食品毒理學(xué) 化學(xué)毒物的免疫毒性學(xué)習(xí)課件

PAGEPAGE1第十章化學(xué)毒物的免疫毒性免疫系統(tǒng)對于防御病原體的入侵和維持機體自身的穩(wěn)態(tài)有十分重要的作用。早在20世紀(jì)初人們就注意到職業(yè)接觸化學(xué)物所致的免疫損傷現(xiàn)象，還發(fā)現(xiàn)不少食品、藥品、香料及日用化學(xué)品能引起過敏反應(yīng)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，外來化合物對免疫系統(tǒng)的影響出現(xiàn)早，損害劑量低，且個體差異大。對免疫毒性的研究既為化學(xué)物的毒性評價提供了早期診斷指標(biāo)，也拓展了化學(xué)物毒作用機制的研究范圍，由此逐漸形成了毒理學(xué)的分支學(xué)科—免疫毒理學(xué)。不同化學(xué)毒物可通過干擾神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)等，使機體免疫功能低下即免疫抑制，導(dǎo)致個體易受感染因素或腫瘤等的攻擊；也可影響免疫細(xì)胞的抗原識別能力或敏感性，引起病理性免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為過敏反應(yīng)或自身免疫性疾病。化學(xué)物對免疫系統(tǒng)的作用具有雙相性，同一化學(xué)物可在不同條件下分別表現(xiàn)為對機體的免疫抑制或過敏。免疫毒理學(xué)的主要任務(wù)就是研究化學(xué)毒物與免疫系統(tǒng)的相互作用，借助于嚙齒類動物試驗，監(jiān)測和評估化學(xué)毒物引起的免疫系統(tǒng)的不良反應(yīng)，進而確定其對人類健康的影響及其防治措施。第一節(jié)機體免疫系統(tǒng)及免疫功能免疫系統(tǒng)由中樞淋巴器官、外周淋巴器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成，是機體免疫機制發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。免疫系統(tǒng)中不同的免疫細(xì)胞和免疫分子協(xié)同作用產(chǎn)生免疫應(yīng)答，識別和清除外來異物，對機體進行防御和保護。根據(jù)其功能不同可將整個系統(tǒng)分成三個組織層次：①免疫組織與器官；②免疫細(xì)胞；③免疫分子。各層次不同類型的組織和細(xì)胞又有著不同的作用，通過淋巴細(xì)胞再循環(huán)和各種免疫分子將各部分的功能協(xié)調(diào)統(tǒng)一起來。免疫系統(tǒng)有著一系列的內(nèi)部調(diào)節(jié)機制，但不是完全獨立運行，而是與其它系統(tǒng)互相協(xié)調(diào)，尤其是受神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，又可進行反饋影響，共同維持機體的生理平衡。一、免疫應(yīng)答的類型及作用抗原性物質(zhì)進入機體后激發(fā)免疫細(xì)胞活化、分化和效應(yīng)的過程稱為免疫應(yīng)答，是機體對外來物質(zhì)侵入機體的自身防御反應(yīng)。在體內(nèi)有兩種免疫應(yīng)答類型，一種是遇到病原體后，首先并迅速起防御作用的，稱為固有性免疫應(yīng)答。執(zhí)行固有免疫功能的有皮膚、黏膜的物理阻擋作用及局部細(xì)胞分泌的抑菌、殺菌物質(zhì)的化學(xué)作用；有吞噬細(xì)胞的吞噬病原體作用；自然殺傷細(xì)胞（NK）對病毒感染靶細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的識別及殺傷作用以及血液和體液中存在的抗菌分子，如補體成分的細(xì)胞溶解作用。固有免疫在感染早期（數(shù)分鐘至96h內(nèi)）執(zhí)行防御功能。另一種是適應(yīng)性免疫應(yīng)答，其執(zhí)行者是T及B淋巴細(xì)胞。T及B細(xì)胞識別病原體成分后被活化，活化后并不即刻表現(xiàn)防御功能，而是經(jīng)免疫應(yīng)答過程，4～5d后，才生成效應(yīng)細(xì)胞，對已被識別的病原體施加殺傷清除作用。適應(yīng)性免疫應(yīng)答是繼固有性免疫應(yīng)答之后發(fā)揮效應(yīng)的，在最終清除病原體、促進疾病治愈及防止再感染中起主導(dǎo)作用。適應(yīng)性免疫應(yīng)答又根據(jù)其效應(yīng)機制可分為以B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫和以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫兩類。這兩類免疫應(yīng)答都是由多細(xì)胞系，如單核吞噬細(xì)胞，T細(xì)胞和B細(xì)胞等來完成的。二、免疫細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中有許多類型的細(xì)胞，這些細(xì)胞中的大多數(shù)為淋巴細(xì)胞，包括B細(xì)胞和T細(xì)胞及NK細(xì)胞。此外還有各種粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞以及各種輔助細(xì)胞。免疫細(xì)胞均由骨髓中造血干細(xì)胞的兩大譜系分化而來：即淋巴干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞譜系。前者分化發(fā)育為各種淋巴細(xì)胞，后者分化發(fā)育為粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞及輔助細(xì)胞。單核細(xì)胞在離開血液進入組織時進一步分化成巨噬細(xì)胞。淋巴細(xì)胞共有三種類型：T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和非T非B淋巴細(xì)胞或稱裸細(xì)胞，最常見的是自然殺傷細(xì)胞。大部分免疫細(xì)胞以白細(xì)胞形式在血液中循環(huán)，小部分存在于組織中，在必要時對抗損傷和感染。肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與其它免疫細(xì)胞不同，只存在于組織中，在血液中很少見。淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中都有各自的功能，對免疫應(yīng)答起著重要的作用。1．B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞為骨髓依賴的淋巴細(xì)胞的簡稱。B淋巴細(xì)胞在鳥類法氏囊中發(fā)育成熟，在哺乳類和人類則在骨髓中發(fā)育成熟。成熟的B淋巴細(xì)胞可定居于淋巴結(jié)的皮質(zhì)區(qū)和脾臟的紅髓及白髓的淋巴小結(jié)內(nèi)。外周血中B淋巴細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%～25%，淋巴結(jié)占20%～25%，脾臟中占40％～50％。