<0.05),足腫脹及關(guān)節(jié)炎評分降低(p<0.01);血清中炎癥因子TNF-a、IL-6表達(dá)水平降低(p<0.01),而Ⅱ-10表達(dá)上升(p<0.05);Westernblot結(jié)果顯I示脾組織中p65、p-p65、PCNP蛋白表達(dá)降低(p<0.01),而TIPE2、IkB-α蛋白表達(dá)上升(p<0.01);芒柄花素-3'-磺酸鈉給藥組小鼠的脾和胸腺指數(shù)降低(p<0.05),蘇木精-伊紅及甲苯胺藍(lán)染色顯示給藥組炎細(xì)胞浸潤和滑膜組織破壞減輕，NF-kBp65陽性表達(dá)水平下降，其中芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組顯示出更好的治療效果。2.空白對照組大鼠胰腺組織形態(tài)正常，而模型組胰腺損傷嚴(yán)重，有明顯的組織病理學(xué)改變。與模型組比較，芒柄花素-3'-磺酸鈉各個治療組減輕了胰腺病理損傷，血清中TNF-a、IL-1β、AMS、LPL水平顯著降低(p<0.01)、胰腺組織中MPO活性下降，而SOD活性上升(p<0.01),免疫組化顯示芒柄花素-3'-磺酸鈉組胰腺組織中NF-kBp65表達(dá)量降低，Westernblot結(jié)果顯示芒柄花素-3'-磺酸鈉藥物治療組能顯著降低p65、p-p65、PCNP蛋白水平，同時(shí)增加了TIPE2及IkB-α的蛋白表達(dá)水平(p<0.01),且芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組顯示出更好的治療效果。結(jié)論：芒柄花素-3'-磺酸鈉對膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠和雨蛙素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的重癥急性胰腺炎大鼠均具有良好的治療作用，顯示出芒柄花素-3'-磺酸鈉對兩種急慢性動物模型均具有抗炎作用，其作用機(jī)制之一是通過阻斷NF-KB的活化、抑制炎癥因子水平表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。關(guān)鍵詞：芒柄花素-3'-磺酸鈉；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；重癥急性胰腺炎；NF-kBp65andmechanismofsodiumformononetin-3'-sulphonate(SFS).Byestablishingwithlipopolysaccharide-inducedsevereexploretheanti-inflammatoryactivityandformononetin-3'-sulphonate,formononetin-3'-sulfonateintheresearchanddevelopmentofnewanti-inflammatory1.Therheumatoidarthritismodelwasdividedintocontrolgroup(Control),modelgroup(Model),tripterygiugroup(TG),low-dosesodiumformononetin-3'-sulmedium-dosesodiumformononetin-3'-sulfonatehigh-dosesodiumformononetin-3'-sulfonategroup(SFS-H,200mg/kg).Duringtheexperiment,themice'sbodyweight,foodintake,footswellingaobserved.AfteralladministrserumweredetectedbyCBAmethod,andp65,pmousespleentissueweredeterminedbyWesternblotmethod.TheorganinpathologicalchangesoftheanklejointcartilagetissueandtheexpressionofNF-kintheanklejointtissueofeachgroupofmicewerealsomeasured.2.Theratmodelofsevereacutepancreatitis(SAPcaeruleincombinedwithlipopolysaccharide.36SDracontrolgroup(Control),modelgroup(Model),dexamethasonegroup(DXM)sodiumformononetin-3'-sulfonategroup(SFS-L,50mg/formononetin-3'-sulfonateformononetin-3'-sulfonategroup(SFS-H,200mg/kg).Afteralltheadminisbloodandpancreassampleswerecolwasweighed,andtheorgancexpressionoftumornecrosisfactor-α(TNF-α),interleukin-1β(IL-1β),amylase(AMS),lipoproteinlipase(LPL)inserum,anmyeloperoxidase(MPO)inpancreatictissueofratsweredetectepathologicalchangesofpancreaswereobservedbyH&Estaining.TheexpressionofNF-kBp65inpancreatictissueofratsineachgroupwasdetectedbyimmunohistochemistry.TheexpressionofNF-kBpathwayrelatedproteininpancreasofratsineachgroupwasdetectedbyWesternblot.1.Comparedwiththecontrolgroup,thebodyweiggroup(Model)micedeclinedevidently(p<0.01),thedegreeoffooserious,thearthritisscorewastheIL-10wasdeclined(p<indicatingthesuccessofmodeling.Comparedwithmodelgroup(Model),bodyweight<0.05),whilefootswellingexpressionlevelsofinflammatorycytokines0.01),whiletheexpressionofIL-10increased(p<0.05).Westernblotresultsshowedthattheproteinexpressionsofp65,p-(p<0.01),whiletheproteinexpressionsofTIPE2andIkB-aweremarkedlyelevated(p<0.01).Thespleenandthymusindexesofmicetreatedwithformononetin-3'-sulfonateweredeclinewerereduced,andthelevelofNF-kBp65declinedinthetofsodiumformononetin-3'-sulfonategroupshow2.Themorphologyofthepancreasintheblankcontrohistopathologicalchanges.Comparedwiththemformononetin-3'-sulfonategrouphadmilderpanserumlevelsofTNF-α,IL-1β,AMS,andLMPOactivityinpancreatictissuedecreased,whiTheresultsofimmunohistochemicalanalysisshowedthattheexpressionofinthepancreatictissueofratsineachofsodiumformononetin-3'-sulfonategroupdecreased,andtheresultsofWesternblformononetin-3'-sulfonatecansignificantlyreducetheproteiPCNP,whileincreasingtheproteinexpressionlevelsConclusion:Sodiumformononetin-3'-sulfonatehasagcaeruleincombinedwithanimalmodels.OneofitsmechanismswasachievedbyblockingtheactivationofNF-kB,andinhibitingthelevelexpressionofinKeywords:Sodiumformononetin-3'-sulfonate;Rhepancreatitis;NF-kBp65V目錄 I 11.1天然抗炎活性成分介紹 11.2炎癥疾病的流行病學(xué)及藥物作用機(jī)制 21.3芒柄花素的研究進(jìn)展 31.3.1芒柄花素的來源 31.3.2芒柄花素的藥理作用 31.4芒柄花素-3'-磺酸鈉研究進(jìn)展 5 61.5本文研究的意義及研究內(nèi)容 6第二章芒柄花素-3'-磺酸鈉對膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠的治療作用 8 8 82.2.