核酸分子雜交技術分子生物學檢驗技術生物化學檢驗教研室課件

分子生物學檢驗技術核酸分子雜交技術生物化學檢驗教研室學習目標掌握：1.核酸分子雜交的基本原理；2.核酸探針的種類分類，常用探針標志物。熟悉：核酸分子雜交的影響因素；核酸探針的檢測方法。常用核酸分子雜交技術的基本原理，操作過程。了解：1.常用核酸探針標記方法的原理和特點；2.常用核酸分子雜交技術的臨床應用。目錄核酸分子雜交的基本原理與分類01核酸探針種類、標記方法02核酸分子雜交技術03CONTENTS分子生物學檢驗技術CONTENTS常用核酸分子雜交技術PART03常用核酸分子雜交技術雜交類型檢測目的及范圍Southern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉移至膜上的DNA分子Northern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉移至膜上的RNA分子原位雜交檢測細胞或組織中的DNA或RNA分子菌落雜交檢測固定在膜上,經(jīng)裂解從細菌體釋放的DNA分子斑點雜交檢測固定在膜上的DNA或RNA分子分子雜交的一般程序待測核酸制備電泳濾膜上核酸固化雜交去除未雜交的探針檢測雜交信號制備探針探針標記加入標記核酸探針分子雜交的一般程序1.待檢2.電泳3a.印跡3b.合成標記探針AddKlenow

DNAPolymerase,

randomprimers

andlabeled

nucleotides4.雜交5.洗膜、顯影Klenow

FragmentKlenow

FragmentSouthern印跡雜交DNA/DNA雜交，將DNA電泳、轉印到固相支持物上，用探針進行檢測的方法。瓊脂糖凝膠電泳印跡技術分子雜交技術瓊脂糖凝膠電泳分離DNA不同的DNA，分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。根據(jù)分子的大小進行分離。印跡技術將核酸分子通過一定方式轉移并固定到固相支持物（硝酸纖維膜）上毛細管虹吸法重物濕濾紙吸水紙玻璃板膠膜濕濾紙濕濾紙橋支持平臺玻璃容器20×SSC電轉移Southern雜交的應用用Southern檢測物種1和物種3的特異性的DNA片段從樣本中提取DNA123Southern雜交的應用限制性內(nèi)切酶酶切DNA123Southern雜交的應用消化后DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離123Southern雜交的應用消化后DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)印跡技術轉到尼龍膜上123Southern雜交的應用附著DNA的膜經(jīng)預雜交后與標記探針進行雜交123Southern雜交的應用經(jīng)放射性自顯影檢測與探針序列互補的特定DNA片段123Southern雜交的應用分離轉移雜交放射自顯影酶切流程圖制備基因探針雜交根據(jù)雜交片段顯示的長度多態(tài)性分析限制性內(nèi)切酶MstII待檢測基因，不同長度片段Southern雜交的應用如何用Southern印跡診斷鐮刀型紅細胞貧血癥的？鐮狀細胞貧血癥臨床表現(xiàn)慢性溶血性貧血易感染再發(fā)性疼痛危象發(fā)病機制β珠蛋白基因鐮刀型HbS纈氨酸GTGCACβ珠蛋白基因正常HbAGAGCTC谷氨酸缺失了一個MstII酶切位點（回文結構）Southern雜交的應用ATΧASouthern雜交的應用CCTAGGCCTGAGGACCTAGG==MstIIMstIIMstII5’3’1.15kb0.2kbCCTAGGCCTGTGGACCTAGG==MstIIMstIIΧ3’5’1.35kb提取待檢者全基因組DNA12Southern雜交的應用341234MstII酶切后電泳分析Southern雜交的應用1.35kb1.1kb0.1kb0.6kb0.8kb0.3kb1.4kb與β-珠蛋白基因特異性探針雜交Southern雜交的應用βA/βA

