食品毒理學(xué) 外源化學(xué)物的致癌作用學(xué)習(xí)課件

PAGEPAGE12第九章外源化學(xué)物的致癌作用腫瘤毒理學(xué)的一部分。腫瘤在死因排位中穩(wěn)居前三位已逾40年,與此同時(shí),死亡人數(shù)逐年攀升。（2007年出版）腫瘤尤其是惡性腫瘤是危害健康和生命的常見(jiàn)病之一，調(diào)查研究的結(jié)果顯示，在死因排位上，惡性腫瘤死亡占城市居民死亡原因之首，在農(nóng)村居民中位居第三。在死亡者的比例上每５個(gè)死亡者中有１個(gè)死于惡性腫瘤。2012年，全國(guó)腫瘤登記中心收到全國(guó)104個(gè)腫瘤登記處2009年腫瘤登記數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)上報(bào)數(shù)據(jù)的綜合審核，有72個(gè)登記處的數(shù)據(jù)入選，以反映2009年我國(guó)腫瘤登記覆蓋地區(qū)惡性腫瘤的發(fā)病與死亡水平。入選資料覆蓋人口達(dá)8547萬(wàn)，包括了31個(gè)城市地區(qū)（5749萬(wàn)人）和41個(gè)農(nóng)村地區(qū)（2789萬(wàn)人），登記結(jié)果令人震驚。全國(guó)登記地區(qū)發(fā)病率（粗率）285.91/10萬(wàn)，中國(guó)人口標(biāo)化率為146.87/10萬(wàn)，累計(jì)率（0～74歲）為22.08%。全國(guó)登記地區(qū)惡性腫瘤死亡率（粗率）為180.54/10萬(wàn)，中國(guó)人口標(biāo)化率為85.06/10萬(wàn)，累計(jì)率（0～74歲）為我國(guó)居民因癌死亡的幾率為12.94%。這讓也就意味著，約每5個(gè)人中就可能有一個(gè)人會(huì)罹患癌癥，約每8個(gè)人中就可能有一個(gè)人會(huì)死于癌癥！惡性腫瘤發(fā)病惡性腫瘤發(fā)病前十位主要是肺癌、消化系統(tǒng)癌（胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、食管癌、胰腺癌）、乳腺癌、淋巴瘤、膀胱癌、甲狀腺癌。這十類腫瘤占全部惡性腫瘤發(fā)病的76.39%。第一節(jié)化學(xué)致癌物質(zhì)一、人類化學(xué)致癌物附錄：IARC關(guān)于化學(xué)物質(zhì)致人類癌癥危險(xiǎn)性分類只與一種化學(xué)物致癌性證據(jù)的充分性(證據(jù)權(quán)重)有關(guān)，而并不涉及其致癌活性大小及其機(jī)制。IARC將化學(xué)物對(duì)人類致癌性資料(流行病學(xué)調(diào)查和病例報(bào)告)和對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致癌性資料分為四級(jí)：致癌性證據(jù)充分、致癌性證據(jù)有限、致癌性證據(jù)不足及證據(jù)提示缺乏致癌性。對(duì)人致癌性證據(jù)充分是指在致癌物和人癌癥發(fā)生之間有因果關(guān)系。致癌性證據(jù)有限是指因果關(guān)系的解釋是可信的，但其他的解釋如偶然性、偏倚、混雜因素不能完全排除。致癌性證據(jù)不足是指資料的性質(zhì)、一致性或統(tǒng)計(jì)學(xué)把握度不足以判斷因果關(guān)系或沒(méi)有對(duì)人致癌性的資料。證據(jù)提示缺乏致癌性是指有幾個(gè)在已知人類充分暴露水平范圍內(nèi)的研究表明暴露水平與所研究的癌癥無(wú)關(guān)聯(lián)。分類為人致癌物(組1)必須要有流行病學(xué)證據(jù)的支持。流行病學(xué)研究(隊(duì)列研究和病例對(duì)照研究)試圖為化學(xué)品接觸與人群癌癥發(fā)生(或死亡)增加的因果關(guān)系提供證據(jù)。癌癥流行病學(xué)研究是比較困難的，一般是在人群接觸某種化學(xué)品多年之后進(jìn)行，可能有很多混雜因素，并往往受到經(jīng)費(fèi)和時(shí)間的限制。為治療目的給以化學(xué)品(藥品)和職業(yè)性接觸，較易控制接觸條件，但個(gè)體數(shù)和接觸期限也往往受到限制。因此，對(duì)于很多化學(xué)品需要由動(dòng)物致癌試驗(yàn)、短期試驗(yàn)等為接觸此化學(xué)品的致癌危險(xiǎn)性提供論據(jù)(主要用于危害鑒定)?；瘜W(xué)致癌物為凡能引起動(dòng)物和人類腫瘤、增加其發(fā)病率或死亡率的化合物，比如黃曲霉毒素、3,4一苯并（a）芘及苯等?；瘜W(xué)致癌作用是化學(xué)致癌物在人體內(nèi)引起腫瘤的過(guò)程。到20世紀(jì)90年代中期為止，國(guó)際癌癥研究中心（IARC)2002年共評(píng)述了878種化學(xué)物質(zhì)。根據(jù)證據(jù)的強(qiáng)度將已評(píng)述的化學(xué)物質(zhì)分為四組：(1)Ⅰ組對(duì)人類確是致癌物，是指在人類流行病學(xué)及動(dòng)物致癌實(shí)驗(yàn)中均有充分證據(jù)的致癌物，有87種；(2)II組對(duì)人類是很可能或可能是致癌物。又分為兩組，II組2A和II組2B。①Ⅱ組2A：對(duì)人類很可能是致癌物，是指對(duì)人類致癌性證據(jù)有限，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物致癌性證據(jù)充足，有63種；②Ⅱ組2B：對(duì)人類是可能致癌物，是指對(duì)人類致癌性證據(jù)有限，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物致癌性證據(jù)并不充分，或是指對(duì)人類致癌性證據(jù)不足，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物致癌性證據(jù)充分，有234種；(3)Ⅲ組可疑致癌物，現(xiàn)有的證據(jù)不能對(duì)人類致癌性進(jìn)行分類，有493種；(4)Ⅳ組非致癌物，對(duì)人類可能是無(wú)致癌作用，有1種。IARC已確定的人類致癌物或生產(chǎn)方式及其靶器官見(jiàn)表9一1。根據(jù)化學(xué)致癌物對(duì)細(xì)胞成分作用及引起癌癥發(fā)生的機(jī)制不同可分為遺傳毒性致癌物和非遺傳毒性致癌物。(1)遺傳毒性致癌物化學(xué)致癌物或其代謝物與DNA共價(jià)結(jié)合，引起基因突變或染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變導(dǎo)致癌變，稱為遺傳毒性致癌物。這類致癌物占化學(xué)致癌物的大多數(shù)，因其作用機(jī)制是損傷遺傳物質(zhì)，可利用遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)該類致癌物。①直接致癌物：本身直接具有致癌作用，在體內(nèi)不需要經(jīng)過(guò)代謝活化即可致癌。例如，各種烷化劑，大多數(shù)為親電子反應(yīng)物。這類物質(zhì)絕大多數(shù)是合成的有機(jī)物。包括有內(nèi)酯類如β-丙烯內(nèi)酯等；烯化環(huán)氧化物如1，2，3，4-丁二烯環(huán)氧化物；亞胺類；硫酸酯類；芥子氣和氮芥；活性鹵代烴類等等。

