毛發(fā)中安非拉酮等7種減肥藥的液相色譜-質(zhì)譜檢驗方法

1毛發(fā)中安非拉酮等7種減肥藥的液相色譜-質(zhì)譜檢驗方法本文件描述了毛發(fā)中安非拉酮、苯甲曲秦、芬氟拉明、芬美曲秦、芬特明、馬吲哚和西布曲明的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗方法，包括原理，試劑、儀器和設(shè)備，定性分析，定量分析以及分析結(jié)果評價。本文件適用于毛發(fā)中安非拉酮、苯甲曲秦、芬氟拉明、芬美曲秦、芬特明、馬吲哚和西布曲明的定性分析和定量分析。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GA/T122毒物分析名詞術(shù)語3術(shù)語和定義GA/T122界定的術(shù)語和定義適用于本文件。毛發(fā)樣品經(jīng)清洗和冷凍濕法研磨后，以超聲法提取，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測，經(jīng)與平行操作的空白樣品和添加樣品作對照，以保留時間、質(zhì)譜特征離子對峰和離子對豐度比進行定性分析；以定量離子對峰面積或峰面積比值為依據(jù)，采用外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法進行定量分析。5試劑、儀器和設(shè)備試驗用水應(yīng)為符合GB/T6682規(guī)定的一級水。所用試劑及要求如下。a)甲醇：色譜純。b)乙腈：色譜純。c)甲酸：含量≥98%,色譜純。d)乙酸銨：色譜純。f)丙酮：分析純。g)溶液配制：1)含8%乙腈的2mmol/L甲酸銨緩沖溶液：稱取甲酸銨0.063g,置于500mL容量瓶中，加水溶解，然后加入1%甲酸溶液115μL和乙腈40mL,最后加水定容至刻度，搖勻備用，H約為5.3:2)提取溶液：取甲醇、乙腈、符合5.1g)1)的含8%乙腈的2mmol/L甲酸銨緩沖溶液適量配制體積比為25:25:50的提取溶液：3)含0.1%甲酸的20mmol/L乙酸銨緩沖溶液：分別取乙酸銨1.54g和甲酸1mL,置于1000L容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻備用，陽約為4。h)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液：1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備溶液：根據(jù)安非拉酮、苯甲曲秦、芬美曲秦、芬特明、芬氟拉明、馬吲哚和西布曲明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度和鹽型換算后，分別精密稱取適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為21.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備溶液。密封，置于冰箱中冷凍保存，有效期12個月，或采用市售標(biāo)準(zhǔn)溶液：2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液：試驗中所用其他濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液均由符合5.1h)1)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備溶液用甲醇稀釋得到。密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期3個月。i)內(nèi)標(biāo)溶液：1)內(nèi)標(biāo)儲備溶液：精密稱取地西泮-d(或其他合適內(nèi)標(biāo)物)適量，用甲醇配制成1.0mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備溶液。密封，置于冰箱中冷凍保存，有效期12個月，或采用市售標(biāo)準(zhǔn)溶液：2)內(nèi)標(biāo)工作溶液：Ing/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液由符合5.1i)1)的內(nèi)標(biāo)儲備溶液用符合5.1g)2)的提取溶液稀釋得到。密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期3個月。5.2儀器和設(shè)備儀器和設(shè)備及要求如下。a)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源(ESI)。b)電子天平：分度值≤0.1mg。d)超聲波清洗儀。聚四氟乙烯濾膜：0.22μm.h)移液器。6定性分析6.1樣品前處理依次用適量的水和丙酮將毛發(fā)樣品振蕩洗滌兩次，晾干后剪成約1mm段，稱取毛發(fā)樣品20mg于2L研磨管中。加研磨珠適量，再加1ng/mL內(nèi)標(biāo)工作溶液1mL,置冷凍研磨儀中粉碎，冰浴超聲30min,12000r/min離心3min,取上清液，經(jīng)濾膜過濾，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。6.1.2空白樣品稱取空白毛發(fā)樣品20mg作為空白樣品，按6.1.1的方法，與檢材樣品平行操作。6.1.3添加樣品稱取空白毛發(fā)樣品20mg,添加100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液10μL,配制成0.05ng/mg添加樣品，然后按6.1.1的方法，與檢材樣品平行操作。6.2儀器檢測6.2.1儀器條件6.2.1.1液相色譜條件以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器等實際情況進行調(diào)整。a)色譜柱：五氟苯基柱(100m×2.1mm.5μm)或其他等效柱。b)流動相：流動相A為含0.1%甲酸的20mmol/L乙酸銨緩沖溶液，流動相B為乙睛：采用梯度洗脫方法，梯度洗脫程序見表1。c)柱溫：室溫。3表1流動相梯度洗脫程序06.2.1.2質(zhì)譜條件6.2.1.2.1以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器等實際情況進行調(diào)整。