βA/βS

βS/βS

βA/βS

24131.35kb1.1kb0.2kbNorthern印跡雜交/NorthernblotNorthern印跡雜交是應用DNA探針檢測特異mRNA的另一種膜上印跡技術。是由Alwine于1977年建立的。Northern印跡雜交/Northernblot基本原理和基本過程與Southernblot基本相同。01鑒別RNA。02探針可用DNA或RNA片段。03待測樣品為總RNA或mRNA。04Northern印跡雜交/Northernblot變性電泳提取組織總RNA轉膜預雜交制備探針探針設計標記探針純化探針Northern雜交雜交后檢測結果分析Northern雜交的應用待檢樣品分離純化RNA逆轉錄PCR與丙型肝炎特異性探針進行點雜交HCVRNA病毒檢測Western印跡雜交/Westernblot1979年，Towbin等人首先將印跡術引入對抗原（蛋白質）的檢測——免疫印跡，Western印記雜交?；具^程首先做蛋白質的SDS電泳。01然后將凝膠中的蛋白質電轉印到固相膜上。02在膜上以相應的抗體進行抗原／抗體反應。03顯色。04本方法結合了凝膠電泳分辨率高和免疫檢測靈敏特異的特點，能從混雜的蛋白質中檢測出特定的抗原。三種印跡技術的比較點雜交/Dot-blot將待檢樣（DNA、RNA或細胞）直接點樣到固體膜上，然后與特異性探針進行雜交并檢測。點雜交/Dot-blot點雜交/Dot-blot用點雜交診斷鐮刀型紅細胞貧血癥發(fā)病機制β珠蛋白基因鐮刀型HbS纈氨酸GTGCACβ珠蛋白基因正常HbAGAGCTC谷氨酸用點雜交診斷鐮刀型紅細胞貧血癥分子診斷點雜交/Dot-blotSouthern印跡雜交。01點雜交印跡雜交。02點雜交/Dot-blotβA5’GTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC…..3’野生型βAASO14βS5’GTGCACCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC…..3’AGGAGAAGTC3’5’TGACTCCTG突變型βsASOTGGAGAAGTC3’5’TGACTCCTG點雜交/Dot-blot點樣待檢基因樣本雜交與兩種探針分別判讀結果野生型突變型βA/βA

βA/βS

βS/βS總結條件設計雜交針對突變位點已知的基因。

一對寡核苷酸探針：一條為野生型探針，與正常序列互補；一條為突變型探針，與突變序列互補。分別與受檢者DNA進行分子雜交?？偨Y點雜交/Dot-blot反向點雜交/ReverseDot-blot，RDB正向將待檢樣（DNA、RNA或細胞）直接點樣到固體膜上，然后與特異性探針進行雜交并檢測。反向將特異性探針直接點樣到固體膜上，然后與待檢樣（DNA、RNA或細胞）進行雜交并檢測。反向點雜交的臨床應用項目名稱標本類型檢測方法地中海貧血基因突變檢測全套（α+β）EDTA抗凝血gap-PCR、PCR-RDBα地中海貧血基因檢測（包括缺失和突變）EDTA抗凝血gap-PCR、PCR-RDBβ地中海貧血基因突變檢測EDTA抗凝血PCR-RDB反向點雜交的臨床應用01遺傳性疾病檢驗苯丙酮尿癥。02感染性疾病檢驗乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒。原位雜交/Insituhybridization13號，綠色熒光；21號，紅色熒光原位雜交/Insituhybridization核酸探針進入細胞或組織中，與待測核酸進行雜交，然后用組織化學或免疫組化的方法在顯微鏡下進行細胞內(nèi)定位的檢測。保持細胞形態(tài)，或單個染色體形態(tài)下完成；不用提取核酸；可精確定位。原位雜交/Insituhybridization根據(jù)探針標記物分類放射性原位雜交熒光原位雜交技術（FluorescenceInSituHybridization，F(xiàn)ISH）原理01設計根據(jù)待測核酸序列信息合成帶標記的特異性探針。02制備待測樣本（組織切片，細胞爬片），適當處理增加細胞膜的通透性。03變性復性序列互補的待測核酸與特異性探針結合。04觀察用探針標記物相應的檢測方法，定位檢測觀察。原理原理放射性原位雜交菌落原位雜交特異性的基因探針從細菌菌落群中篩選含有目的基因的陽性菌落。印跡菌落裂解固定DNA預雜交與標記探針雜交確定陽性菌落位置回收熒光原位雜交/FISH用熒光素標記的探針與待測樣本中的靶核酸進行原位雜交，在熒光顯微鏡下對熒光信號進行辨別和技術，達到對染色體或基因異常的細胞或組織標本進行檢測診斷。21三體綜合征的FISH產(chǎn)前診斷21號染色體的特異性探針（紅色）13號染色體的特異性探針（綠色）與羊水間期細胞進行熒光原位雜交FISH20號染色體微缺失的FISH檢驗20號染色體著絲粒探針（紅色）20號染色體基因座特異性探針（綠色）與待檢細胞進行FISH雜交FISH檢測染色體易位染色體核型分析檢測染色體易位20號染色體微缺失的FISH檢驗熒光原位雜交的臨床應用先天性疾病（唐氏綜合癥）01腫瘤疾病檢驗（慢性粒細胞白血?。?2感染性疾病HPV，HBV03標本01