②間接致癌物：本身并不直接致癌，必須在體內(nèi)經(jīng)代謝活化，其所形成的代謝產(chǎn)物才具致癌作用。例如，多環(huán)芳烴、芳香胺類化合物等。前致癌物分為天然和人工合成兩大類。人工合成的主要有：多環(huán)或雜環(huán)芳烴類如苯并（a）芘、3-甲基膽蒽等；單環(huán)芳香胺類如鄰甲苯胺等；雙環(huán)或多環(huán)芳香胺類如聯(lián)苯胺等；喹啉類；硝基呋喃類；硝基雜環(huán)類；烷基肼類等等。天然物質(zhì)主要有黃曲霉毒素、環(huán)孢素A、煙草和煙氣、檳榔及酒精性飲料。

③無(wú)機(jī)致癌物：有些可能是親電子劑，但有些是通過(guò)選擇性改變DNA復(fù)制保真性，導(dǎo)致DNA的改變，如金屬鎳、鉻。鈾、鐳、氡等可能由于其放射性致癌。鎳、鉻、鈦、錳等金屬及其鹽類可在一定條件下致癌。

在無(wú)機(jī)致癌物中，有些能損傷DNA，但有些可能通過(guò)改變DNA聚合酶而致癌。(2）非遺傳毒性致癌物化學(xué)致癌物或其代謝物不直接作用遺傳物質(zhì)，而作用于遺傳物質(zhì)以外的生物大分子，稱為非遺傳毒性致癌物。①促長(zhǎng)劑：本身無(wú)致癌性，在給以遺傳毒性致癌物之后再給以促長(zhǎng)劑可增強(qiáng)遺傳毒性致癌物的致癌作用，也可促進(jìn)“自發(fā)性”轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)展成癌。例如，佛波脂（TPA及其衍生物）、苯巴比妥、二丁基羥基甲苯（BHT）、1,8,9一蒽三醇、DDT，ALkanes及膽鹽等。如TPA是小鼠皮膚癌誘發(fā)試驗(yàn)的促癌劑；苯巴比妥對(duì)大鼠肝癌有促癌作用；色氨酸和糖精對(duì)膀胱癌有促癌作用；丁基羥甲苯、DDT、多鹵聯(lián)苯、氯丹、七氯和四氯二苯并對(duì)二惡英（TCDD）等。②內(nèi)分泌調(diào)控劑：主要改變內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡及細(xì)胞正常分化，常起促長(zhǎng)劑作用。例如乙烯雌酚、雌二醇、硫脲等。如孕婦使用雌性激素（已烯雌酚）保胎可能使其女兒在青春期發(fā)生陰道透明細(xì)胞癌。有些物質(zhì)不是激素，但干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)而致癌，如3-氨基三唑誘發(fā)大鼠甲狀腺腫瘤與干擾甲狀腺素合成有關(guān)。③免疫抑制劑：主要對(duì)病毒誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化起增強(qiáng)作用。例如，嘌呤同型物。如硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤等免疫抑制劑或免疫血清均能使動(dòng)物和人發(fā)生白血病或淋巴瘤，但很少發(fā)生實(shí)體腫瘤。④細(xì)胞毒劑：可能引起細(xì)胞死亡，導(dǎo)致細(xì)胞增殖活躍及癌發(fā)展。例如，次氮基三乙酸及氯仿等。次氮基三乙酸使鋅進(jìn)入腎臟，由于鋅的毒性，造成細(xì)胞死亡，結(jié)果引起增生和腎腫瘤。⑤過(guò)氧化物酶體增殖劑：過(guò)氧化物酶體增殖可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基過(guò)量生成。例如，祛脂乙酯、鄰苯二甲酸乙基己酯。能使嚙齒動(dòng)物肝臟中的過(guò)氧化物酶體增生的各種物質(zhì)都可誘發(fā)肝腫瘤。如降血脂藥安妥明、降脂異丙酯、增塑劑二-苯二甲酸酯和有機(jī)溶劑1，1，2-三氯乙烯。

⑥固體物質(zhì)：物理狀態(tài)是關(guān)鍵性因素，可能涉及細(xì)胞毒性。例如，塑料、石棉等。動(dòng)物皮下包埋塑料后，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)的潛伏期，可導(dǎo)致肉瘤形成。石棉在人和動(dòng)物的胸膜表面可引起胸膜間皮瘤。石棉和其他礦物粉塵，如鈾礦或赤鐵礦粉塵，可增強(qiáng)吸煙致肺癌的作用。二、化學(xué)致癌物的代謝活化與滅活致癌物通過(guò)不同途徑進(jìn)入人體后，有些可直接與靶分子起作用，有些需經(jīng)過(guò)Ⅰ、Ⅱ相代謝，所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物才有致癌活性（代謝活化）。各種有活性的致癌物再經(jīng)歷不同的代謝過(guò)程成為致癌性減弱、極性增高的產(chǎn)物排出體外（代謝滅活）。不同致癌物的代謝活化與代謝滅活的過(guò)程不一，但都受一系列I、II相酶所催化，代謝酶活性強(qiáng)弱直接左右代謝過(guò)程的強(qiáng)弱程度，最終影響到達(dá)靶子的有效劑量，此劑量被稱為生物有效劑量，它是體內(nèi)劑量中與致癌物作用強(qiáng)弱關(guān)系最為直接的劑量。不同組織中不同類型代謝酶的分布有明顯差異，這種分布的特點(diǎn)直接影響致癌物作用靶子的特異性。三、化學(xué)致癌物作用的靶子化學(xué)致癌物本身或它的活性代謝產(chǎn)物在體內(nèi)誘發(fā)腫瘤必先作用于有關(guān)靶子。就目前所知的這類靶子可分為兩大類：DNA靶子與非DNA靶子。(1)DNA靶子由于各種與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的基因都排列在DNA鏈上，各種類型的致癌物都可與DNA作用，產(chǎn)生堿基損傷、鏈斷裂、鏈交聯(lián)等不同形式的損傷。這在多種體內(nèi)、體外模型的觀察中都得到了充分的證實(shí)。但問(wèn)題是這些損傷與腫瘤的發(fā)生是否有關(guān)？就目前所得觀察結(jié)果來(lái)看，回答是肯定的。人體內(nèi)細(xì)胞數(shù)共約為1014個(gè)，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的DNA每日可能出現(xiàn)的損傷數(shù)可達(dá)4000個(gè)之多。嚴(yán)重?fù)p傷可致細(xì)胞死亡，未致死亡的損傷可經(jīng)歷修復(fù)過(guò)程，少部分可能出現(xiàn)突變。突變的結(jié)局是多方面的，其中部分可發(fā)展成惡性轉(zhuǎn)化。