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器 82.2.2實(shí)驗(yàn)方法 9 2.3.1小鼠一般情況 2.3.2小鼠體重、足腫脹及關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化 12 2.3.5芒柄花素-3'-磺酸鈉對RA小鼠踝關(guān)節(jié)病理進(jìn)程及軟骨損傷程度的影響 2.3.6芒柄花素-3'-磺酸鈉對NF-KB信號通路的影響 第三章芒柄花素-3'-磺酸鈉對重癥急性胰腺炎大鼠的治療作用及機(jī)制 20 20 3.2.1實(shí)驗(yàn)材料、儀器 3.2.2實(shí)驗(yàn)方法 23 233.3.2大鼠胰腺重量系數(shù)和組織水腫度指標(biāo)檢測結(jié)果 3.3.3大鼠胰腺指標(biāo)檢測結(jié)果 253.3.4組織病理學(xué)檢測結(jié)果 3.3.5大鼠胰腺組織免疫組織化學(xué)分析結(jié)果 273.3.6Westernblot對胰腺組織中NF-kB通路中各種蛋白表達(dá)影響 28 31 34 35 39 49 50英文縮寫英文全稱中文全稱AMSAmylase淀粉酶膠原性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎CFACompleteFreund'sAd完全弗氏佐劑地塞米松二甲基亞砜DABDiaminoben二氨基聯(lián)苯胺酶聯(lián)免疫吸附測定蘇木精伊紅染色劑人核因子kB抑制蛋白αNF-KBNuclearfactorkappaBPBSPhosphate-bufferPEST序列核蛋白芒柄花素-3'-磺酸鈉腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白8樣蛋白甲苯胺藍(lán)雷公藤多苷第一章前言炎癥是機(jī)體的一種宿主防御機(jī)制，是一種重要的免疫反應(yīng)，使機(jī)體能在感染或損傷期間存活，并在有害條件下保持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。炎癥通常也被認(rèn)為是一種病理過程，在對抗有害感染或損傷方面是有益的[1,2]。大量的炎癥介質(zhì)可對身體產(chǎn)生有害影響，使身體組織滲出、變性、壞死，導(dǎo)致身體不同程度的損傷。急性或慢性炎癥可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇從而引起炎癥性疾病。由于炎癥涉及多種炎癥介質(zhì)和途徑，導(dǎo)致病理過程廣泛多變，所以炎癥的治療是臨床實(shí)踐中的重要內(nèi)容[3],從而抗炎藥物也是臨床用量最大的藥物之一。目前，臨床上常見的抗炎藥物主要是化學(xué)合成藥與天然藥物?；瘜W(xué)合成藥有甾體抗炎藥、非甾體抗炎藥等。盡管化學(xué)合成藥在許多炎癥疾病中有很好的療效，但已證實(shí)的一些合成藥物價(jià)格昂貴，很難獲得，并且在臨床上具有嚴(yán)重的副作用，可出現(xiàn)胃腸系統(tǒng)的潰瘍、血小板功能障礙等。天然藥物是臨床抗炎藥物一大來源，可通過影響多靶點(diǎn)和多水平信號通路來減輕炎癥疾病[4],中草藥作為天然藥物的重要組成部分，在抗炎方面的研究受到廣泛關(guān)注。并且中草藥便宜，容易獲得，副作用小，可作為一種新的預(yù)防和治療方法，中草藥抗炎活性成分的作用機(jī)制已在細(xì)胞、生物、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)水平上得到證實(shí)。藥用植物的藥理作用可通過直接作用或是大量代謝物組合發(fā)揮協(xié)同療效[5],大量實(shí)驗(yàn)研究表明，中草藥通過多種不同機(jī)制發(fā)揮抗炎作用。炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)是炎癥過程中的關(guān)鍵成分，因此，抑制這些靶標(biāo)是防止炎癥發(fā)生發(fā)展并減輕損害的有效方法。植物化學(xué)研究表明，中草藥中常見的植物成分具有抗炎特性，如多糖類、揮發(fā)油類、生物堿類、苯丙素類、黃酮類等。黃酮類化合物，這是多酚類物質(zhì)中含量最豐富的一類，大量研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物可以調(diào)節(jié)炎癥進(jìn)程。它們的抗炎作用來源于對不同分子靶點(diǎn)的同時(shí)作用，能夠在不同的作用模式下發(fā)揮抗炎作用。廣藿香中提取的黃酮類化合物，經(jīng)過采用角叉菜膠模型評價(jià)其體內(nèi)抗炎作用，結(jié)果顯示該化合物在體內(nèi)有抗炎作用，可改善大鼠足趾水腫、組織病理改變和運(yùn)動功能障礙[6?？傮w而言，天然活性成分的巨大可變性具有潛在的臨床意義，具有抗炎活性的天然化合物成為臨床研究的熱點(diǎn)，本課題在開展抗炎活性研究時(shí)，重點(diǎn)關(guān)注了黃酮類化合物，因其來源廣且豐富，已發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物表現(xiàn)出確切的生理活性，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本課題的研究對象即為一個黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)改造體，與原結(jié)構(gòu)相比，其水溶性大大增強(qiáng)，更適宜于藥用開發(fā)。上炎癥的存在被認(rèn)為是多種疾病發(fā)生的主要原因或其并發(fā)癥。炎癥是機(jī)體對細(xì)菌、病毒等外來物入侵的一種防御反應(yīng)。臨床表現(xiàn)有急性炎癥和慢性炎癥，急性炎癥反應(yīng)迅速，表現(xiàn)為發(fā)熱、腫脹、疼痛和功能喪失；慢性炎癥的特征通常是炎性反應(yīng)對損傷組織的實(shí)質(zhì)性破壞[7]。炎癥參與了許多疾病的病理生理過免疫炎癥性疾病等。目前，一些抗炎治療方法多采用非甾體抗炎藥治療、抗細(xì)胞因子療法和類固醇藥物治療等，但這些傳統(tǒng)治療藥物大多存在不良反應(yīng)，如胃腸道反應(yīng)、凝血障礙、過敏、腎損傷等。因此，尋找一種安全有效的藥物來控制炎癥，無論對臨床醫(yī)生還是藥物研究人員來說，一直是一個挑戰(zhàn)性的工作。隨著人類對炎癥疾病了解程度的加深，現(xiàn)在越來越多地關(guān)注于闡明炎癥緩解途徑，因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)由持續(xù)炎癥引起的疾病可以通過激活或增強(qiáng)這些途徑來治療，而不是簡單地阻止炎癥。已有研究證實(shí)，為了防止炎癥的過度發(fā)展，觸發(fā)促炎類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與重癥急性胰腺炎，作為炎癥中慢性炎癥與急性炎癥的代表性病種，在臨床上具有發(fā)病率高、用藥需求迫切等特點(diǎn)。在研究過程中，許多動物模型被用來評價(jià)具有抗炎特性的藥物。本研究中，我們選擇膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和雨蛙素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的重癥急性胰腺炎作為抗炎天然活性成分的活性篩選模型。這兩種動物模型，可以很好地重現(xiàn)急慢性炎癥疾病的病理狀態(tài)，能更好地模擬人類病理過程，以此驗(yàn)證藥物治療對急慢性炎癥的活性及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫性疾病，影響全球約1%的人口。RA以關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤、滑膜增生、骨和軟骨退化和破壞為特征，研究表明，在RA病變過程中，核因子-kB(NF-kB)信號通路在RA中具有重要作用，抑制NF-kB信號通路可以抑制炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞[9]。目前臨床中治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物主要可分為四大類：非甾體類抗炎藥、祛病抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素和中藥制劑。但現(xiàn)行的治療藥物往往會引起一些不良反應(yīng)，造成RA患者的臨床癥狀不能得到有效緩解。