已證明，B細(xì)胞在骨髓內(nèi)的發(fā)育，可經(jīng)過祖B細(xì)胞、前B細(xì)胞、不成熟B細(xì)胞、成熟B細(xì)胞及漿細(xì)胞幾個階段。B細(xì)胞的一個重要特征是細(xì)胞膜表面帶有自己合成的免疫球蛋白，即膜免疫球蛋白（mIg）。在抗原的誘導(dǎo)下B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，可分泌與膜抗體相同的免疫球蛋白（Ig），只是比膜免疫球蛋白缺少了一段穿膜肽，即抗體。一種漿細(xì)胞只能產(chǎn)生一種類別的Ig分子，并且喪失產(chǎn)生其它類別的能力。漿細(xì)胞壽命較短，其生存期僅數(shù)日，隨后即死亡。免疫球蛋白單體分子由兩條較長的重鏈和兩條較短的輕鏈組成，鏈間二硫鍵連結(jié)起來的大分子。免疫球蛋白在木瓜酶和胃蛋白酶作用下可裂解成Fab片段，具有抗原結(jié)合能力和Fc段。根據(jù)免疫球蛋白重鏈抗原特異性不同，將免疫球蛋白分為5類，即IgG,IgM,IgA,IgD,IgE。同類Ig分子還可進一步分為亞類。2.T淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞是胸腺依賴的淋巴細(xì)胞的簡稱。T淋巴細(xì)胞來源于骨髓淋巴干細(xì)胞，在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟后，分布于周圍淋巴器官。在胸導(dǎo)管中有90%以上是T淋巴細(xì)胞，在外周血中占淋巴細(xì)胞的60%～80%，在淋巴結(jié)中占70%～75%，在脾臟中占40%～50%。T淋巴細(xì)胞膜表面具有多種膜抗原成分，國際上用CD，即分化抗原來命名。除此之外，T淋巴細(xì)胞表面還有多種表面受體，即T細(xì)胞抗原受體(TCR）、促有絲分裂素受體、白細(xì)胞介素受體（IL-R）及黏附分子受體等?？乖荏w是T淋巴細(xì)胞識別外來抗原并與之結(jié)合的特異受體，而且外來抗原只有與自身MHC抗原結(jié)合后，才能被T細(xì)胞識別。T細(xì)胞表達(dá)的TCR是雙肽鏈分子，按肽鏈編碼基因不同，分為TCRαβ及TCRγδ兩類。在外周中，絕大部分T細(xì)胞表達(dá)TCRαβ，只有1%～5%的T細(xì)胞為TCRγδ。但在表皮及小腸黏膜下，TCRγδ細(xì)胞占明顯優(yōu)勢。T細(xì)胞的特異免疫應(yīng)答主要是由αβ+T細(xì)胞完成。位于表皮及腸黏膜下的γδ+T細(xì)胞只能識別多種病原體表達(dá)的共同抗原成分，增殖、分化為效應(yīng)細(xì)胞后，能殺傷病原體感染細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，故γδ+細(xì)胞執(zhí)行的是固有免疫功能。根據(jù)T淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志及功能的不同，可分為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxicTcells，Tc），其效應(yīng)是對靶細(xì)胞（病毒感染細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞）施加殺傷作用；調(diào)節(jié)T細(xì)胞（regulatoryTcells)，按調(diào)節(jié)功能不同，又分為輔助性T細(xì)胞（helperTcells，Th）和抑制性T細(xì)胞（suppressorTcells,Ts)，前者經(jīng)其分泌的細(xì)胞因子，正反饋調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞功能；后者抑制其它免疫細(xì)胞功能，負(fù)反饋調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。Th細(xì)胞呈CD4+，而Ts/Tc則呈CD8+。3．單核吞噬細(xì)胞有吞噬功能的細(xì)胞有單核吞噬細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞。單核吞噬細(xì)胞是除淋巴細(xì)胞外免疫系統(tǒng)中第二大的細(xì)胞群。所以這里著重討論單核巨噬細(xì)胞。單核細(xì)胞起源于骨髓干細(xì)胞，在骨髓中發(fā)育為單核吞噬細(xì)胞進入血液，隨著血流移行到全身各組織器官內(nèi)。因此，單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)包括骨髓內(nèi)的前單核細(xì)胞、外周血中的單核細(xì)胞和組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞在不同的器官組織中有不同的名稱，如肝臟中的枯否（kupffer）細(xì)胞、肺臟中的肺泡巨噬細(xì)胞、胸腔和腹腔中的巨噬細(xì)胞及神經(jīng)組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞等。巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記有補體受體和Fc受體等，通過這些受體表現(xiàn)其吞噬作用、抗原呈遞作用及分泌生物活性物質(zhì)參與免疫應(yīng)答等。4.自然殺傷細(xì)胞自然殺傷細(xì)胞（naturalkillercell,NK）是一群具有自然殺傷能力的淋巴細(xì)胞，它們不需經(jīng)抗原刺激，也不需要抗體參與，就能殺傷腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞及移植的組織細(xì)胞，但對正常組織細(xì)胞無殺傷作用。NK細(xì)胞來源于骨髓干細(xì)胞，成熟的NK細(xì)胞離開骨髓進人外周血及周圍免疫器官。人體外周血中NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的5%~7%。NK細(xì)胞表面無T、B細(xì)胞特有的標(biāo)志。CD16、NKH-1和CD2抗原是人NK細(xì)胞特征性抗原。三、免疫組織與器官免疫應(yīng)答是通過體液免疫和細(xì)胞免疫介導(dǎo)完成的，它們都是外來抗原首先特異性地刺激了免疫細(xì)胞。這些免疫細(xì)胞是在適合于它們自己的組織器官中產(chǎn)生和發(fā)育成熟，并參與循環(huán)和轉(zhuǎn)移到另外一些能與外來抗原接觸的組織器官中去的。這些組織器官就是免疫器官。哺乳動物及人類的免疫器官有初級免疫器官（如骨髓和胸腺）及次級免疫器官（如淋巴結(jié)、脾臟、腸系淋巴組織等）。（一）淋巴器官1．骨髓2.胸腺3.淋巴結(jié)4.脾臟5.黏膜淋巴樣組織（二）淋巴細(xì)胞的循環(huán)各種免疫器官中的淋巴細(xì)胞并不是定居不動的群體，而是通過血液和淋巴液的循環(huán)進行有規(guī)律的遷移（如圖10一3），這種規(guī)律性的遷移稱為淋巴細(xì)胞再循環(huán)。淋巴細(xì)胞經(jīng)淋巴循環(huán)及血液循環(huán)，運行并再分布于全身各處淋巴器官及淋巴組織中。