因此，權(quán)衡DNA損傷與致癌關(guān)系時(shí)，這些因素需加以充分考慮。一般認(rèn)為致癌物誘導(dǎo)生成DNA加合物的數(shù)量與致癌性有密切關(guān)系。DNA上的前癌基因很可能是化學(xué)致癌物的靶子。抑癌基因同樣可能是致癌物的主要靶子。以p53為例，突變主要在第5～8外顯子的保守區(qū)域，G一C堿基對(duì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)換引起錯(cuò)義突變。這類突變主要見(jiàn)于多種人類腫瘤，亦見(jiàn)于實(shí)驗(yàn)用嚙齒類動(dòng)物的同類腫瘤。(2）非DNA靶子主要有兩類：一是作用于紡錘絲系統(tǒng)，另一個(gè)是作用于與DNA修復(fù)或基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的酶系統(tǒng)。作用于紡錘絲的化學(xué)物質(zhì)本身不直接作用于遺傳物質(zhì)，傳統(tǒng)上認(rèn)為它不是誘變劑，但實(shí)際上具有誘變作用。第二節(jié)化學(xué)致癌過(guò)程動(dòng)物或人的正常細(xì)胞如何在化學(xué)致癌物的作用下，逐步轉(zhuǎn)化成惡性癌細(xì)胞？在體內(nèi)如何逐步發(fā)展成可見(jiàn)腫瘤，并轉(zhuǎn)移到機(jī)體其它部分組織？有哪些因素參與？通過(guò)哪些機(jī)制獲得不同階段的發(fā)展？這過(guò)程一旦開(kāi)始是否有可能加以阻止或使之逆轉(zhuǎn)？癌變?cè)缙诳赡艹霈F(xiàn)哪些可以加以識(shí)別和利用的特異性標(biāo)記？這些都是需要解決的問(wèn)題。一、化學(xué)致癌作用——一個(gè)多因素、多基因參與的多階段過(guò)程腫瘤的形成與發(fā)展需要有原癌基因的激活與腫瘤抑制癌基因的滅活，二者同時(shí)存在。一些細(xì)胞生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)信號(hào)傳遞系統(tǒng)等一系列與生命重要功能有密切關(guān)系的基因出現(xiàn)突變，才使腫瘤細(xì)胞得以形成和發(fā)展。近年對(duì)于多基因、多因素參與人類致癌過(guò)程問(wèn)題，大致有以下幾個(gè)方面認(rèn)識(shí)：（1）致癌過(guò)程有多個(gè)與癌腫有關(guān)的基因參與。就目前所知有關(guān)的基因可分為四類：第一類是前癌基因，包括生長(zhǎng)與增殖基因、各種轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)傳遞功能的基因；第二類是腫瘤抑制基因；第三類是程序性死亡有關(guān)的基因；第四類是新近發(fā)現(xiàn)的如腫瘤易感基因，見(jiàn)于乳腺癌患者家屬。這幾類基因是相互作用的。增加細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖固然可能是腫瘤形成的途徑，減少細(xì)胞死亡亦可造成細(xì)胞的過(guò)度擴(kuò)增。在50多種前癌基因中，研究得最深入的是ras基因族。它在多種人類腫瘤或化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的動(dòng)物腫瘤均見(jiàn)出現(xiàn)活化。主要活化型或是在第12、13、16、117與146密碼出現(xiàn)點(diǎn)突變。（2）不同器官來(lái)源、不同組織類型、臨床階段以至同一種腫瘤在不同地區(qū)所見(jiàn)的遺傳變化是不同的。例如K-ras突變常見(jiàn)于胰腺癌、結(jié)腸癌，但是乳腺癌及肝癌則少見(jiàn)。胃的腸型腺癌見(jiàn)c一erbB一2擴(kuò)增，但在硬化型則見(jiàn)不到這種變化。K-ras癌基因（編碼酪氨酸激酶受體）在硬化型胃腺癌、圖章戒指型胃癌出現(xiàn)擴(kuò)增，而在腸型腺癌則不見(jiàn)有。在50%食管癌與15%乳腺癌見(jiàn)HSTI與INT2基因擴(kuò)增。在胃癌從未見(jiàn)有。同屬肝癌在AFB1高度污染區(qū)與低度污染區(qū)所見(jiàn)p53基因突變類型不一。（3)多種環(huán)境致癌物、致癌因子或條件可協(xié)同作用。人類接觸致癌物、致癌因子或條件都不可能是單一的。例如，接受環(huán)境致癌物的同時(shí)會(huì)接受到內(nèi)源性致癌因素的作用。又如體內(nèi)氧化過(guò)程產(chǎn)生的各種活性氧可導(dǎo)致DNA損傷并引起突變。這些遺傳改變亦可能參與致癌過(guò)程。感染亦在某些腫瘤發(fā)展中起著重要作用。以肝炎C型病毒（HCV）感染為例，它一方面使肝細(xì)胞死亡，繼而使之出現(xiàn)代償性再生。肝細(xì)胞通過(guò)多次細(xì)胞分裂，可使已有遺傳改變逐漸積累擴(kuò)大，同時(shí)形成局部老化。正常成人肝細(xì)胞很少分裂，可能最多是一年一次。若HCV感染后出現(xiàn)30次分裂，這就意味著比正常人老化速度快30倍。(4）個(gè)體的不同遺傳背景對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要影響。高癌家族現(xiàn)象已為人所熟知。近年對(duì)于著色性干皮?。╔P）、家族性多發(fā)性腸道息肉、Wilm瘤以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的遺傳學(xué)及有關(guān)基因已基本弄清楚。DNA正確修復(fù)能力與突變發(fā)生有直接關(guān)系，而DNA修復(fù)能力缺陷者往往對(duì)腫瘤有易感傾向。因此，多種DNA修復(fù)缺陷與腫瘤敏感性關(guān)系已越來(lái)越受到重視。二、細(xì)胞增殖與致癌作用細(xì)胞增殖（CP）可通過(guò)多種途徑影響致癌過(guò)程。從啟動(dòng)、促癌、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移各個(gè)過(guò)程，往往都有CP參與。啟動(dòng)過(guò)程導(dǎo)致啟動(dòng)細(xì)胞的出現(xiàn)。正常細(xì)胞DNA受損經(jīng)錯(cuò)誤修復(fù)出現(xiàn)突變需要通過(guò)固定過(guò)程才能形成啟動(dòng)細(xì)胞。細(xì)胞必須經(jīng)過(guò)DNA合成、細(xì)胞分裂才可能出現(xiàn)各種形式基因突變、染色體畸變或基因擴(kuò)增，可見(jiàn)細(xì)胞增殖是一個(gè)影響致癌過(guò)程的重要因素。若細(xì)胞暫時(shí)停止進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，細(xì)胞DNA就會(huì)有較充分的時(shí)間進(jìn)行修復(fù)，突變就可能不出現(xiàn)。