因此，從植物源中尋找有效、低毒的RA治療藥物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。重癥急性胰腺炎(SAP)是一種發(fā)病急促，可危及生命的急性炎癥疾病，發(fā)作時(shí)可在短時(shí)間內(nèi)即引起許多體內(nèi)平衡障礙和器官功能障礙。然而，其潛在的生理機(jī)制仍未完全確定，但已有的研究發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子可加重胰腺局部炎癥，促進(jìn)全身性炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)展。SAP并發(fā)癥包括炎癥細(xì)胞因子的過度釋放和異常反應(yīng)，如TNF-α、IL-1β等，這在之前的動物研究和臨床試驗(yàn)中2已得到證實(shí)，因此控制炎癥介質(zhì)的過度釋放可以預(yù)防過度活躍的免疫反應(yīng)，減輕炎癥損傷。核因子kB作為一種核促炎轉(zhuǎn)錄因子，對炎癥信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)至臨床中雖已有一些策略來治療炎癥性疾病，但開發(fā)新的治療方法和鑒定潛在的候選藥物對于預(yù)防和治療炎癥性疾病仍迫切且必要。1.3芒柄花素的研究進(jìn)展1.3.1芒柄花素的來源芒柄花素(Formononetin,FMN)是一種植物來源的非甾體異黃酮，主要來源于大豆、苦參、長柄花和黃芪等植物。其結(jié)構(gòu)式見圖1-1。芒柄花素具有廣泛的生物活性，已被應(yīng)用于各種醫(yī)療保健行業(yè)，藥理作用主要?dú)w因于雌激素OO1.3.2芒柄花素的藥理作用一些研究表明芒柄花素可保護(hù)神經(jīng)元免受谷氨酸或淀粉樣β蛋白引起的氧化應(yīng)激和毒性損傷，該化合物還能抑制中腦神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物和富含花素對阿爾茨海默病患者的神經(jīng)保護(hù)作用已在體內(nèi)和體外研究中得到證實(shí)花素治療。結(jié)果顯示，芒柄花素能有效抗TBI,其機(jī)制是通過激活損傷組織附近皮質(zhì)神經(jīng)元中IL-10的表達(dá)來抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，能促進(jìn)神經(jīng)元的增殖并改3 各種研究表明，芒柄花素能促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖，可阻斷、延遲或抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展，作為抗癌劑可用于治療多種癌癥。對乳腺癌[18]、胃癌具有抗腫瘤活性，在GC細(xì)胞中具有較強(qiáng)的抗增殖活性，能降低GC細(xì)胞系SGC-7901和MGC-803的活力，并抑制GC細(xì)胞的遷移和侵襲能力[21]。在小鼠后側(cè)注射HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)的體內(nèi)小鼠腫瘤模型中，芒柄花素可減少HeLa腫瘤的大小、體積和重量[22]。研究證實(shí)，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞經(jīng)芒柄花素治芒柄花素與替莫唑胺的聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)了Bax的表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，使C6細(xì)胞的遷移受到抑制，可以協(xié)同抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長[24]。研究表明，芒柄花素能抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，降低MMP-2/9蛋白表達(dá)和ERK磷酸化水平[25],另有研究發(fā)現(xiàn)高濃度的芒柄花素能抑制前列腺癌細(xì)胞的生長從而可用于癌癥治療時(shí)的抗血管生成治療[27]。迄今為止進(jìn)行的大多數(shù)研究表明，與其他化療藥物相比，芒柄花素能夠防止腫瘤細(xì)胞的增殖，而不會引起嚴(yán)(3)抗炎作用研究表明，芒柄花素可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子的激活來抑制組胺和促炎細(xì)胞因子的釋放，從而有效地改善過敏性炎癥[29]。芒柄花素可通過抑制炎癥和促進(jìn)胃黏膜血管生成改善大鼠胃潰瘍，可顯著提高血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、一氧化氮(NO)、CD34、緊密連接蛋白和p-IkBa的含量，其作用機(jī)制與NF-KB信號通路有關(guān)[30]。在一項(xiàng)研究中，首次采用脂質(zhì)組學(xué)和靶向轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合的方法，用脂多糖誘導(dǎo)的炎癥性斑馬魚模型來研究芒柄花素和芒柄花苷的抗炎作用，結(jié)果顯示，給藥后模型組體內(nèi)磷脂酰膽堿(PCs)顯著下調(diào)，藥物可通過甘油磷脂代謝顯示出抗炎作用[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花素可抑制慢性炎癥性柄花素是一種與ECs相互作用的活性成分，在ACD小鼠模型的初始階段給予芒柄花素能改善肝臟/全身膽汁酸代謝，并保護(hù)肝損傷。從機(jī)制上講，芒4研究發(fā)現(xiàn)芒柄花素和異黃酮生物蛋白A(BCA)具有增加pAkt形成并降低肝組織中核因子kB的表達(dá)以對抗利托那韋(RIT)誘導(dǎo)的肝毒性的能力，顯示出該化合物在肝毒性和其他肝細(xì)胞疾病中的治療作用[35]。另一項(xiàng)研究表明，芒柄花素可通過恢復(fù)TFEB核易位、溶酶體生物合成作用，防止慢性HFDfed小鼠和FFAs刺激的肝細(xì)胞發(fā)生肝脂肪變性，對非酒精性脂肪性肝病有潛在的治療作用[36]。芒柄花素已被研究發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的抗氧化性能，有很強(qiáng)的清除自由基的活性。給予芒柄花素治療，可以增強(qiáng)小鼠組織酶和非酶抗氧化防御來防止脂質(zhì)過氧化的形成。芒柄花素也是抑制脂質(zhì)過氧化最有效的異黃酮，因?yàn)樗哂泻軓?qiáng)的抗氧化活性[37]。研究人員對去卵巢小鼠口服給藥6個月，發(fā)現(xiàn)芒柄花素的攝入顯著增加了小鼠的子宮重量以及體內(nèi)過氧化氫酶的含量，揭示了芒柄花(6)對心血管的影響研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花素具有急性抗高血壓作用[39]。有研究表明，去氧腎上腺素誘導(dǎo)的血管收縮在經(jīng)芒柄花素治療后能使α1-腎上腺素受體的功能降低，揭示了芒柄花素對自發(fā)性高血壓大鼠有慢性降壓作用，其機(jī)制可能與下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞中的α1-腎上腺素受體、5-HT2A/1受體并上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中方式誘導(dǎo)大鼠主動脈環(huán)舒張，同時(shí)阻斷鈣通道的內(nèi)皮依賴性血管舒張[41]。有研究用芒柄花素處理ApoE缺陷的小鼠，收集小鼠主動脈、巨噬細(xì)胞和血清樣品，結(jié)果顯示芒柄花素減小了面內(nèi)和主動脈根部竇病變的大小，減弱了VSMC和巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞的形成及在動脈壁的積聚，因此，芒柄花素可以通過調(diào)節(jié)KLF4和SRA的相互作用而顯著地減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展，提示芒1.4.1芒柄花素-3'-磺酸鈉的來源花素為先導(dǎo)化合物，利用磺化反應(yīng)合成的水溶性化合物。由于芒柄花素水溶性5 磺酸鈉，則具有良好的水溶性，可滿足多種給藥途徑。新化合物的安全性對人行毒理學(xué)試驗(yàn)，未觀察到不良反應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了芒柄花素-3'-磺酸鈉用藥的安全性。芒柄花素-3'-磺酸鈉化合物結(jié)構(gòu)如圖1-2所示。