淋巴循環(huán)匯集于胸導(dǎo)管，再入上腔靜脈，進入血液循環(huán)。淋巴循環(huán)的意義在于：①增加了與抗原、侵入物接觸的機會，被活化的淋巴細(xì)胞變?yōu)樾?yīng)細(xì)胞參與免疫應(yīng)答；②能使B、T細(xì)胞和記憶細(xì)胞很快地分布到全身的組織器官。第二節(jié)化學(xué)毒物對機體免疫功能影響及其作用機制隨著科學(xué)的發(fā)展與社會的進步，越來越多的化合物進入人類的生產(chǎn)和生活環(huán)境，其中有很多化合物的毒性作用廣泛。近十多年的毒理學(xué)研究表明，由于免疫系統(tǒng)的特殊動力學(xué)特征，決定了其受毒物損傷較其它系統(tǒng)更為早期和敏感?；瘜W(xué)毒物作用于免疫系統(tǒng)的重要靶部位如圖10-4。皮膚、呼吸道和消化道有很大的表面積，是機體與外源性化學(xué)毒物接觸的重要途徑。在呼吸道，吸入外源性物質(zhì)如氧化性氣體和顆粒物（硅谷、石棉、煤塵等）可使肺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，如白細(xì)胞介素1（IL-1），腫瘤壞死因子（TNF)、血小板源生長因子（platelet-derivedgrowthfactor,PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforminggrowthfactor,TGF)等。另外，肺泡巨噬細(xì)胞還分泌多種短活性物質(zhì)，如氧化反應(yīng)類物質(zhì)超氧化物、氮氧化物、過氧化氫和花生四烯酸代謝產(chǎn)物等，可改變機體肺部對感染和炎癥的抵抗力。同時，體液免疫功能抑制，可能提高機體對感染或腫瘤的易感性，發(fā)生炎癥和退化反應(yīng)。皮膚是免疫毒作用的重要靶器官，皮膚可與某些外源性化合物和化學(xué)致敏原（如一些化妝品等）、紫外線等起特異性應(yīng)答或非特異性炎癥反應(yīng)，這兩種反應(yīng)均與誘導(dǎo)前炎癥細(xì)胞因子有關(guān)。骨髓對毒作用最為敏感，臨床使用的多種藥物都有抑制骨髓功能，增加感染的危險性。許多新的免疫抑制劑均可抑制DNA合成而損傷骨髓功能。免疫系統(tǒng)作為化學(xué)毒物攻擊的靶部位，其毒性反應(yīng)可使免疫活性改變。免疫活性降低表現(xiàn)為免疫抑制，可增加對疾病的易感性，甚至導(dǎo)致反復(fù)、嚴(yán)重感染或誘發(fā)腫瘤；免疫活性增強可致免疫介導(dǎo)疾病發(fā)生，如超敏反應(yīng)或自身免疫應(yīng)答甚或自身免疫疾病。一、免疫抑制（一）具有免疫抑制的外源化學(xué)物(1)多鹵代芳香烴類多氯聯(lián)苯（PCB）、多溴聯(lián)苯（PBB）、四氯二苯對二噁英（TCDD）、六氯苯（HCB）等。(2）多環(huán)芳烴類苯蒽（BA）、7,12-二甲基苯蒽（DMBA）、三甲基膽蒽（3-MCA）等。（3）農(nóng)藥類DDT、敵百蟲、甲基對硫磷等。(4）金屬鉛、錫、砷、汞、鎳、鋅、銅、甲基汞等。(5）大氣污染物二氧化氮、二氧化硫、臭氧、一氧化碳等。(6)工業(yè)污染物氯乙烯、苯、苯乙烯、聯(lián)苯胺、三硝基甲苯、石棉等。(7)治療用藥物環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、5一氟尿嘧啶、環(huán)抱菌素A、雌二醇、白消安等。（二）外源化學(xué)物對免疫功能的抑制作用近年來，隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，對外源性化學(xué)物導(dǎo)致免疫系統(tǒng)毒性的作用機制也有了較大發(fā)展。外源性化學(xué)物是通過多種物質(zhì)介導(dǎo)、多種作用途徑而使機體的體液免疫、細(xì)胞免疫和巨噬細(xì)胞等功能下降，宿主抵抗能力改變，從而表現(xiàn)為免疫抑制。1．核因子與免疫抑制(1)核轉(zhuǎn)錄因子KappaB與免疫抑制轉(zhuǎn)錄因子KappaB即κ基因結(jié)合核因子(Nuclearfactor－κ－genebinding,NF－κB）是許多細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)劑，在正常淋巴細(xì)胞活化中可調(diào)節(jié)許多重要基因的表達(dá)。近年的免疫研究表明，免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素、苯的代謝產(chǎn)物氫醌、二甲基二硫代氨基甲酸酯等，均可通過抑制NF－κB而發(fā)揮其免疫抑制作用。多種免疫抑制劑或外源性化學(xué)物質(zhì)可使NF－κB合成減少，和／或IκBs合成增加，或者也可以通過抑制正常時能激活NF一κB的各種活性物質(zhì)等，從而抑制NFκB正常免疫功能。(2)T細(xì)胞活化核因子與免疫抑制如臨床上用于治療骨髓移植排斥的藥物環(huán)霉素A（CsA)，可優(yōu)先作用于T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞TCR的信號途徑。2．第二信使與免疫抑制外源性化學(xué)物可以作用于細(xì)胞內(nèi)第二信使通路中的各個環(huán)節(jié)，如酪氨酸磷酸化作用、CAMP和鈣等，從而使第二信使介導(dǎo)的免疫過程發(fā)生變化，最終導(dǎo)致免疫抑制。如上所述，多種化學(xué)物可致機體免疫抑制。凡具有免疫抑制的化學(xué)物均能降低機體對細(xì)菌、病毒、腫瘤及寄生蟲的抵抗力。臨床上由于采用免疫抑制劑治療某些疾病導(dǎo)致機體免疫功能下降，往往引起由細(xì)菌、病毒、霉菌及寄生蟲感染導(dǎo)致的嚴(yán)重合并癥。而且由于免疫抑制作用，引起繼發(fā)性癌癥發(fā)生率增高，如果治療停止后，繼發(fā)癌癥可部分或完全消失。二、超敏反應(yīng)超敏反應(yīng)（hypersensitivity)又稱變態(tài)反應(yīng)（allergy），是指機體對某些抗原初次應(yīng)答后，再次接受相同抗原刺激時，發(fā)生的一種以機體生理功能紊亂或組織細(xì)胞損傷為主的特異性免疫應(yīng)答。變態(tài)反應(yīng)與免疫反應(yīng)本質(zhì)上都是機體對某些抗原物質(zhì)的特異性免疫應(yīng)答，但變態(tài)反應(yīng)主要表現(xiàn)為組織損傷和／或生理功能紊亂，免疫反應(yīng)則主要表現(xiàn)為生理性防御效應(yīng)。（一）外源性化學(xué)物引起的超敏反應(yīng)在生活中，由于職業(yè)暴露、空氣污染、化妝品等使機體通過各種途徑接觸各類化學(xué)物質(zhì)，均可引起各型變態(tài)反應(yīng)，多表現(xiàn)為皮炎、哮喘等?，F(xiàn)僅就引起較常見的這兩種過敏性疾病做一介紹。(1)接觸性皮炎某些染料、油漆、金屬、塑料、藥物等物質(zhì)與人體接觸，使機體致敏，機體再次接觸同樣的物質(zhì)，能發(fā)生濕疹樣反應(yīng)稱接觸性皮炎。這類接觸性皮炎約占整個職業(yè)性皮炎的60％。是由致敏T淋巴細(xì)胞引起的Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，表現(xiàn)為紅腫、硬結(jié)，嚴(yán)重的反應(yīng)可引起局部組織壞死、皮膚潰瘍及剝脫性皮炎。