即使有啟動(dòng)細(xì)胞出現(xiàn)，沒(méi)有CP，啟動(dòng)細(xì)胞的數(shù)目亦不會(huì)增加。腫瘤也可看作是一種機(jī)會(huì)性疾病。受損細(xì)胞的數(shù)目越多，得到下次遺傳性損害的機(jī)會(huì)亦越大，發(fā)展成可見(jiàn)腫瘤的機(jī)會(huì)亦越大。促癌階段中CP的作用更為明顯。三、細(xì)胞程序性死亡與致癌過(guò)程致癌過(guò)程與細(xì)胞的生與死都有密切關(guān)系。大量無(wú)控制的細(xì)胞增殖固然是致癌過(guò)程不可缺少的條件，而細(xì)胞死亡調(diào)控的失調(diào)亦是導(dǎo)致腫瘤形成的一個(gè)重要（甚至可以說(shuō)是必要）的條件。因此有學(xué)者提出：細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化是由于細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡調(diào)控功能失調(diào)所致。細(xì)胞死亡與細(xì)胞增殖過(guò)程一樣，涉及到一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程。細(xì)胞程序性死亡（PCD）的觸發(fā)是一個(gè)系列基因（有人認(rèn)為至少有14個(gè)基因參與）表達(dá)的結(jié)果，它廣泛存在于正常組織的不同形態(tài)發(fā)生、生長(zhǎng)與發(fā)育階段。PCD所誘發(fā)的細(xì)胞與壞死性細(xì)胞死亡在形態(tài)上、生長(zhǎng)改變上都有明顯差別，可見(jiàn)這是一種特殊的主動(dòng)形式，因此稱為凋亡，如同秋天落葉，生死規(guī)律的交替，使生命得以正常的延續(xù)。機(jī)體對(duì)于致癌物所引起的DNA損傷除了動(dòng)員修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)以外，亦會(huì)啟動(dòng)自身清除機(jī)制，例如PCD清除突變或癌變細(xì)胞。在外源性或內(nèi)源性因素作用下，體內(nèi)細(xì)胞的突變頻率應(yīng)當(dāng)是相當(dāng)高的（相當(dāng)于每個(gè)基因和細(xì)胞10-9～10-5次，再乘以每日細(xì)胞分裂數(shù)，約為109細(xì)胞/d），若無(wú)適當(dāng)?shù)那宄龣C(jī)制，突變頻率將十分高，據(jù)此推算腫瘤發(fā)生率應(yīng)比現(xiàn)在高得多，但事實(shí)并非如此。PCD可能是清除這類突變細(xì)胞或癌變細(xì)胞的途徑之一。啟動(dòng)細(xì)胞要發(fā)展成可見(jiàn)腫瘤必須改變自身對(duì)于PCD的反應(yīng)，以便能逃脫這種清除。任何一種機(jī)制若能使經(jīng)致癌物損傷的細(xì)胞更多地存活下來(lái)，都有會(huì)增加致癌的危險(xiǎn)性，因?yàn)檫@種存活意味著有更多的機(jī)會(huì)積累必要的多次遺傳損傷，使之獲得腫瘤表型。四、DNA修復(fù)與致癌過(guò)程外源性或內(nèi)源性因素對(duì)于人體內(nèi)DNA損傷的方式是多種多樣的?？沙霈F(xiàn)單個(gè)或多個(gè)堿基損傷，亦可出現(xiàn)鏈斷裂或鏈交聯(lián)。機(jī)體對(duì)此相應(yīng)發(fā)展了多種形式的修復(fù)方式。目的是將受損部分去掉，再補(bǔ)上被除去部分的空缺。這部分成分若是完整無(wú)缺的或功能上是完全相同的，就是正確修復(fù)，機(jī)體內(nèi)這部分DNA完全回復(fù)原有的結(jié)構(gòu)或功能。但在一定條件下，經(jīng)修補(bǔ)的部分結(jié)構(gòu)或功能上可能是有缺陷的。這就出現(xiàn)易錯(cuò)修復(fù)。通過(guò)錯(cuò)誤修復(fù)，細(xì)胞盡管仍然能夠生存并保持了部分功能，但代價(jià)是出現(xiàn)突變。從這一角度來(lái)看，有些修復(fù)過(guò)程，它本身也是一個(gè)誘變過(guò)程，修復(fù)與突變的關(guān)系是密不可分的，甚至可以說(shuō)：沒(méi)有修復(fù)就沒(méi)有突變?；瘜W(xué)突變不是通過(guò)損傷－突變這樣一種模式，而是損傷－修復(fù)－突變模式形成的。DNA損傷的后果是什么？在很大程度上是受機(jī)體對(duì)DNA損傷方式與修復(fù)能力所左右。受到致癌物的作用后是否會(huì)出現(xiàn)癌基因活化，抑癌基因失活等一系列致癌過(guò)程，在一定程度上亦受制于DNA修復(fù)。五、某些非遺傳機(jī)制與致癌過(guò)程傳統(tǒng)上將致癌過(guò)程中致癌因素對(duì)于DNA所引起的一系列啟動(dòng)作用列為遺傳機(jī)制，而對(duì)于DNA以外靶子所起的作用稱為非遺傳或非遺傳毒性機(jī)制。這類機(jī)制，涉及的因素很多，目前研究得比較充分的主要有：細(xì)胞間隙連接通訊（GJIC)；信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，其中特別是蛋白激酶C(PKC）作用；激素作用等方面的因素。它們?cè)诓煌矫娌煌潭壬蠀⑴c了多階段的致癌過(guò)程。對(duì)于某些致癌因素來(lái)說(shuō)，這些非遺傳機(jī)制對(duì)于它們所誘導(dǎo)的致癌過(guò)程起著關(guān)鍵的作用，是不容忽視的方面。附錄：對(duì)化學(xué)致癌作用的機(jī)制研究已有多年的歷史，并形成了一些學(xué)派，主要有遺傳機(jī)制學(xué)派(genetictheory)和遺傳外機(jī)制學(xué)派(epigenetictheory)。遺傳機(jī)制學(xué)派認(rèn)為，外來(lái)致癌因素引起細(xì)胞基因的改變或外來(lái)基因整合到細(xì)胞基因中，從而導(dǎo)致癌變。遺傳外機(jī)制學(xué)派認(rèn)為癌癥的發(fā)生是由于非基因改變機(jī)制引起的。隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)及遺傳學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的迅速發(fā)展，目前對(duì)致癌作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)逐步深入，鑒于致癌物的多樣性和致癌過(guò)程的復(fù)雜性，遺傳機(jī)制和遺傳外機(jī)制可能是相輔相成的，在致癌作用的不同階段中起作用?；瘜W(xué)致癌機(jī)制重要的學(xué)說(shuō)有親電子劑學(xué)說(shuō)、體細(xì)胞突變學(xué)說(shuō)、癌基因?qū)W說(shuō)和癌變的階段學(xué)說(shuō)。