a)離子源：電噴霧電離-正離子模式(ESI+)。b)檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。d)碰撞氣、氣簾氣、霧化氣、輔助氣均為高純氮氣，使用前調(diào)節(jié)各氣流流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求。e)去簇電壓、碰撞能量優(yōu)化至最佳靈敏度。6.2.1.2.2在符合6.2.1.1和6.2.1.2的液相色譜條件和質(zhì)譜條件下，目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)和保留時間參見表2。表2目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)和保留時間目標(biāo)物wV地西泮-d(內(nèi)標(biāo)物)分別吸取空白樣品提取液、檢材樣品提取液和添加樣品提取液，按6.2.1的條件進樣分析。記錄空白樣品、檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物可疑色譜峰的保留時間、質(zhì)譜特征離子對和離子對豐度比。4以保留時間、質(zhì)譜特征離子對峰和離子對豐度比作為定性判斷依據(jù)。若檢材樣品中出現(xiàn)目標(biāo)物的兩對定性離子對的色譜峰，保留時間與添加樣品中相應(yīng)目標(biāo)物的色譜峰保留時間比較，相對誤差在±2.5%內(nèi)，且定性離子對豐度比與添加樣品的離子對豐度比之相對誤差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判斷檢材樣品中檢出該種目標(biāo)物。表3離子對豐度比的最大允許相對誤差稱取檢材樣品毛發(fā)20mg兩份，然后按6.1.1的方法操作。與檢材樣品平行操作。目標(biāo)物的相關(guān)信息及方法線性范圍、檢出限與定量限見附錄A。檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)在工作曲線的線性范圍內(nèi)。配制單點質(zhì)量分?jǐn)?shù)的添加樣樣品中目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)在添加樣品目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(100±50)%范圍內(nèi)。儀器條件應(yīng)符合6.2.1的規(guī)定。記錄檢材樣品、系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)的添加樣品或單點質(zhì)量分?jǐn)?shù)的添加樣品中目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物(內(nèi)標(biāo)法)定量離子對的峰面積值，然后計算檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)的添加樣品中，以目標(biāo)物定量離子對的峰面積值(D為縱坐標(biāo)、目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得線性方程。根據(jù)檢材樣品中目標(biāo)物的峰面積值，按式(1)計算檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。C——檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為納克每毫克(na—線性方程的截距：b—線性方程的斜率。根據(jù)檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物的峰面積值，按式(2)計算檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。5式中：C—材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為納克每毫克(ng/ng):A——檢材樣品中目標(biāo)物的峰面積值：c——添加樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為納克每毫克(ng/g)。在系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)的添加樣品中，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物定量離子對的峰面積比值(D為縱坐標(biāo)、目標(biāo)根據(jù)檢材樣品中目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物定量離子對的峰面積比值，按式(3)計算檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)C——檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為納克每毫克(ng/mg);b—線性方程的斜率。根據(jù)檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物定量離子對的峰面積比值，按式(4)計算檢材樣品中c——檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為納克每毫克(ng/g);A—檢材樣品中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值；A——添加樣品中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值；c——添加樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為納克每毫克(ng/mg)。7.3.4計算相對相差檢材樣品平行測定兩份，相對相差按式(5)計算。C.C——兩份檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為納克每毫克(ng/ng);C兩份檢材樣品中目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值(G+C/2,單位為納克每毫克(ng/mg)。陰性結(jié)果評價包括：a)