o圖1-2芒柄花素-3'-磺酸鈉的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig1-2Chemicalstructure1.4.2芒柄花素-3'-磺酸鈉的藥理作用抑制細(xì)胞凋亡，并增加血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)水平，表現(xiàn)出芒柄花素-3'-磺王秋亞等[45]對高脂膳食誘導(dǎo)的大鼠模型進(jìn)行藥理活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)芒柄花酸鈉的功效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芒柄花素-3'-磺酸鈉明顯降低大鼠頸總動脈血栓重量，能顯著抑制血小板聚集，顯示出對心腦血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。炎癥作為嚴(yán)重威脅人類生命健康的一種疾病，可大致分為急性炎癥和慢性炎癥。重癥急性胰腺炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作為急慢性炎癥疾病中兩個代表性病種，臨床發(fā)病率高，而所用治療藥物卻多存在一定的安全缺陷。從天然產(chǎn)物中尋找安全并且有效的抗炎藥物仍是新藥開發(fā)的熱點(diǎn)。作為一大類重要的天然活性成6分，黃酮類化合物來源廣，并且有的黃酮類化合物在抗炎方面已經(jīng)顯示出了確切的抗炎活性。芒柄花素是一種植物來源的非甾體異黃酮，已證實(shí)具有確切的抗炎作用，但由于水溶性差，限制了其藥物應(yīng)用，而經(jīng)磺化后的芒柄花素-3'-磺酸鈉則很好地克服了這一缺陷，因此，本課題選擇了芒柄花素-3'-磺酸鈉作為了探討芒柄花素-3'-磺酸鈉的抗炎活性及抗炎機(jī)制，本研究建立兩種實(shí)驗(yàn)動物模型，分別為重癥急性胰腺炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，對應(yīng)急性炎癥和慢性炎癥，從而對芒柄花素-3'-磺酸鈉的抗炎活性和抗炎機(jī)制進(jìn)行相對綜合的探究。本論文的研究內(nèi)容主要分為兩部分：第一部分：膠原誘導(dǎo)小鼠，建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(CIA)模型，并對芒柄花第二部分：雨蛙素聯(lián)合脂多糖大鼠，建立重癥急性胰腺炎(SAP)模型，并對芒柄花素-3'-磺酸鈉進(jìn)行抗重癥急性胰腺炎的活性與作用機(jī)制研究。7第二章芒柄花素-3'-磺酸鈉對膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠2.1引言類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis,RA)作為一種病因不明確的自身免疫性、全身慢性炎癥性疾病，以慢性炎癥和免疫細(xì)胞滑膜浸潤為特征。臨床表現(xiàn)是持續(xù)性疼痛和對稱性多關(guān)節(jié)炎，有一定的致殘率，治療成本與社會成本較以及軟骨和骨的侵蝕等。轉(zhuǎn)錄因子NF-kB是RA相關(guān)炎癥TNF-α和IL-1都是NF-kB的誘導(dǎo)劑和靶標(biāo)，NF-KB使得促炎信號放大。目前臨床上用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物主要有甲氨蝶呤、氫氯喹、艾拉莫德等，以及雷公藤多苷等植物藥，但這些抗炎藥物如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝損害、生殖毒性等，因此，臨床迫切需要新的安全高效的抗炎藥物。在新藥研究的起始階段，選擇合適的動物模型以進(jìn)行藥物活性篩選是必要的一步，它可以模擬表現(xiàn)出與人類疾病狀態(tài)的相似之處，以便來預(yù)測候選藥物對人類的治療效果。本實(shí)驗(yàn)采用了膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型，該模型對RA疾病具有很好的重現(xiàn)性。本實(shí)驗(yàn)在這一模型的基礎(chǔ)上探討了芒柄花素-3'-磺酸鈉對膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠的治療作用及其抗炎機(jī)制，結(jié)果顯示芒柄花素-3'-磺酸鈉治療組具有抗RA的活性，其發(fā)揮作用的機(jī)制是通過阻斷NF-KB活化，抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，發(fā)揮抗炎效果。2.2實(shí)驗(yàn)部分48只10-12周齡的雄性C57小鼠，體質(zhì)量為18~22g,從濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司購買，生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)20140007。將實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)在煙臺拉斐爾生物科技有限公司SPF級動物房。將小鼠放在室溫20-26℃和相對濕度40%~70%的條件下，在實(shí)驗(yàn)之前至少適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境一周，并對小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組。實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)中給予食物和新鮮自來水，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。8USA);芒柄花素-3'-磺酸鈉(濱州醫(yī)學(xué)院抗衰老研究所自制);雷公藤多苷 (規(guī)格：10mg/片，批號1803137B,浙江得恩德制藥股份有限公司);HE染色液(上海丹施生物科技有限公司);中性樹膠(北京中生瑞泰科技有限公司);冰醋酸、多聚甲醛、乙醇、甲醛、二甲苯(天津市鼎盛鑫化工有限公司);抗體TIPE2(15940-I-AP,Protein(60004-1-Ig,ProteinTechnology,Inc)、NF-(S536,ProteinTechnology,Inc);羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP(ProteinTechnology,Inc);CBA小鼠/大鼠可溶性蛋白緩沖液試劑盒(CatalogNo.558266,BDCompany,USA);DAB顯色試劑盒(SW1010,Solarbio,BeiJing);甲苯胺藍(lán)染色試劑盒(E670105-050,SangonBiotech,ShangHai)。JA5003N電子分析天平、ZH-LUO-G7型足趾容積測量儀(正華生物儀器設(shè)備有限公司);石蠟切片機(jī)(LEICACompany,Germany);BX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司);M1-L213B微波爐(美的集團(tuán));101-3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);J-26SXPI離心機(jī)(美國貝克曼公司);Researchplus移液槍(EppendorfCompany,Germany);JYD-900超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(上海之信儀器有限公司);全自動組織脫水機(jī)、包埋儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司);JY-ZY5Westernblot印跡轉(zhuǎn)移電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。(1)雞IⅡ型膠原聯(lián)合弗氏佐劑誘導(dǎo)小鼠建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型第0天，將雞IⅡ型膠原溶于0.1M冰醋酸溶液中，配制成濃度為2mg/mL的溶液，放置4℃過夜。將該溶液與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻，至液將小鼠按標(biāo)準(zhǔn)操作程序固定，一人做注射操作，注射部位在小鼠尾根部1cm處沿脊柱方向皮內(nèi)注射混合乳劑。每只實(shí)驗(yàn)小鼠取4-6點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，膠原-完全弗氏佐劑混合乳劑用量共計(jì)100μL。第18天，對小鼠再次進(jìn)行免疫，同樣的方法將不完全弗氏佐劑與雞IⅡ型膠原乙酸溶液等量混合并乳化，在每只小鼠左右后足底皮內(nèi)各注射100μL的混合乳劑?？瞻讓φ战M小鼠按照上述方法注射無菌生理鹽水，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠全部處死并眼窩采血取材。