目前認(rèn)為，正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)遺傳學(xué)改變的積累，才能轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞，癌癥的發(fā)生是多階段過(guò)程，至少包括引發(fā)、促長(zhǎng)和進(jìn)展階段。癌變的階段學(xué)說(shuō)是在上世紀(jì)40年代，Rous、Mottram和Bemblum等分別研究利用致癌性多環(huán)芳烴和巴豆油誘發(fā)小鼠皮膚乳頭瘤，提出化學(xué)致癌的兩階段學(xué)說(shuō)，即引發(fā)(啟動(dòng)，initiation)和促長(zhǎng)(promotion)兩個(gè)階段。其實(shí)驗(yàn)證據(jù)是用亞致癌劑量(即在實(shí)驗(yàn)期間不引起腫瘤發(fā)生的劑量)的致癌性多環(huán)芳烴涂抹小鼠皮膚一次，20周后不發(fā)生乳頭瘤或很少發(fā)生。但如在使用劑量相同的致癌物之后再用巴豆油涂抹同一部位(每周2次，共20周)則有約1／3～1／2的小鼠發(fā)生乳頭瘤。單獨(dú)使用巴豆油或在涂抹致癌物之前使用巴豆油都不引起乳頭瘤。據(jù)此提出化學(xué)致癌的引發(fā)和促長(zhǎng)兩階段學(xué)說(shuō)，將所用的致癌性多環(huán)芳烴稱為引發(fā)劑(initiator)，巴豆油稱為促長(zhǎng)劑(promotor)，巴豆油中具有促長(zhǎng)作用的有效成分經(jīng)鑒定為佛波醇酯(TPA)。癌變的階段學(xué)說(shuō)在肝、膀胱、肺、胃腸道等癌癥發(fā)生和體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中得到證實(shí)。進(jìn)一步的研究證明，癌變過(guò)程是多階段過(guò)程，從良性腫瘤向惡性轉(zhuǎn)變的過(guò)程稱為進(jìn)展(progression)階段。化學(xué)致癌過(guò)程的主要階段見(jiàn)圖9-2，在引發(fā)和進(jìn)展階段有細(xì)胞基因組(DNA)的結(jié)構(gòu)改變。在促長(zhǎng)階段雖不涉及細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu)改變，但依賴于基因的表達(dá)改變。前致癌物正常細(xì)胞DNA結(jié)合活化修復(fù)引發(fā)的細(xì)胞DNA結(jié)合終致癌物致癌物-DNA促長(zhǎng)加合物分化的腫瘤DNA復(fù)制進(jìn)展錯(cuò)配修復(fù)失敗DNA修復(fù)不分化的癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞死亡細(xì)胞含錯(cuò)配堿基圖9-2化學(xué)致癌過(guò)程的主要階段一、引發(fā)階段引發(fā)階段是指化學(xué)物或其活性代謝物(親電子劑)與DNA作用，導(dǎo)致體細(xì)胞突變成引發(fā)細(xì)胞的階段。在引發(fā)過(guò)程中至少有三個(gè)細(xì)胞功能是重要的，即致癌物的代謝，DNA修復(fù)和細(xì)胞增殖。Miller等(1971)提出親電子劑學(xué)說(shuō)，認(rèn)為大多數(shù)有機(jī)致癌物都是間接致癌物，又稱前致癌物，或先形成近致癌物再進(jìn)一步活化成終致癌物。終致癌物是親電子劑，含有親電子中心，可與細(xì)胞大分子的親核中心共價(jià)結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥。本身就有反應(yīng)活性，不需要代謝活化的致癌物或能自發(fā)形成親電子劑的致癌物稱為直接致癌物。毒物代謝酶類對(duì)于間接致癌物具有代謝活化和代謝解毒雙重功能，間接致癌物的致癌性取決于代謝活化和代謝解毒之間的平衡。終致癌物引起DNA損傷可誘導(dǎo)DNA修復(fù)，DNA修復(fù)可能是無(wú)誤的，也可能將錯(cuò)誤的堿基引入基因組，而細(xì)胞增殖對(duì)于產(chǎn)生基因組可遺傳的改變是必需的。引發(fā)階段歷時(shí)很短，引發(fā)作為一個(gè)突變事件，需要一次或多次細(xì)胞分裂來(lái)“固定”引發(fā)事件，引發(fā)所確定的基因型和／或表型是不可逆的。引發(fā)細(xì)胞在形態(tài)上與正常細(xì)胞很難區(qū)別。引發(fā)是不可逆的，但并非所有的引發(fā)細(xì)胞都將構(gòu)成腫瘤，因其中大多數(shù)將經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡(凋亡)。引發(fā)細(xì)胞不具有生長(zhǎng)自主性，因此不是腫瘤細(xì)胞。引發(fā)劑本身有致癌性，大多數(shù)是致突變物，沒(méi)有可檢測(cè)的閾劑量，引發(fā)作用是不可逆的并且是累積性的。引發(fā)劑作用的靶主要是原癌基因和腫瘤抑制基因。引發(fā)階段的個(gè)體變異、物種差異及親器官特征是取決于細(xì)胞對(duì)致癌物的代謝、DNA修復(fù)及細(xì)胞增殖／凋亡的平衡。二、促長(zhǎng)階段促長(zhǎng)階段是引發(fā)細(xì)胞增殖成為癌前病變或良性腫瘤的過(guò)程。促長(zhǎng)劑單獨(dú)使用不具致癌性，必須在引發(fā)劑后使用才發(fā)揮促長(zhǎng)作用，促長(zhǎng)劑通常是非致突變物，存在閾劑量和最大效應(yīng)，其劑量反應(yīng)關(guān)系呈S形曲線。促長(zhǎng)劑通常影響引發(fā)細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致局部增殖并引起良性局灶性病理?yè)p害如乳頭瘤、結(jié)節(jié)或息肉。這些病損很多會(huì)消退，僅少數(shù)細(xì)胞發(fā)生進(jìn)一步突變引成惡性腫瘤。促長(zhǎng)劑可能經(jīng)特異的受體中介干擾細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、改變基因表達(dá)；促長(zhǎng)劑可能在細(xì)胞和分子水平上通過(guò)改變細(xì)胞周期控制，選擇性促進(jìn)引發(fā)細(xì)胞的增殖；促長(zhǎng)劑還可能抑制程序性細(xì)胞死亡(凋亡)。促長(zhǎng)階段歷時(shí)較長(zhǎng)，早期有可逆性，晚期為不可逆的，因此在促長(zhǎng)階段(特別是在早期)持續(xù)給以促長(zhǎng)劑是必需的。促長(zhǎng)階段的另一個(gè)特點(diǎn)是對(duì)生理因素調(diào)節(jié)的敏感性，衰老、飲食和激素可影響促長(zhǎng)作用。