其組織學(xué)表現(xiàn)為血管周圍有單核細(xì)胞，在表皮與真皮間發(fā)生水腫。除了職業(yè)接觸有毒的化學(xué)物質(zhì)外，一些化妝品對某些過敏個體也會引起超敏反應(yīng)?；瘖y品的不良反應(yīng)往往只來自其中某一成分。較易引起不良反應(yīng)特別是炎癥反應(yīng)的是化妝品中的香料（肉桂叉、秘魯香膠等），防腐劑（對羥苯甲酸酯類等），顏料（D-C黃11、曙紅等），基質(zhì)（鯨蠟醇、硬脂醇、羊毛脂、1,2一丙二醇等）等組分。(2)過敏性肺病在過敏性肺病中，最具代表性的是哮喘。在歐洲和美國職業(yè)哮喘人群為0.2％～6％，日本約有15％的哮喘病例與職業(yè)有關(guān)。甲苯二異氰酸酯（TD1）是異氰酸酯類化合物，廣泛應(yīng)用于制造泡沫塑料、黏合劑、橡膠、合成纖維、特種油漆等，對黏膜有刺激作用和致敏作用。另外，各種刺激性氣體，如氯、氨、氮氧化物、光氣、氟化氫、二氧化硫、三氧化硫和硫酸二甲酯等；一些高分子化合物，如酚醛樹脂遇熱釋放出苯酚和甲醛具有刺激作用，聚四氟乙烯塑料受高熱分解出四氟乙烯、六氟丙烯、八氟異丁烯，吸入后引起化學(xué)性肺炎或肺水腫。（二）外源性化學(xué)物引起超敏反應(yīng)的機制1963年Gell和Coombs根據(jù)超敏反應(yīng)發(fā)生的機理和臨床特點，將其分為4種類型，見表10一1。1．I型超敏反應(yīng)I型超敏反應(yīng)發(fā)生速度快，也稱速發(fā)型超敏反應(yīng)（immediatehypersensitivity）或變態(tài)反應(yīng)。經(jīng)呼吸道、皮膚或消化道接觸適當(dāng)抗原，接觸部位的淋巴組織，如扁桃體、支氣管淋巴結(jié)、消化道淋巴組織產(chǎn)生的IgE水平最高，但脾臟產(chǎn)生的最低。血清中IgE濃度也較低，且其生物半衰期短。IgE一旦產(chǎn)生即與局部組織肥大細(xì)胞結(jié)合，進入循環(huán)后與遠(yuǎn)部位的循環(huán)肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和組織肥大細(xì)胞結(jié)合。當(dāng)再次接觸抗原時，即可引起肥大細(xì)胞脫顆粒，釋出預(yù)先形成的介質(zhì)和Th2型細(xì)胞因子，誘導(dǎo)合成白三烯（leukotrienes，LTs)和血栓素（thromboxanes）。這些介質(zhì)促進血管擴張、支氣管收縮和炎癥反應(yīng)，臨床表現(xiàn)多樣，從皮膚蕁麻疹到枯草熱體征，或更為嚴(yán)重疾病如嚴(yán)重的過敏癥。2．Ⅱ型超敏反應(yīng)Ⅱ型超敏反應(yīng)也稱抗體依賴細(xì)胞毒超敏反應(yīng)，由抗體介導(dǎo)。涉及的抗體包括IgG和IgM。組織損傷可由于細(xì)胞毒素的直接作用而引起，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞通過細(xì)胞表面的Fc受休與抗體覆蓋靶細(xì)胞結(jié)合，或通過經(jīng)典途徑激活補體系統(tǒng)，補體激活引起補體C3b或C3d結(jié)合在靶細(xì)胞表面，對效應(yīng)細(xì)胞起趨化作用。另一方面，膜攻擊復(fù)合物也與靶細(xì)胞表面結(jié)合，而使靶細(xì)胞溶解。3．Ⅲ型超敏反應(yīng)Ⅲ型超敏反應(yīng)也涉及IgM和IgG。不同的是，Ⅱ型是抗特異性組織相關(guān)抗原，Ⅲ型則是抗血清可溶性抗原。其結(jié)果是在免疫復(fù)合物沉積部位引起廣泛組織損傷，最常見的部位是在肺、關(guān)節(jié)和腎的血管內(nèi)皮，皮膚和循環(huán)系統(tǒng)也可累及。其病理是由于抗原-抗體復(fù)合物激活補休系統(tǒng)而引起的炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板被吸附到復(fù)合物沉積部位促進了組織損傷。故此型超敏反應(yīng)也稱免疫復(fù)合物介導(dǎo)超敏反應(yīng)。4．Ⅳ型超敏反應(yīng)（細(xì)胞介導(dǎo)超敏反應(yīng)）Ⅳ型或稱遲發(fā)型超敏反應(yīng)（delayedtypehypersensitivity，DTH）可分為兩型：接觸超敏反應(yīng)和結(jié)核菌素超敏反應(yīng)。接觸超敏反應(yīng)是始發(fā)于皮膚表面接觸抗原，且最初病變在表皮，臨床特征是在接觸變應(yīng)原部位濕疹樣反應(yīng)，并由兩相組成：致敏和激發(fā)。半抗原穿透表皮并與蛋白載體形成一種復(fù)合物即發(fā)生致敏。半抗原-載體復(fù)合物經(jīng)朗罕樹突狀細(xì)胞處理后，由表皮遷移至局部淋巴結(jié)，在此由APC將經(jīng)處理的抗原呈遞給CD4+T細(xì)胞。導(dǎo)致克隆擴增并產(chǎn)生記憶T細(xì)胞。激發(fā)是當(dāng)?shù)诙谓佑|抗原時，朗罕樹突狀細(xì)胞再次遷移至淋巴結(jié)并呈遞經(jīng)處理的半抗原-載體復(fù)合物給記憶T細(xì)胞，這些被激活的T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，并使T細(xì)胞進一步增殖和誘導(dǎo)皮膚的角質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)黏附分子。黏附分子的表達(dá)和由T細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞分泌的前炎癥細(xì)胞因子促進炎癥細(xì)胞遷移至皮膚，導(dǎo)致紅斑、丘疹和水疤形成。Coombs和cell將超敏反應(yīng)分為4種類型有助于理解其發(fā)生機制。而在病理上經(jīng)常是幾型超敏反應(yīng)機制聯(lián)合作用的結(jié)果。除此之外，有關(guān)的炎癥反應(yīng)可能是非免疫急性反應(yīng)和／或免疫一介導(dǎo)反應(yīng)，如由酸醉引起的支氣管上皮損傷，細(xì)胞因子釋出誘導(dǎo)非免疫炎癥反應(yīng)，化學(xué)物對炎癥細(xì)胞的直接作用并刺激傳人迷走神經(jīng)，導(dǎo)致反射性支氣管收縮和超敏反應(yīng)，因此該化學(xué)物損傷機制顯示了非免疫機制和4種類型免疫介導(dǎo)超敏反應(yīng)機制的聯(lián)合作用。三、自身免疫應(yīng)答機體對自身組織成分或細(xì)胞抗原性失去免疫耐受性，導(dǎo)致自身免疫效應(yīng)細(xì)胞和自身抗體產(chǎn)生，稱為自身免疫。自身免疫反應(yīng)達(dá)到一定強度以致破壞正常組織結(jié)構(gòu)并引起相應(yīng)臨床癥狀時，就稱為自身免疫病。（一）引起自身免疫病的外源化學(xué)物目前已發(fā)現(xiàn)許多外源化學(xué)物可改變自身細(xì)胞的抗原性質(zhì)或出現(xiàn)新的抗原性，引起自身免疫病，尤其是在易感個體。其中研究最多的是藥物，如肼苯噠嗪和普魯卡因酰胺等藥物可與細(xì)胞內(nèi)組蛋白或DNA結(jié)合，導(dǎo)致抗核抗體的產(chǎn)生，長期使用可引起系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣癥狀。