9分組及給藥方法參考文獻(xiàn)[48],將48只C57小鼠隨機(jī)分成6組(n=8),分為空白對照組(Control)、模型組(Model)、陽性藥物雷公藤多苷組(TG)、和高劑量組(SFS-H,200mg/kg)。各組小鼠于實(shí)驗(yàn)開始的第21天到第49天連續(xù)腹腔注射給藥治療，每周3次，連續(xù)4周，空白對照組和模型組小鼠以等量的生理鹽水給藥，陽性組灌胃給予雷公藤多苷(10mg/kg)混懸液，每只實(shí)驗(yàn)期間，每日觀察小鼠活動、飲食、精神狀態(tài)等情況，異常情況記錄保(4)小鼠體重、足腫脹、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的測定使用電子分析天平對小鼠進(jìn)行稱重，初次免疫前測量一次，初次免疫第21天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每周測量一次，觀察小鼠體重變化情況。利用足趾腫脹測量儀對小鼠進(jìn)行足腫脹測量，初次免疫前測量一次，初次免疫第21天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每周測量一次。每只小鼠左右足連續(xù)測量三次，取平均值。觀察小鼠足腫脹程度并對其進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評分，作為評判CIA小鼠模型成功與否的標(biāo)準(zhǔn)。0=正常，1=趾關(guān)節(jié)輕度腫脹，2=腫脹延伸至踝關(guān)節(jié)和一、兩個腳趾，3=腫脹延伸至跖關(guān)節(jié)和兩個以上腳趾，4=包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪關(guān)節(jié)腫脹，采用盲法由兩名人員自21天起每周評估一次臨床評分。最后評分為小鼠左、右后足的病理評分之和。初次免疫后第49天，稱量小鼠體重，麻醉取血后處死小鼠，收集血液，離心力2500g、4℃下離心15min,-80℃保存，CBA測定血清中TNF-a、CBA操作方法如下：①標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：取出一瓶凍干小鼠Th1/Th2/Th17標(biāo)準(zhǔn)品，并將標(biāo)準(zhǔn)球體轉(zhuǎn)移到15毫升錐形聚丙烯管中，在管上貼“頂部的標(biāo)簽”,用2毫升分析法建1:128,1:256,在每根12×75mm試管中移取300mL分析稀釋劑，按順序成倍數(shù)連續(xù)稀釋。并準(zhǔn)備一個12×75mm管，作為化驗(yàn)稀釋液濃度為0pg/mL的陰②混合小鼠Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子捕捉珠：確定實(shí)驗(yàn)所需的試管數(shù)量，在混勻之前用力旋轉(zhuǎn)每個捕獲球懸浮液3到5秒，并將10μL等份的每一個捕獲球添加到標(biāo)記有混合捕獲珠的單管中。最后使用流式細(xì)胞儀設(shè)置儀器程序并測定各個因子的結(jié)果。麻醉取血之后將小鼠處死，取出并稱量小鼠的胸腺與脾臟，計(jì)算胸腺、脾實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取下小鼠雙后肢足踝關(guān)節(jié)，解剖干凈，小鼠踝骨置于10%中性福爾馬林固定溶液中24小時(shí)。垂直切踝骨，之后放在10%EDTA中進(jìn)行脫鈣后，嵌于石蠟中切成4μm厚的切片。切片采用蘇木精-伊紅(H&E)、甲苯胺藍(lán)(toluidineblue)染色，顯微鏡下觀察組織變化情況。切成5μm厚的切片。將石蠟包埋的切片在60℃下保存1小時(shí)，在二甲苯中脫蠟，之后將切片放在95%、75%的梯度乙醇中，最后放在0.05%的吐溫20磷酸鹽緩沖溶液中(PBST)。為了提取抗原，將切片放入含有0.05%吐溫20(pH=6.0)的檸檬酸緩沖液高溫煮沸3分鐘，后用過氧化物酶阻斷劑孵育5min,再用羊血清阻斷30min。隨后將切片與NF-kBp65抗體在4℃下孵育過夜，之后與HRP結(jié)合的二抗孵育，用PBST沖洗切片，在DAB底物上顯影，最后在顯微鏡下觀察染色情況。將小鼠脾組織用裂解液勻漿，置冰上孵育40min,渦旋機(jī)渦旋4次，1200r/min離心后取上清液加入上樣緩沖液，放在-80℃冰箱保存，在進(jìn)行Westernblot分析前先BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)蛋白濃度確定上樣量。等量的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS處理后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，在室溫下，將5%脫脂奶粉放入TBST緩沖液中封閉1小時(shí)后，用一抗TIPE2(1:1000)、PCNP(1:2000)對膜進(jìn)行孵育，放置4℃進(jìn)行封閉，第二天將膜拿出并用TBST洗3次，每次10分鐘，用二抗(羊抗鼠；羊抗兔)室溫下封閉2小時(shí)，之后用TBST洗3次，每次15分鐘，最后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑檢測蛋白條帶，以GAPDH為內(nèi)參，ImageJ軟件分析各條帶的灰度值。使用GraphPadPrism7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，參數(shù)數(shù)據(jù)用×±s表示。評價(jià)p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3結(jié)果2.3.1小鼠一般情況二次免疫前，各組小鼠與空白對照組小鼠在形態(tài)上無明顯差異。二次免疫后，與空白對照組相比，各組小鼠毛發(fā)光澤程度降低，踝關(guān)節(jié)腫脹，活動量和飲食減少，體重減輕，模型組(Model)小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹最明顯，活動明顯受限，精神狀態(tài)不佳，體重增長最慢，在第28天和第30天模型組2只小鼠由于炎癥程度較重而死亡。經(jīng)藥物治療后，各組小鼠的形態(tài)均有一定程度上的改其中芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組(200mg/kg)小鼠的狀態(tài)改善效果最明顯，表現(xiàn)為踝關(guān)節(jié)腫脹程度減輕，飲食增加，與陽性組(雷公藤多苷)小鼠狀態(tài)無2.3.2小鼠體重、足腫脹及關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化Figure2-1-A為各組小鼠在整個實(shí)驗(yàn)過程中體重變化情況，從小鼠體重變化可以看出，初次免疫后的28天、35天、42天、49天，模型組(Model)小鼠體重顯著低于空白對照組。雷公藤多苷組、芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組在初次免疫后28天相較模型組體重下降不明顯，各治療組在初次免疫后35天體重較模型組有一定程度上升。足趾腫脹可以反映炎癥嚴(yán)重程度，F(xiàn)igure2-1-B和C顯示小鼠左右足腫脹，與空白對照組相比，模型組小鼠足腫脹程度最嚴(yán)重，小鼠的左右足腫脹在28天起顯著升高(p<0.01)。各治療組小鼠足腫脹程度低于模型組腫脹程度(p<0.05),芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組、雷公藤多苷組足腫脹下降最明顯，可抑制RA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹。Figure2-1-D顯示模型組(Model)小鼠關(guān)節(jié)炎評分最高(p<0.01),RA小鼠接受藥物治療后顯著降低了關(guān)節(jié)炎評分(p<0.01)。A天BSFS-M##心C #D圖2-1芒柄花素-3'-磺酸鈉對RA小鼠體重、足腫脹度及關(guān)節(jié)炎評分的影響(Modelgroup,arthritisscoresofRAmice(Modelgroup,X±s.n=6:othergroups.x±s.n=8),A.group,""p<0.01;Comparedwithmodelgroup,**p<0.01,*p<0.0芒柄花素-3'-磺酸鈉對小鼠脾和胸腺指數(shù)的影響為了評價(jià)藥物是否對免疫器官造成變化，本實(shí)驗(yàn)計(jì)算了小鼠脾臟和胸腺指數(shù)，其結(jié)果如表格2-1所示，模型組(Model)小鼠中，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著高于空白對照組(p<0.01),相比較模型組，藥物處理RA小鼠后，陽性藥物組(雷公藤多苷)及芒柄花素-3'-磺酸鈉中高劑量組，脾臟指數(shù)降低明顯(p<0.01),芒柄花素-3'-磺酸鈉低劑量組脾臟指數(shù)也有所下降(p<0.05);陽性藥物組(雷公藤多苷)及芒柄花素-3'-磺酸鈉中劑量組小鼠胸腺指數(shù)也有所下降(p<0.05),芒柄花素-3'-磺酸鈉低高劑量組減少趨勢不明顯。