證實(shí)引發(fā)和促長(zhǎng)作用的實(shí)驗(yàn)方案如圖9-3A，實(shí)驗(yàn)期限一般為3-6個(gè)月，終點(diǎn)一般是癌前損害(PNL)，如小鼠皮膚乳頭瘤、大鼠和小鼠肝轉(zhuǎn)化灶、大鼠乳腺末端芽狀增生、大腸和結(jié)腸的變性隱窩等。三、進(jìn)展階段進(jìn)展階段是從引發(fā)細(xì)胞群(癌前病變、良性腫瘤)轉(zhuǎn)變成惡性腫瘤的過(guò)程，在進(jìn)展期腫瘤獲得生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。在進(jìn)展期中可觀察到惡性腫瘤(癌)的多種特征，包括生長(zhǎng)率增加、侵襲、轉(zhuǎn)移、對(duì)激素?zé)o反應(yīng)性、形態(tài)特征隨疾病的發(fā)展獨(dú)立地變異等。這些特征是由于在進(jìn)展階段的核型不穩(wěn)定性。環(huán)境因素在早期可影響進(jìn)展階段，但隨惡性腫瘤的生長(zhǎng)和核型不穩(wěn)定性的發(fā)展，對(duì)環(huán)境因素的反應(yīng)可能喪失。作用于促長(zhǎng)階段的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成進(jìn)展期的化學(xué)物稱為進(jìn)展劑(progressor)，進(jìn)展劑可引起染色體畸變，但不一定具有引發(fā)活性。進(jìn)展劑導(dǎo)致核型不穩(wěn)定性的機(jī)制很多，包括有絲分裂裝置的紊亂、端粒功能改變、DNA低甲基化、重組、基因易位和基因擴(kuò)增等。進(jìn)展階段主要的特征是核型不穩(wěn)定性，腫瘤的染色體發(fā)生斷裂和斷片易位，存在多復(fù)本或部分／整個(gè)缺失。染色體結(jié)構(gòu)改變伴有細(xì)胞癌基因和／或腫瘤抑制基因的突變，這些突變可能反映了適于惡性生長(zhǎng)的細(xì)胞選擇并也可能反過(guò)來(lái)增加了核型不穩(wěn)定性。這些突變可能來(lái)自于癌基因／腫瘤抑制基因的功能改變或由于化學(xué)致癌物暴露。表9-3多階段致癌的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征引發(fā)促長(zhǎng)進(jìn)展1.不可逆性1.在基因表達(dá)和細(xì)胞水平上有可逆性1.不可逆性2.經(jīng)引發(fā)的“干細(xì)胞”在形態(tài)學(xué)上不能鑒定2.持續(xù)給以促長(zhǎng)劑才可維持促長(zhǎng)細(xì)胞群2.核型不穩(wěn)定性導(dǎo)致細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變；3.對(duì)外源化學(xué)物及其他化學(xué)因子敏感；3.對(duì)衰老、飲食和激素因子敏感3.在進(jìn)展階段早期，已改變的細(xì)胞對(duì)環(huán)境因子敏感；4.引發(fā)細(xì)胞可能自發(fā)(內(nèi)源性)發(fā)生；4.內(nèi)源性促長(zhǎng)劑可起“自發(fā)性”促長(zhǎng)作用；4.在進(jìn)展階段觀察到良性或惡性能腫瘤5.需經(jīng)細(xì)胞分裂“固定”；5.劑量—反應(yīng)關(guān)系顯示有閾值和最大作用；5.進(jìn)展劑使已促長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)入此期。6.劑量—反應(yīng)關(guān)系沒(méi)有易于確定的閾值；6.以能否有效地?cái)U(kuò)大引發(fā)細(xì)胞群來(lái)確定促長(zhǎng)劑的相對(duì)強(qiáng)度。7.經(jīng)規(guī)定的促長(zhǎng)階段后，定量癌前病變來(lái)確定引發(fā)劑的相對(duì)強(qiáng)度。證實(shí)進(jìn)展作用的實(shí)驗(yàn)方案比較復(fù)雜(圖9-3B)，是在引發(fā)和促長(zhǎng)階段之后再給以進(jìn)展劑，然后再繼續(xù)給以促長(zhǎng)劑，實(shí)驗(yàn)應(yīng)有適當(dāng)?shù)膶?duì)照，終點(diǎn)為惡性損害(NL)。引發(fā)、促長(zhǎng)和進(jìn)展階段的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征見(jiàn)表9-3。兼有引發(fā)劑、促長(zhǎng)劑和進(jìn)展劑作用的化學(xué)致癌物可稱為完全致癌物(completecarcinogen)。綜上所述，化學(xué)致癌是長(zhǎng)期的、復(fù)雜的多階段過(guò)程，至少涉及引發(fā)、促長(zhǎng)和進(jìn)展三個(gè)階段。在引發(fā)和進(jìn)展階段涉及遺傳機(jī)制，在促長(zhǎng)階段主要是遺傳外機(jī)制。在引發(fā)階段主要是細(xì)胞原癌基因和腫瘤抑制基因的突變，在進(jìn)展階段主要是核型不穩(wěn)定性。正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)遺傳學(xué)改變的積累才能轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞。第三節(jié)化學(xué)毒物致癌性的判別目前所使用的系統(tǒng)大致可分為三大類：短期試驗(yàn)、動(dòng)物誘癌試驗(yàn)和人類流行病學(xué)觀察。它們?cè)谂袆e化學(xué)物質(zhì)致癌性方面各有其長(zhǎng)短處，往往需要互為補(bǔ)充才能作出可靠的結(jié)論。哺乳動(dòng)物致癌試驗(yàn)哺乳動(dòng)物致癌試驗(yàn)是鑒定化學(xué)致癌物的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)試驗(yàn)。哺乳動(dòng)物致癌試驗(yàn)用來(lái)確定受試物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的致癌性、劑量—反應(yīng)關(guān)系及誘發(fā)腫瘤的靶器官。在下列情況下，一般應(yīng)考慮進(jìn)行致癌性評(píng)價(jià)：①人體可能長(zhǎng)期暴露于該化學(xué)物；②該化學(xué)物或其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與已知致癌物相似；③反復(fù)染毒毒性試驗(yàn)提示該化學(xué)物可能產(chǎn)生癌前病變。