而長期服用藥物α甲基多巴的病人，可以誘發(fā)抗紅細(xì)胞抗體發(fā)生自身溶血性貧血。外源物質(zhì)代謝酶是自身免疫疾病特異性抗體潛在的靶子，抗外源物質(zhì)代謝酶自身抗體，其中最常見的是抗CYP450。藥物代謝后形成的反應(yīng)性代謝產(chǎn)物可聚集在這種代謝酶上，以增加新抗原的量并可保護細(xì)胞免受反應(yīng)性代謝產(chǎn)物的毒作用，一旦形成新抗原，即被呈遞至免疫系統(tǒng)，引發(fā)自身免疫應(yīng)答。第三節(jié)免疫毒理學(xué)檢測一、免疫毒性檢測方案大多數(shù)化學(xué)物對人體產(chǎn)生免疫毒性的潛在性評價是建立在動物試驗的多礎(chǔ)上．很多用于動物研究的試驗近似于或至少類似于上面所提及的臨床評價．然而，在動物中直接用于檢測毒性終點的研究．如免疫病理的發(fā)展或感染性疾病擾性的缺失，就難于或不可能應(yīng)用于臨床評價。1.小鼠免疫毒性檢測方案參考國外學(xué)者推薦的免疫毒性檢測方案，考慮到目前我國免疫毒理學(xué)工作開展的現(xiàn)況，我國學(xué)者推薦了國內(nèi)進行免疫毒性檢測的方案(表10-7)。表10-7國內(nèi)推薦的實驗動物免疫毒性檢測方案(北京醫(yī)科大學(xué)毒理室，1991)項目檢測內(nèi)容病理毒性臟器重量：體重、脾臟重、胸腺重一般血液學(xué)檢查：白細(xì)胞總數(shù)及分類體液免疫對胸腺依賴抗原——羊紅細(xì)胞的抗體空斑反應(yīng)(PFC)血清抗體滴度(血凝法、ELISA法)用有絲分裂原(LPS)刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞免疫T細(xì)胞數(shù)——ANAE染色法用有絲分裂原(ConA、PHA)刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)巨噬細(xì)胞功能腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬作用單核巨噬細(xì)胞對碳粒的廓清能力宿主抵抗力對腫瘤細(xì)胞的敏感性(TD10-20)內(nèi)毒素的過敏反應(yīng)(LDl0-20)2..人群免疫毒性檢測方案80年代由美國國家研究委員會(NationalResearchCouncil，NRC)提出的人群免疫毒性檢測方案分為三個階段，所有接觸免疫毒物的人均需進行第一階段檢測，在第一階段檢測中發(fā)現(xiàn)有異常的人及選擇部分接觸人群進行第二階段檢測，第三階段檢測是在第二階段中發(fā)現(xiàn)有異常的人中進行。世界衛(wèi)生組織(WHO)也對人群免疫毒性檢測提出建議，在WHO推薦的方案中包括七個方面：血液學(xué)檢查、體液免疫、細(xì)胞免疫、非特異性免疫、淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)記、自身抗體、臨床化學(xué)檢查等。表10-8為WHO提出的人群免疫毒性檢測方案。表10-8WHO推薦的人群免疫毒性檢測方案(WHO，1992)1全血細(xì)胞計數(shù)及分類2抗體介導(dǎo)免疫(檢測一項或多項)對蛋白抗原的初次抗體反應(yīng)血清中免疫球蛋白水平(IgM，IgG，IgA，IgE)對蛋白抗原的二次抗體反應(yīng)(白喉、破傷風(fēng)或脊髓灰質(zhì)炎)對回憶抗原的增殖反應(yīng)3用流式細(xì)胞儀分析淋巴細(xì)胞的表型分析淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記Cly3，CD4，CD8，CD204細(xì)胞免疫用試劑盒檢測皮膚遲發(fā)型過敏反應(yīng)對蛋白抗原(KLH)的初次DTH反應(yīng)對血型抗原的天然免疫(如抗A，抗B)5自身抗體和炎癥C—反應(yīng)蛋白自身抗體滴度對過敏原產(chǎn)生的IgE水平6非特異性免疫的檢測NK細(xì)胞數(shù)(CD56或CD60)或?qū)562細(xì)胞的溶解性吞噬作用(NBT或化學(xué)發(fā)光)7臨床化學(xué)指標(biāo)檢測二、免疫抑制的檢測方法1.免疫病理學(xué)檢查包括淋巴器官重量、病理檢查及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記。(1)淋巴器官重量：實驗動物接觸外源化學(xué)物后，對免疫系統(tǒng)的毒性作用可表現(xiàn)為淋巴器官重量的改變。通過稱重了解淋巴器官重量的變化，最常用來檢測淋巴器官重量的是胸腺、脾臟、淋巴結(jié)。根據(jù)接觸外源化學(xué)物的途徑，對不同部位的淋巴結(jié)進行稱重，如經(jīng)口接觸則對腸系膜淋巴結(jié)稱重，經(jīng)呼吸道接觸對支氣管淋巴結(jié)稱重。進行腸系膜淋巴結(jié)稱重時應(yīng)注意將周圍的脂肪組織去除干凈，以保證稱重的準(zhǔn)確。(2)病理檢查：除對胸腺、脾臟及淋巴結(jié)進行病理檢查外，根據(jù)暴露途徑的不同，對粘膜免疫系統(tǒng)和皮膚免疫系統(tǒng)的組織病理也應(yīng)進行檢查。開始用常規(guī)的蘇木素—伊紅染色，進一步針對特殊的細(xì)胞類型可采用免疫酶染色法。有許多單克隆抗體可用來對小鼠、大鼠及人的免疫細(xì)胞的分化抗原、細(xì)胞粘附分子及活化的標(biāo)記進行測定。組織病理學(xué)的檢查只能對所產(chǎn)生的影響做半定量的估計。(3)FACS檢測細(xì)胞表面標(biāo)記：熒光激活的細(xì)胞分類儀(fluorescenceactivatedcellsortor，F(xiàn)ACS)是用于流式細(xì)胞術(shù)的一種自動分析儀器，利用免疫熒光與細(xì)胞生物學(xué)、流體力學(xué)、光學(xué)和電子計算機等多種技術(shù)，進行細(xì)胞和分子水平研究。用FACS分析外源化學(xué)物對細(xì)胞表面標(biāo)記的影響，是鑒定化學(xué)物免疫毒性十分敏感的指標(biāo)。2.淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖試驗是測定B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞功能的簡便方法，重復(fù)性也較好。在進行該試驗時需用有絲分裂原刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，常用的有絲分裂原有細(xì)菌脂多糖(LPS)、植物血凝素(PHA)、刀豆素(ConA)等，LPS主要刺激B淋巴細(xì)胞，PHA、ConA刺激T淋巴細(xì)胞。經(jīng)刺激后增殖的淋巴細(xì)胞用形態(tài)學(xué)方法、同位素?fù)饺敕ê捅壬治龇ㄟM行檢測。形態(tài)學(xué)方法簡單，在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，但客觀性差。同位素?fù)饺敕ǔＳ?H—TdR摻人到DNA后，用液體閃爍儀進行測定，以cpm數(shù)來表示轉(zhuǎn)化程度，在一般實驗室進行。