CIAmice(Modelgroup,X±s,n=6;ot2.3.4芒柄花素-3'-磺酸鈉對小鼠血清中炎癥因子表達(dá)的影響CBA結(jié)果如圖2-2所示，與空白對照組相比較，模型組(Model)中TNF-α和IL-6水平上升明顯(p<0.01),而IL-10則明顯下降(p<0.01)。與模型組相比較，陽性藥物(雷公藤多苷)及芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組能明顯降低TNF-c和IL-6的表達(dá)水平(p<0.01),而芒柄花素-3'-磺酸鈉低劑量組對水平下降(p<0.01),而對TNF-α的降低效果不明顯。芒柄花素-3'-磺酸鈉中劑量組中IL-10的表達(dá)顯著升高(p<0.01),陽性藥物(雷公藤多苷)及芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組中IL-10的表達(dá)也有所升高(p<0.05),芒柄花濱州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文ACBCgroup,x±s.n=6;othergroups,X±s.n=8),A、B、C分別代表TNF-α,IL-6和IL-10Figure2-2Effectsofsodiumformononetin-3'-sulfonateontheexpressionlevelsofTNF-α.IL-6andIL-10inserumofmice(Modelgroup,xB、CrepresentTNF-a.IL-6andIL-10expressionlevegroup;**p<0.01,*p<0.05vsModelgroup.如圖2-3(a)顯示H&E染色結(jié)果，小鼠在空白對照組中踝關(guān)節(jié)組織完整，骨結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，而模型組(Model)小鼠組織結(jié)構(gòu)異常，關(guān)節(jié)外出現(xiàn)組織損傷和關(guān)節(jié)間隙紊亂，滑膜增生，可觀察到骨侵蝕，并出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤及血管翳生成。與RA組相比，雷公藤多苷組(TG)及芒柄花素-3'-磺酸鈉(SFS)各劑量組踝關(guān)節(jié)組織學(xué)結(jié)構(gòu)破壞程度減輕，滑膜輕度增生，炎癥細(xì)胞浸潤少，軟骨破壞程度減輕，其中芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組炎癥降低效果最明顯，與雷公藤多苷組差異不明顯。甲苯胺藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)定性檢測踝關(guān)節(jié)組織中軟骨蛋 白聚糖含量，結(jié)果如圖2-3(b)所示，與空白對照組相比，模型組小鼠關(guān)節(jié)意味著軟骨發(fā)生了嚴(yán)重?fù)p傷。而雷公藤多苷組及芒柄花素-3'-磺酸鈉各劑量組甲苯胺藍(lán)染色相對完整，染色深，軟骨的破壞程度減輕，意味著治療組改善了軟骨損傷及病理變化嚴(yán)重程度。其中芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量治療組效果最SFS-HControl圖2-3芒柄花素-3'-磺酸鈉對RAControl(a):顯微鏡顯示蘇木精-伊紅染色踝關(guān)節(jié)(放大40倍，比例尺為200μm;放大100倍，比例尺為100μm);圖中字母用C標(biāo)示關(guān)節(jié)示骨；(b)甲苯胺藍(lán)染色法對踝關(guān)節(jié)組織石蠟包埋切片染色(比例尺為50μm)。Figure2-3Effectofsodiumformononetin-3'-sulfonateonanklejointpatandcartilagedamagedegreeofRAmice(a)PhotomicrographsforanklejoinstainedwithH&E(Magnification40×.scalebars=20bars=100μm).C:articularcartilage.J:jointspace,Syn:synovialmembrane.B:bone.(b)Paraffin-embeddedsectionofanklejointtissuewasstainedwithtoluidinbars=50μm).轉(zhuǎn)錄因子NF-kB是RA相關(guān)炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。TNF-α和IL-1都是NF-KB的誘導(dǎo)劑和靶標(biāo)，NF-kB一旦出現(xiàn)則將使促炎信號放大，進(jìn)一步增大炎癥反應(yīng)。為了進(jìn)一步探討藥物作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了免疫印跡(Westernblot)和免疫組織化學(xué)(IHC)分析，來探討NF-KB信號通路是否參與這一進(jìn)程。Westernblot結(jié)果如圖2-4(a)所示，與空白對照組相比較，模型組小鼠脾組織中TIPE2、IkB-α水平降低、PCNP而與模型組相比，芒柄花素-3'-磺酸鈉組明顯增強(qiáng)了TIPE2、IkB-α的表達(dá)，并降低了PCNP、p65及p-p65的表達(dá)水平(p<0.01)。這些結(jié)果表明芒柄花素-3'-磺酸鈉抑制CIA小鼠模型中NF-kB的激活。免疫組織化學(xué)(IHC)分析，如圖2-4(b)所示，踝關(guān)節(jié)染色褐色代表NF-kBp65陽性表達(dá)，空白對照組無褐色表達(dá)，而模型組褐色表達(dá)相比空白對照組明顯升高，芒柄花素-3'-磺酸鈉和雷公藤多苷組與模型組比較大大降低了褐色率，與2-4(a)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了芒柄花素-3'-磺酸鈉可通過阻斷NF-kBp65信號通路活化來減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度。 p-po5p65NF-xBp65圖2-4芒柄花素-3'-磺酸鈉對NF-kB信號通路的影響(x±s,n=3)(a)蛋白質(zhì)印跡檢測脾臟中IkB-α,TIPE2.p-p65,p65和PCNP的水平。(b)踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-kBp65的免疫組織化學(xué)染色(比例尺為50μm)。與空白對照組相比，#“p<Figure2-4Theeffectofsodiumformononetin-3'-sulfon=3)(a)LevelsofIkB-α.TIPE2.p-p65,p65,andPCNPinspleenwereanalyzedbyWesternblot.(b)ImmunohistochemicalstainingofNF-kBp65inthesynovialtissuesofanklejoints(scalebars=50μm).""p<0.01group;**p<0.01,*p<0.05vsNF-KB信號通路是RA中與炎癥和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的經(jīng)典通路，當(dāng)體內(nèi)巨噬細(xì)胞感染并被激活時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子NF-KB磷酸化并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，誘導(dǎo)產(chǎn)生與炎癥相關(guān)的靶基因。TNF-α和IL-6是參與RA并能夠促進(jìn)炎癥發(fā)展的炎細(xì)胞因子，而抗炎細(xì)胞因子IL-10在RA患者中的表達(dá)減少。在膠原誘導(dǎo)小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型上，與模型組比較，芒柄花素-3'-磺酸鈉治療組的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯改善，關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低，體重下降及足腫脹程度減輕，血清中促炎因子TNF-α、IL-6的表達(dá)降低，而抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)水平升高，小鼠脾和胸腺系數(shù)相比模型組也有一定程度降低。