此外，研究結(jié)果表明，如在3種遺傳毒理學(xué)短期試驗(yàn)均得到陽(yáng)性結(jié)果，可預(yù)測(cè)為遺傳毒性致癌物；如在3種遺傳毒理學(xué)短期試驗(yàn)均得到陰性結(jié)果，可預(yù)測(cè)為非遺傳毒性非致癌物；如經(jīng)5種遺傳毒理學(xué)短期試驗(yàn)仍不能預(yù)測(cè)其致癌性的化學(xué)品，應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行哺乳動(dòng)物致癌試驗(yàn)。一、試驗(yàn)動(dòng)物物種和品系：要求用兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，常規(guī)選用大鼠和小鼠，也可用倉(cāng)鼠。嚙齒類動(dòng)物對(duì)多數(shù)致癌物易感性較高，壽命相對(duì)較短，費(fèi)用也較低，生理和病理資料較完備，因此使用最廣泛。在選擇品系時(shí)應(yīng)選擇較敏感、自發(fā)腫瘤率低、生活力強(qiáng)及壽命較長(zhǎng)的品系。性別：為接近人類情況，應(yīng)使用同等數(shù)量的雌雄兩種性別的動(dòng)物。年齡：使用剛離乳的動(dòng)物，以保證有足夠長(zhǎng)的染毒和發(fā)生癌癥的時(shí)間，而且幼年動(dòng)物解毒酶及免疫系統(tǒng)尚未完善，對(duì)致癌作用比較敏感。二、劑量選擇和動(dòng)物數(shù)量致癌試驗(yàn)一般設(shè)三個(gè)試驗(yàn)組。美國(guó)NCI推薦以最大耐受劑量(MTD)為高劑量。最大耐受劑量是由90天毒性試驗(yàn)來(lái)確定的，此劑量應(yīng)使動(dòng)物體重減輕不超過(guò)對(duì)照組的10％，并且不引起死亡及導(dǎo)致縮短壽命的中毒癥狀或病理?yè)p傷（最大可行劑量，受試物在飼料中最高含量為5％。限制劑量為1500mg／(kg體重·d)）。中及低劑量組則按等比級(jí)數(shù)下推，如分別為上一個(gè)劑量水平的1／2或1／3。低劑量組應(yīng)不影響動(dòng)物的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和壽命，即不產(chǎn)生任何毒性效應(yīng)。但低劑量組應(yīng)高于人的接觸劑量，一般不低于高劑量的10％。中劑量組介于高、低劑量之間，如有可能按受試物的毒物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)來(lái)確定。對(duì)照組除不給受試物外，其他條件均與試驗(yàn)組相同。同時(shí)應(yīng)設(shè)陰性(溶劑或賦形劑)對(duì)照組。必要時(shí)可設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組，陽(yáng)性致癌物最好與受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相近。試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)與試驗(yàn)組動(dòng)物腫瘤發(fā)生率、對(duì)照動(dòng)物腫瘤自發(fā)率及要求的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平有關(guān)。三、染毒途徑應(yīng)盡可能模擬人體可能的暴露途徑，主要途徑有經(jīng)口、經(jīng)皮和吸入三種，應(yīng)根據(jù)受試物的理化性質(zhì)和接觸方式選擇確定。經(jīng)口染毒是將受試物給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的常用途徑，一般把受試物摻入飼料或飲水中連續(xù)給予動(dòng)物(5～7天／周)。若摻入后的適口性不良，可用灌胃法。摻入濃度要定期監(jiān)測(cè)，觀察其均勻性和穩(wěn)定性，摻入的濃度一般不超過(guò)5％。經(jīng)皮染毒，涂敷受試物的面積一般不少于動(dòng)物體表總面積的10％。必須保證受試物與皮膚良好接觸，并防止動(dòng)物舔食。每天涂抹一次，每周3～7次。吸人染毒，每天染毒4小時(shí)，每周5～7天。染毒柜內(nèi)受試物濃度應(yīng)定期或連續(xù)監(jiān)測(cè)，其分布應(yīng)均勻、恒定。其他注射途徑可根據(jù)需要采用。四、試驗(yàn)期限ICH(1997)建議參考下面幾條準(zhǔn)則：(1)一般情況下，試驗(yàn)期限小鼠和倉(cāng)鼠應(yīng)為18個(gè)月，大鼠為24個(gè)月；然而對(duì)于某些生命期較長(zhǎng)或自發(fā)腫瘤率低的動(dòng)物品系，小鼠和倉(cāng)鼠可持續(xù)24個(gè)月，大鼠可持續(xù)30個(gè)月。(2)當(dāng)最低劑量組或?qū)φ战M存活的動(dòng)物只有25％時(shí)，也可以結(jié)束試驗(yàn)，對(duì)于有明顯性別差異的試驗(yàn)，則試驗(yàn)結(jié)束的時(shí)間對(duì)不同的性別應(yīng)有所不同，在某種情況下因明顯的毒性作用，只造成高劑量組動(dòng)物過(guò)早死亡，此時(shí)不應(yīng)結(jié)束試驗(yàn)。一個(gè)合格的陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)符合下列標(biāo)準(zhǔn)：①因自溶、同類自食，或因管理問(wèn)題所造成的動(dòng)物損失在任何一組都不能高于10％。②小鼠和倉(cāng)鼠在18個(gè)月，大鼠在24個(gè)月時(shí)各組存活的動(dòng)物不能少于50％。五、觀察和結(jié)果分析1.一般觀察每天觀察受試動(dòng)物一次，主要觀察其外表、活動(dòng)、攝食情況等。在實(shí)驗(yàn)最初三個(gè)月每周稱體重一次，以后每?jī)芍芊Q體重一次。經(jīng)飼料或飲水給以受試物時(shí)，應(yīng)記錄食物消耗量或飲水量，以計(jì)算受試物的攝人量。觀察時(shí)要注意有無(wú)腫瘤出現(xiàn)、腫瘤出現(xiàn)時(shí)間及死亡時(shí)間。老年動(dòng)物多病易死，應(yīng)加強(qiáng)巡視，防止動(dòng)物死亡后未及時(shí)剖驗(yàn)，發(fā)生尸體組織自溶。2.病理檢查動(dòng)物自然死亡或處死后必須及時(shí)進(jìn)行病理檢查，包括肉眼和組織切片檢查。組織切片檢查應(yīng)包括已出現(xiàn)腫瘤或可疑腫瘤的器官和肉眼檢查有明顯病變的器官，應(yīng)注意觀察癌前病變。通過(guò)病理檢查確定腫瘤的性質(zhì)和靶器官。3.結(jié)果分析統(tǒng)計(jì)各種腫瘤的數(shù)量(包括良性和惡性腫瘤)及任何少見(jiàn)的腫瘤的動(dòng)物數(shù)、每只動(dòng)物的腫瘤數(shù)及腫瘤潛伏期。