1983年Mosmann介紹一種比色分析測定活細(xì)胞及增殖細(xì)胞，它的原理是產(chǎn)生甲躦(fonnazan)。甲躦是一種紫色結(jié)晶，用酸性異丙醇或二甲基亞砜溶解結(jié)晶后，在ELISA儀或721分光光度計上測定，根據(jù)顏色深淺判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度。該法簡單、快速，在對一定數(shù)量細(xì)胞測定時，具有與同位素?fù)饺胪瑯拥撵`敏度，值得推廣。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)在檢測外源化學(xué)物對免疫系統(tǒng)毒性上不是一個靈敏的方法，這是因為細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下，需經(jīng)幾天時間才能達(dá)到反應(yīng)的高峰，這段時間有些受到損傷的細(xì)胞得到恢復(fù)，這是體外試驗或半體外試驗中一個共同的問題。3.體液免疫功能有許多方法可用來檢測體液免疫功能，包括抗體形成細(xì)胞(plaqueformingcell，PFC)、抗體產(chǎn)生的量及B細(xì)胞受體等。在檢測外源化學(xué)物引起實驗動物體液免疫功能變化上，最常用的方法是PFC測定。在PFC測定時需用抗原免疫動物，常用的抗原有綿羊紅細(xì)胞(SRBC)、牛血清白蛋白(BSA)、鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)及脂多糖(LPS)等。動物經(jīng)SRBC免疫后4~5天，血清中出現(xiàn)特異性抗體，脾臟中有大量抗體形成細(xì)胞。對抗體可用血凝法、酶免疫吸附分析法(ELISA)、免疫電泳、免疫擴散等方法進行檢測，對抗體形成細(xì)胞可用Jeme改良玻片法、Cunningham小室法進行測定，方法簡單、特異，不需要特殊的儀器，在很多實驗室里均可進行。實驗結(jié)果以PFC／106脾細(xì)胞或PFC／全脾來表示，如果PFC減少與劑量有關(guān)，表明有免疫抑制作用。4.細(xì)胞免疫功能檢測檢測細(xì)胞免疫功能的方法有體內(nèi)法和體外法。體內(nèi)法包括遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、皮膚移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)；體外法有淋巴細(xì)胞增殖、T細(xì)胞毒性及淋巴因子的產(chǎn)生等。體外法雖然經(jīng)常采用，但是體內(nèi)法測定遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)應(yīng)用更廣。通常遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)可以反映機體細(xì)胞免疫狀況。對實驗動物進行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)檢測時，常用的抗原有KLH，BSA，SRBC等。它是將抗原定量注入皮內(nèi)，24~48h后觀察結(jié)果，若注射部位出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)為陽性結(jié)果。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是在整體動物身上進行的試驗，它比用體外試驗更能反映外源化學(xué)物對機體免疫功能的影響。Luster(1992年)報道，在小鼠身上進行DTH反應(yīng)測定，對鑒定外源化學(xué)物的免疫毒性有很好的預(yù)測價值，當(dāng)與NK細(xì)胞檢測及PFC測定結(jié)果一起進行分析，其預(yù)測價值就更高。5.NK細(xì)胞活性檢測NK細(xì)胞在機體抗腫瘤、抗感染及免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用，外源化學(xué)物對NK細(xì)胞活性的影響已越來越受到重視。檢測NK細(xì)胞活性的方法主要有同位素釋放法和乳酸脫氫酶(LDH)釋放法。檢測人NK細(xì)胞活性常用14562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，測定小鼠脾臟NK細(xì)胞活性用YAC-1細(xì)胞株作為靶細(xì)胞。同位素釋放法雖較客觀、靈敏，但需價格昂貴的儀器，并有放射性污染環(huán)境的問題。LDH釋放法同樣可得到客觀、準(zhǔn)確的結(jié)果，卻無上述的缺點，因此它不失為檢測NK細(xì)胞活性較好的方法。6.宿主抵抗力檢測外源化學(xué)物誘發(fā)免疫毒性可表現(xiàn)為機體對感染因子或腫瘤細(xì)胞的抵抗力發(fā)生改變。宿主抵抗力的檢測大部分是在小鼠身上進行的，包括對細(xì)菌、病毒、寄生蟲及可移植腫瘤細(xì)胞的抵抗力，只有個別是在大鼠身上進行的。常用的細(xì)菌有李斯特菌、鏈球菌、綠膿桿菌等，病毒有腦炎—心肌病毒(EMC)、單純皰疹性病毒(HSV)、流感A型病毒(FLU)等，常用的寄生蟲有毛線蟲和瘧原蟲，腫瘤細(xì)胞有PYB6細(xì)胞株，是由多形瘤病毒(Polymavires)在C57BL／6小鼠誘發(fā)的一種腫瘤，除此而外，還可用B16F10黑色素瘤細(xì)胞株、Madisonl09肺癌細(xì)胞株和LsL~s肺癌細(xì)胞株等。在進行宿主抵抗力檢測時，所用感染因子的劑量及動物數(shù)是十分重要的，因為劑量太高太低都得不到滿意的結(jié)果。在NIEHS實驗室里過去所選用的劑量為使10％~30％對照組動物產(chǎn)生腫瘤或死亡，目前將所用的劑量略降低而使實驗的敏感性有所提高。盡管很多宿主抵抗力試驗在操作上很簡單，但需要較多的動物，與免疫功能檢測相比其敏感性較差。因此在免疫毒性篩選上，一般不做宿主抵抗力檢測。三、超敏反應(yīng)的檢測方法1.皮膚超敏反應(yīng)的檢測外源化學(xué)物引起皮膚超敏反應(yīng)的檢測方法最常用的有兩種，即局部封閉涂皮法(Buehlertest，BT)及皮內(nèi)和涂皮相結(jié)合的方法(GuineaPigMaximizationTest，GPMT)，局部涂皮法用于強致敏物的篩選，致敏途徑與實際接觸途徑相似，操作簡便，但接觸劑量不易控制。皮內(nèi)和涂皮相結(jié)合的方法，致敏性強，檢出率高，尤適于弱致敏物的檢測，該兩種方法均以豚鼠為實驗?zāi)Ｐ停嗍髮嶒灧椒ǚ彪s，費用較貴，近年來發(fā)展兩種檢測方法，小鼠耳腫實驗(mouseearswellingtest，MEST)及嚙齒類局部淋巴結(jié)實驗(murinelo-csllymphnodeassay，LLNA)由于方法簡單，小鼠價格低廉，實驗用材少，而且能較好的預(yù)測人群接觸外源化學(xué)物的致敏性，得到廣泛應(yīng)用。2.呼吸道超敏反應(yīng)的檢測可采用激發(fā)試驗、血清中IgE的檢測及輔助T細(xì)胞(Th2)分泌的因子等。激發(fā)試驗是模擬自然發(fā)病條件，以少量抗原引起一次較輕的超敏反應(yīng)發(fā)作，用以確定過敏原的試驗，主要用于I型超敏反應(yīng)。