蘇木精-伊紅和甲苯胺藍(lán)染色顯示芒柄花素-3'-磺酸鈉改善了小鼠踝關(guān)節(jié)病理損傷。Westernblot結(jié)果顯示，芒柄花素-3'-磺酸鈉組明顯增強(qiáng)了TIPE2、IkB-α的表達(dá)，并降低了PCNP、p65及磷酸化p65(p-p65)的表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果顯示芒柄花素-3'-磺酸鈉給藥組中NF-KBp65陽性表達(dá)明顯降低。其中芒柄花以上結(jié)果均提示，芒柄花素-3'-磺酸鈉顯示出了抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的活性，對膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠具有明顯的治療作用，其機(jī)制之一是通過調(diào)控NF-kB信號通路中TIPE2、PCNP、p65、p-p65蛋白表達(dá)，減少IkB-α降解，并抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，來發(fā)揮抗炎效果。第三章芒柄花素-3'-磺酸鈉對重癥急性胰腺炎大鼠的治療3.1引言重癥急性胰腺炎(SAP)是一種伴有全身炎癥和多器官功能障礙的嚴(yán)重疾病，其特點(diǎn)是以胰腺水腫、腺泡細(xì)胞出血、壞死和嚴(yán)重炎癥為特征，死亡率在15-30%之間。雖然SAP的潛在機(jī)制被廣泛研究，但其根本機(jī)制仍不清楚，但從表觀來看，SAP引起的胰腺損傷可導(dǎo)致一些促炎細(xì)胞因子的大量釋放，其中腫瘤壞死因子-a(TNF-a)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)被認(rèn)為是最重要的炎癥反應(yīng)指標(biāo)，在SAP的病程進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明NF-KB在SAP的發(fā)生和預(yù)后中起著至關(guān)重要的作用，NF-KB是SAP發(fā)病機(jī)制中早期的、主要的促炎介質(zhì)激活因子[49-51]。近年來，一些標(biāo)準(zhǔn)的治療策略包括預(yù)防性抗生素，積極的液體復(fù)蘇，早期清創(chuàng)等治療手段，但效果不明顯，因此迫切需要一種新的療效高、副作用少的治療干預(yù)方法來改善SAP患者的預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)探討了芒柄花素-3'-磺酸鈉對雨蛙素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的大鼠重癥急性胰腺炎的治療效果，并對其抗炎機(jī)制進(jìn)行研究。3.2.1實(shí)驗(yàn)材料、儀器36只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，6-8周齡，體質(zhì)量180-200g,購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)20140007。所有動物均按要求進(jìn)行檢疫，飼養(yǎng)于煙臺拉斐爾生物科技有限公司SPF級動物房。實(shí)驗(yàn)前將大鼠放在室溫25℃和相對濕度40%~70%的環(huán)境中飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)中給予食物和新鮮自來水，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。雨蛙素多肽、脂多糖(上海源葉生物科技有限公司);羧甲基纖維素鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);醋酸地塞米松片(批號20180501,武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司);大鼠IL-1β、TNF-α、AMS、LPL、SOD、MPOELISA檢測試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司);其他藥物試劑同2.2.1(2)中所用試劑。TG-18W離心機(jī)(愛來寶醫(yī)療科技有限公司);全自動組織脫水機(jī)、包埋儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司);ECLIPSEE100倒置顯微鏡(日本尼康);M1-L213B微波爐(美的集團(tuán))。生理鹽水中，振蕩3h,使其全部溶解，備用。大鼠隔夜禁食不禁水后，腹腔注射雨蛙素溶液(1mL/200g),1小時(shí)1將36只SD大鼠隨機(jī)分為6組(n=6)。分為空白對照組(Control),模和高劑量治療組(SFS-H,200mg/kg),各治療組用0.5%羧甲基纖維素鈉 每只大鼠給藥體積2mL,每3個小時(shí)1次，連續(xù)4次?？瞻讓φ战M和模型組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠并稱重，自腹主動脈收集血液，并將收集好的血樣在室溫靜置30min后，離心力2500g,離心15min,用移液槍吸取上清后放置于-20℃冰箱備用，按ELISA試劑盒操作測定血清中TNF-α、IL-1β、AMS、LPL的濃度。(4)大鼠胰腺重量系數(shù)和胰腺組織水腫度測定大鼠取血后，剖腹取出完整胰腺組織，觀察胰腺組織病理改變，置于生理鹽水中洗滌，用濾紙吸干胰腺表面水分，電子天平對其稱重，計(jì)算胰腺濕重/體質(zhì)量，即為大鼠胰腺重量系數(shù)。將各組大鼠胰腺的體尾部取下稱重后放置在烘烤箱65℃烘烤48小時(shí)，再稱其干重，胰腺組織的含水量百分比即(1-干重/濕重)×100%,來評估胰腺組織水腫度。剪取大鼠中部胰腺組織，加入PBS(pH7.4),勻漿置于冰上，吸取勻漿到新的1.5mL離心管中，離心機(jī)轉(zhuǎn)速12000r/min,離心5min,取上清，用ELISA試劑盒測定組織勻漿中SOD和MPO濃度。對胰腺周圍組織進(jìn)行觀察，并記錄水腫、充血、壞死等現(xiàn)象，剪取胰腺頭部組織靠近十二指腸部，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，用乙醇分級進(jìn)行脫水，石蠟包埋胰腺組織，最后切成5μm厚的切片，用蘇木精和伊紅染色(H&E),顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化。將胰腺組織切片切成4μm厚度，進(jìn)行脫蠟處理后，置于3%過氧化氫中中煮沸20min。再用10%羊血清PBS孵育40分鐘后，加入抗NF-kBp65抗體，4℃孵育過夜。第二天在室溫下將稀釋的二抗(羊抗兔，1:2000)置于玻片上，DAB溶液孵育3-5min,并用蘇木精對切片進(jìn)行復(fù)染。石蠟切片在60℃孵育20分鐘，之后在二甲苯中脫蠟2次，每次10分鐘。所有切片均用分級系列酒精(100%、95%、90%、85%和70%乙醇/ddH?O)處理，并在磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)中沖洗，最后，顯微鏡下對切片進(jìn)行觀察。(8)Westernblot檢測各組胰腺用RIPA緩沖液提取胰腺并勻漿，離心取上清，并測定蛋白質(zhì)濃度，將提取的蛋白質(zhì)進(jìn)一步煮沸10分鐘，SDS電泳分析。具體操作過程同2.2.2 用GraphPadPrism7.0處理數(shù)據(jù)，用×±s表示，采用t檢驗(yàn)評價(jià)兩組之差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖3-1中A、B、C、D所示，模型組血清中TNF-α、IL-1β、AMS、LPL的濃度顯著高于空白對照組(p<0.01),是SAP模型胰腺損傷的有力證據(jù)，說明造模成功。與模型組比較，地塞米松組、芒柄花素-3'-磺酸鈉中高劑量組酸鈉低劑量組中TNF-α、AMS、LPL顯著降低(p<0.01),而IL-1β降低效果不顯著,其中芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組顯示出更好的抗重癥急性胰腺炎BABCDC圖3-1芒柄花素-3'-磺酸鈉對大鼠血清TNF-α、IL-1β、AMS、LPL水平的影響x±s,expressionlevels,respectively.#p<0.01vsControlgroup;**p<0.01vs3.3.2大鼠胰腺重量系數(shù)和組織水腫度指標(biāo)檢測結(jié)果如表3-1所示，與空白對照組相比較，模型組(Model)中胰腺重量系數(shù)和組織水腫度顯著升高(p<0.01),與模型組相比較，地塞米松組顯著降低了胰腺重量系數(shù)和組織水腫度(p<0.01),芒柄花素-3'-磺酸鈉低劑量組胰腺重量系數(shù)和組織水腫度降低效果不明顯，芒柄花素-3'-磺酸鈉中劑量組胰腺重量系數(shù)有一定程度降低(p<0.05)。芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組能降低胰腺重量系數(shù)和組織水腫度(p<0.05)。Table3-1DetectionofPancreaticweightcoefficientandtissueedemaofrats(x±s,n=6)組別3.3.3大鼠胰腺指標(biāo)檢測結(jié)果在重癥急性胰腺炎發(fā)病過程中，涉及氧化應(yīng)激，因此測定了MPO及SOD的活性水平，如圖3-2所示，與空白對照組相比，模型組中MPO活性水平顯著升高(p<0.01),而SOD的活性降低(p<0.01)。而地塞米松組、芒柄花素-3'-磺酸鈉各劑量組降低了MPO的活性水平(p<0.05),增加了SOD活性水平(p<0.01)。AoB圖3-2酶聯(lián)免疫吸附測定SOD和MPO的活性(x±s,n=6)模型組比較，**p<0.01,*p<0.05。3-2,AandBrepresenttheactivitylevelofSODandMPOr3.3.4組織病理學(xué)檢測結(jié)果顯微鏡下觀察胰腺組織中H&E染色變化情況，結(jié)果如圖3-3所示，空白對照組代表胰腺的正常狀態(tài)：胰腺小葉完整，邊界清晰，組織光滑，無明顯水腫、出血及炎細(xì)胞浸潤，無組織病理學(xué)改變。然而模型組胰腺小葉間導(dǎo)管和腺泡間隔較空白對照組寬，細(xì)胞空泡化，炎性細(xì)胞浸潤多，組織水腫出血，壞死面積大，有嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)改變。陽性藥物地塞米松組胰腺組織基本正常，局部有輕微水腫出血。芒柄花素-3'-磺酸鈉低中劑量組，鏡下見組織水腫出血比較嚴(yán)重，有炎細(xì)胞浸潤。芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組胰腺組織水腫較輕微，水腫出血較模型組減輕，少量的炎細(xì)胞浸潤。從鏡下觀察，芒柄花素-3'-磺酸鈉各治療組較模型組減輕了胰腺炎癥及水腫壞死程度，其中芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組治療效果最好，與陽性藥物地塞米松組差異不明顯。SFS-L圖3-3H&E染色結(jié)果(×100),標(biāo)尺表示50μmFigure3-3ResultsofH&Estaining(magnififi3.3.5大鼠胰腺組織免疫組織化學(xué)分析結(jié)果免疫組化結(jié)果如圖3-4所示，大鼠胰腺組織NF-kB蛋白陽性著色呈褐色，空白對照組胰腺細(xì)胞中基本無NF-kBp65信號分子表達(dá)，然而，在模型組中，腺泡細(xì)胞的細(xì)胞核和胞漿中有大面積褐色，NF-kBp65的陽性率高。地塞米松組褐色表達(dá)相比模型組減少，芒柄花素-3'-磺酸鈉各治療組中褐色區(qū)域明顯小于模型組，且芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組褐染率要低得多。這些結(jié)果表明，芒柄花素-3'-磺酸鈉治療可通過阻斷NF-KB途徑在雨蛙素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的SAP大鼠中發(fā)揮治療作用。ControlModelSFS-L圖3-4免疫組化檢測各組胰腺NF-kBp65的表達(dá)(×200),標(biāo)尺表示50μmtissuesfromeachgroup(magni3.3.6Westernblot對胰腺組織中NF-KB通路中各種蛋白表達(dá)影響Westernblot結(jié)果如圖3-5顯示，模型組(Model)相比空白對照組增加了PCNP、p65及p-p65的表達(dá)，而TIPE2及IkB-α的蛋白表達(dá)水平降低(p<0.01)。而芒柄花素-3'-磺酸鈉治療組可明顯阻斷SAP大鼠NF-KB信號活性，降低p65和p-p65蛋白水平，同時(shí)增加了TIPE2及IkB-α的蛋白表達(dá)水平(p<0.01)。這與之前免疫組化NF-KBp65在胰腺組織中結(jié)果的表達(dá)是一致的，進(jìn)一步驗(yàn)證了芒柄花素-3'-磺酸鈉對重癥急性胰腺炎的抗炎效果與NF-KB信號通路相關(guān)。pp6sGAPDHp65GAPDHEQ\*jc3\*hps23\o\al(\s\up3(織),x)pancreatictissuesfromeachgroup(x±s,n=3).“p<0.01vsControlgroup;**p<0.01,重癥急性胰腺炎(SAP)發(fā)病一方面由于胰酶異常激活造成胰腺損傷，另一方面激活炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子，如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等，從而進(jìn)一步加重了胰腺組織損傷。因此本研究測定血清中TNF-α、IL-1β炎癥因子表達(dá)水平。淀粉酶(AMS)與脂蛋白脂肪酶(LPL)是胰腺損傷的標(biāo)志物，另外在胰腺炎發(fā)病過程中，涉及氧化應(yīng)激，因此MPO也可作為中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)志物。作為體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，SOD能夠反映機(jī)體清除氧自由基的AMS、LPL、MPO、SOD、NF-KB等列為檢測指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)建立了雨蛙素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的重癥急性胰腺炎大鼠模型，與模型組比較，地塞米松組與芒柄花素-3'-磺酸鈉各治療組大鼠的胰腺水腫、出血、炎癥浸潤程度均有顯著改善，血清中TNF-α、IL-1β、AMS、LPL表達(dá)水平降低，胰腺重量系數(shù)和組織水腫度減輕，胰腺組織中SOD表達(dá)水平顯著高于模型組，MPO表達(dá)水平顯著低于模型組，胰腺組織中NF-KBp65的陽性表達(dá)也明顯下降。Westernblot檢測結(jié)果顯示芒柄花素-3'-磺酸鈉治療組中NF-kB信號通路相關(guān)蛋白TIPE2、IkB-α表達(dá)升高，而PCNP、p65、p-p65表達(dá)水平下降。其中芒柄花素-3'-磺酸鈉高劑量組顯示出更好的治療效果。綜合以上分析，芒柄花素-3'-磺酸鈉對雨蛙素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的大鼠重癥急性胰腺炎均有治療作用，其機(jī)制之一是通過調(diào)控NF-KB信號通路相關(guān)蛋白TIPE2、PCNP、p65及磷酸化p65蛋白表達(dá)，減少IkB-α降解，并抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，來治療重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺損傷。具有抗炎活性成分的天然產(chǎn)物有類固醇、黃酮類、生物堿類、萜類等，它們能夠多靶點(diǎn)、多水平作用于機(jī)體，發(fā)揮協(xié)同作用。這些植物成分既可以模擬抗炎介質(zhì)的作用從而抑制炎癥過程，也可以作為抗氧化劑、免疫調(diào)節(jié)劑來對抗炎癥過程和促進(jìn)炎癥級聯(lián)吸收的作用[52]。多種天然活性成分已用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和重癥急性胰腺炎的治療，本研究中選擇了水溶性更好的芒柄花素-3'-磺酸鈉，它是在非甾體異黃酮芒柄花素的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上磺化后得到的水溶性化合物。本研究考查了該化合物對膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠和雨蛙素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的重癥急性胰腺炎大鼠的治療效果，并對其潛在的抗炎活性機(jī)制進(jìn)行探討。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)作為慢性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤到滑膜關(guān)節(jié)，最終導(dǎo)致軟骨和骨損傷，但具體發(fā)病機(jī)制研究仍有待深入?，F(xiàn)有研究指出，在RA病程進(jìn)行中，淋巴細(xì)胞作為脾臟的主要組成部分，能夠釋放大致滑膜中大量免疫細(xì)胞浸潤為特征的滑膜炎[55,56]。因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示芒柄花素-3'-磺酸鈉各治療組均能降低炎癥因子