常用的激發(fā)試驗有支氣管激發(fā)試驗，鼻粘膜激發(fā)試驗等，血清中IgE檢測對I型超敏反應(yīng)的診斷和超敏原的確定有價值，常用的檢測方法有放射免疫吸附試驗(BAST)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)及間接血凝法。四、免疫毒理學(xué)研究中應(yīng)考慮的問題（一）體內(nèi)試驗1.實驗動物選擇在免疫毒理學(xué)研究中，最常用的是嚙齒類動物，因為對嚙齒類動物及其細(xì)胞成分了解的最多，而且有各種商品化的試劑。除嚙齒類動物外，魚類也用的較多，魚類生活在自然環(huán)境中，是研究環(huán)境污染物對機體免疫功能影響很好的模型。在進行免疫毒理學(xué)研究時，最好選用純系動物，這樣可以減少個體差異，美國NTP推薦用B6C3F2.接觸受試物的時間實驗動物接觸受試物時間的長短，對免疫系統(tǒng)的影響不同。對有些藥物如抗菌素在臨床上應(yīng)用時間較短，實驗動物接觸1～2周即可，長時間的接觸會產(chǎn)生耐受。然而對某些長期使用的藥物，動物接觸至少一個月，以評價藥物的長期作用。3.接觸受試物的劑量在進行免疫毒性檢測時，應(yīng)避免選用有明顯一般毒性的劑量。為了確定劑量—反應(yīng)關(guān)系及未觀察到不良影響的水平(NOAEL)，至少應(yīng)設(shè)三個劑量。高劑量要低于產(chǎn)生明顯毒性的劑量，一般應(yīng)低于LD10量應(yīng)不引起免疫毒性，在高劑量與低劑量間設(shè)一中間劑量。選擇適當(dāng)?shù)膭┝渴鞘种匾模貏e是對實驗結(jié)果的解釋上，不能受嚴(yán)重的應(yīng)激及營養(yǎng)不良的影響與干擾。4.實驗中用的抗原抗原的來源、給予途徑、劑量、免疫后檢測時間等均對免疫反應(yīng)有一定的影響。羊紅細(xì)胞(SRBC)是最常用的抗原，建議采用靜脈注射途徑，劑量以每只小鼠5×106～1.5×108個細(xì)胞為宜。5.注意免疫毒性的器官特異性如5—氟尿嘧啶抑制小鼠脾臟及肺臟的NK細(xì)胞活性，但卻增強腸道NK細(xì)胞活性。6.重視局部免疫功能的檢測有些外源化學(xué)物經(jīng)呼吸道進人體內(nèi)，其主要的靶器官是肺，因此對肺臟局部免疫的影響則應(yīng)引起足夠的注意。對肺部免疫功能的檢測包括干擾素的產(chǎn)生、肺臟巨噬細(xì)胞功能、自然殺傷細(xì)胞活性、細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性等。（二）體外試驗體外試驗常用在機理的探討上，如果用體外試驗進行安全性評價時，有以下幾個問題：1.免疫系統(tǒng)是一個復(fù)雜的和由許多細(xì)胞、分子組成的精細(xì)的生理調(diào)節(jié)系統(tǒng)，任何一種體外系統(tǒng)都很難模擬。在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中可加人S9混合物，但S9也不能代表所有的代謝酶。2.細(xì)胞在體外生存環(huán)境發(fā)生很大變化，隨著細(xì)胞在體外培養(yǎng)時間延長，傳代次數(shù)增多，細(xì)胞的生理、生化、代謝方面都發(fā)生很大變化，這將影響實驗結(jié)果。3.“神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫”三大系統(tǒng)在體內(nèi)相互作用，相互制約，構(gòu)成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，任何環(huán)節(jié)的紊亂或失調(diào)都能直接或間接影響其他系統(tǒng)的功能，這三大系統(tǒng)也只有在體內(nèi)才能發(fā)揮作用。正因為如此，有時體內(nèi)、體外實驗結(jié)果不一致，從而造成過高或過低估計免疫毒性效應(yīng)，在進行安全性評價時用體外濃度難以推算體內(nèi)濃度。（三）免疫功能改變的生物學(xué)及臨床意義對實驗動物免疫毒性檢測應(yīng)綜合考慮其統(tǒng)計學(xué)的意義和生物學(xué)意義，特別是注意分析其劑量一反應(yīng)和毒性的可逆性。而且，涉及多個細(xì)胞、多種成分的免疫功能改變要比單一的檢測終點的改變更具有生物學(xué)意義。人群免疫毒性檢測，對于確定外源化學(xué)物對人體免疫毒性有十分重要的意義。第四節(jié)檢測食品中化學(xué)物免疫毒性的常用方法要鑒定食品中化學(xué)物對免疫功能的影響，必須建立一些靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法。由于免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性，參與免疫應(yīng)答的器官不是單一的，參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞也是多種多樣的，因此要確定食品中某一化學(xué)成分對免疫功能的影響，決不是用一個實驗就能說明的，需要進行一組實驗來研究其對體液免疫、細(xì)胞免疫以及單核巨噬細(xì)胞的功能等的影響。（一）細(xì)胞學(xué)和免疫病理學(xué)檢查可進行血液學(xué)檢查，主要進行白細(xì)胞總數(shù)的測定和白細(xì)胞的分類計數(shù)。為了檢測外源性化學(xué)物對實驗動物機體的免疫功能是否有不良影響，在實驗結(jié)束后常又要對其胸腺及脾等免疫器官及動物肝臟和腎臟進行大體觀察，并稱其重量，計算其臟器系數(shù)，必要時進行組織學(xué)檢查。臟器系數(shù)是指每100g體重的某一臟器（濕重）的重量（g）。胸腺萎縮與否是評價細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的一個十分有用的指標(biāo)，脾臟重量減輕或脾淋巴濾泡的萎縮表明機體的體液免疫功能降低。（二）細(xì)胞免疫功能的測定1.酸性α-醋酸萘酯酶（ANAE）測定淋巴細(xì)胞中含有各種酶類,不同的淋巴細(xì)胞亞群所含的酶類不同，其含量和酶譜均有不同。T淋巴成熟期可明顯增加酸性α-醋酸萘酯酶的活性。因此可用細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)法檢測ANAE，作為鑒別T淋巴細(xì)胞的一種方法。其檢測原理是T淋巴細(xì)胞漿內(nèi)的ANAE，在弱酸性條件下能使底物α-醋酸萘酯水解成醛酸和α-萘酚。后者與六偶氮副品紅偶聯(lián)，生成不溶性的紅色沉淀物，沉積在T淋巴細(xì)胞漿內(nèi)酯酶所在的部位。經(jīng)甲基綠復(fù)染，反應(yīng)顆粒變暗而呈紅黑色。在顯微鏡油鏡下觀察ANAE陽性的淋巴細(xì)胞呈灰或灰綠色，胞漿內(nèi)有大小不等、數(shù)量不一，界限分明的紅黑色顆?；虬邏K。ANAE陰性的淋巴細(xì)胞呈淡綠或棕黃色，無著色顆粒。每份標(biāo)本至少計數(shù)100~200個淋巴細(xì)胞，求ANAE的陽性率。2.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗可采用外周血分離淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法或微量全血培養(yǎng)法。其原理是將外周血或分離的白細(xì)胞和植物血球凝集素（PHA）混合進行體外培養(yǎng)，數(shù)日后取培養(yǎng)細(xì)胞作涂片染色和鏡檢，可見大部分淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為體積較大的原始淋巴母細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)生成核仁，并有部分細(xì)胞發(fā)生分裂的現(xiàn)象。由于PHA只激發(fā)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因此計數(shù)200個淋巴細(xì)胞，計算出轉(zhuǎn)化細(xì)胞的百分率，即得淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（簡稱轉(zhuǎn)化率）。T淋巴細(xì)胞主要參與機體的細(xì)胞免疫，故淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗反映的是機體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。此外3H-胸腺嘧啶核苷（簡稱3H-TdR）摻入實驗也是體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗的一種方法，該方法客觀、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確。其原理是當(dāng)淋巴細(xì)胞受到分裂原（如PHA等）或特異性抗原刺激而發(fā)生轉(zhuǎn)化時，必然伴有DNA的大量合成，此時若將具有放射性的3H-TdR加到培養(yǎng)液內(nèi)，則可作為DNA的原料被攝入轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)，因此測定細(xì)胞內(nèi)放射性物質(zhì)的相對數(shù)量（以脈沖數(shù)表示），就能客觀地反映淋巴細(xì)胞對刺激物的應(yīng)答水平。目前國外的免疫毒理學(xué)工作者常常選擇混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法來進行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗?；旌狭馨图?xì)胞培養(yǎng)又可分成雙向法和單向法兩種。雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法的原理是將同種異體的淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，由于相互刺激，使雙方淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖、分化和形態(tài)上出現(xiàn)母細(xì)胞化的轉(zhuǎn)變。其增殖程度與不相容性程度成正比，因此免疫毒理學(xué)實驗中常將淋巴細(xì)胞增殖程度看作為淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力強弱的標(biāo)志。單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法的原理主要是應(yīng)用檢測混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中某一方淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力，將另一方的淋巴細(xì)胞先以X射線或自力霉素C處理，使其失去增殖反應(yīng)能力但仍保持抗原性，作為刺激細(xì)胞與被檢淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，以檢測未經(jīng)處理的被檢淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)能力。3.二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）是依賴T細(xì)胞的反應(yīng)，其主要特征是致敏機體在抗原攻擊部位出現(xiàn)遲發(fā)型炎癥反應(yīng)，又稱接觸性過敏反應(yīng)。其檢測原理是二硝基氟苯（DNFB）為一種半抗原，將其稀釋后涂抹于動物的腹壁皮膚，4-7天后再將其涂抹于耳部或足、爪皮膚，使局部產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。一般在抗原攻擊后24~48小時反應(yīng)達(dá)到高峰，因此在此時測定腫脹程度。4.CD4／CD8比值的測定T細(xì)胞按其表面抗原及其在免疫應(yīng)答中的功能分為CD4和CD8兩大亞群。在正常免疫應(yīng)答的情況上，T細(xì)胞亞群之間存在著促進或制約的關(guān)系，即CD4和CD8的比值是穩(wěn)定的。而當(dāng)CD4和CD8之間的平衡遭到破壞時，就會表現(xiàn)出異樣的免疫應(yīng)答，如免疫缺陷或自身免疫疾病。在免疫毒理學(xué)的實驗中，測定CD4和CD8的比值可直接反應(yīng)出細(xì)胞免疫的狀況。此方法簡單、快速、是國外免疫毒性實驗的首選指標(biāo)之一。目前檢測CD4／CD8比值的方法有兩大類，即免疫熒光法和免疫酶標(biāo)記法。免疫熒光法的原理是將淋巴細(xì)胞加以分離，制成薄涂片，干燥固定后用熒光標(biāo)記的CD單克隆抗體染色，洗去未結(jié)合的熒光抗體后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，計算CD4／CD8比值。免疫酶法測定的原理基本與熒光法相同，只是實驗中用兔抗鼠IgG抗體為二抗代替熒光抗體，加入酶底物后陽性細(xì)胞顯色，用普通光學(xué)顯微鏡即可觀察結(jié)果。（三）體液免疫功能測定1.溶血空斑實驗該實驗簡稱PFC實驗，又稱抗體生成細(xì)胞的檢測，是體外檢查和計數(shù)產(chǎn)生IgM及其他類型Ig抗體生成細(xì)胞的一種方法。瓊脂平板溶血空斑實驗的原理是將羊紅細(xì)胞免疫4天的小鼠取出脾臟制成脾細(xì)胞懸液，在半固體瓊脂凝膠介質(zhì)中使脾細(xì)胞與羊紅細(xì)胞混合，澆在平皿內(nèi)使之形成薄層，37℃除瓊脂平板溶血空斑實驗也可采用瓊脂玻片溶血空斑實驗，其原理與瓊脂平板法相同。間接進行溶血素測定（或半數(shù)溶血值測定）也可作為抗體生成細(xì)胞檢測的方法。其原理是經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫過的動物，其淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生抗體－溶血素，并釋放至外周血中。分離出致敏動物的血清，與綿羊紅細(xì)胞一起培養(yǎng)，在補體參與下可以產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。致敏動物血清中溶血素的含量可以通過溶血過程中釋放的血紅蛋白的量測出。2.單項免疫擴散實驗測定血清中