腫瘤發(fā)生率(％)=(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)患腫瘤動(dòng)物總數(shù)／有效動(dòng)物總數(shù))×100％式中，有效動(dòng)物總數(shù)指最早發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)存活動(dòng)物總數(shù)。腫瘤潛伏期即從攝人受試物起到發(fā)現(xiàn)腫瘤的時(shí)間，因?yàn)閮?nèi)臟腫瘤不易覺(jué)察，通常將腫瘤引起該動(dòng)物死亡的時(shí)間定為發(fā)生腫瘤的時(shí)間。應(yīng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并研究劑量—反應(yīng)關(guān)系。致癌試驗(yàn)陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)為WHO提出的標(biāo)準(zhǔn)。WHO(1969)提出機(jī)體可以對(duì)致癌物有下列一種或多種反應(yīng)：(1)對(duì)于對(duì)照組也出現(xiàn)的一種或數(shù)種腫瘤，試驗(yàn)組腫瘤發(fā)生率增加；(2)試驗(yàn)組發(fā)生對(duì)照組沒(méi)有的腫瘤類型；(3)試驗(yàn)組腫瘤發(fā)生早于對(duì)照組；(4)與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組每個(gè)動(dòng)物的平均腫瘤數(shù)增加。在進(jìn)行試驗(yàn)的兩個(gè)物種兩種性別動(dòng)物中，有一種結(jié)果為陽(yáng)性，即認(rèn)為該受試物有致癌性。兩個(gè)物種兩種性別動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果均為陰性時(shí)，方能認(rèn)為未觀察到致癌作用。在結(jié)果報(bào)告中，應(yīng)著重報(bào)告發(fā)現(xiàn)腫瘤的部位、數(shù)量、性質(zhì)、癌前病變，以及其他毒性效應(yīng)；應(yīng)報(bào)告劑量—反應(yīng)關(guān)系及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。如在動(dòng)物組織中觀察到良性和惡性腫瘤，并有良性腫瘤向惡性化進(jìn)展的證據(jù)，在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析之前將良性和惡性腫瘤合并是適宜的，但仍希望分別對(duì)良性和惡性腫瘤分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。評(píng)價(jià)該試驗(yàn)不同劑量良性腫瘤和惡性腫瘤的相對(duì)數(shù)量可有助于確定該受試動(dòng)物對(duì)受試物的劑量反應(yīng)關(guān)系。另一方面，如果僅觀察到良性腫瘤，并無(wú)惡性化進(jìn)展的證據(jù)，則將此受試物認(rèn)為是致癌物是不適宜的，此僅提示在該試驗(yàn)條件下需要進(jìn)一步研究。與研究致癌作用有關(guān)的其他試驗(yàn)一、短期試驗(yàn)哺乳動(dòng)物致癌試驗(yàn)是標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)試驗(yàn)，對(duì)于鑒定哺乳動(dòng)物致癌物是關(guān)鍵性的試驗(yàn)，但其實(shí)驗(yàn)條件要求較高，人力、經(jīng)費(fèi)及時(shí)間耗費(fèi)巨大，難以滿足化學(xué)品安全性評(píng)價(jià)的要求。為此，發(fā)展了一些與研究致癌作用有關(guān)的其他試驗(yàn)。一、用于致癌物篩選的短期試驗(yàn)?zāi)壳耙呀⒌亩唐谠囼?yàn)為數(shù)近百種。在發(fā)展這些方法的早期，由于對(duì)于致癌過(guò)程的復(fù)雜性認(rèn)識(shí)還不充分，有些學(xué)者認(rèn)為誘變性與致癌性關(guān)系密切，單純利用短期的誘變?cè)囼?yàn)就可以預(yù)測(cè)致癌性（Ames，1973）。但經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)表明：一些化合物可對(duì)于嚙齒類動(dòng)物具有致癌作用，而在Ames試驗(yàn)或其它誘變?cè)囼?yàn)系統(tǒng)則呈現(xiàn)陰性。用于致癌物篩選的短期試驗(yàn)如下：①基因突變?cè)囼?yàn)：鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))，培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞TK或HPRT正向突變?cè)囼?yàn)；②染色體畸變?cè)囼?yàn)：體外細(xì)胞系細(xì)胞遺傳學(xué)分析，小鼠骨髓微核試驗(yàn)，大鼠骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)；③原發(fā)性DNA損傷：DNA加合物，鏈斷裂，DNA修復(fù)誘導(dǎo)(細(xì)菌SOS反應(yīng)，大鼠肝UDS誘導(dǎo))，SCE試驗(yàn)；④體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化：敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞，Balb／c3T3細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是體外試驗(yàn)，是一種遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)。在第六章中介紹的遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)的遺傳學(xué)終點(diǎn)為基因突變、染色體畸變、DNA原發(fā)性損傷和非整倍體，而體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化則是另一個(gè)重要的遺傳學(xué)終點(diǎn)。[體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是檢測(cè)受試物對(duì)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的遺傳毒理試驗(yàn)。是將動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)的環(huán)境下，將細(xì)胞暴露于致癌物，高度模擬致癌物在體內(nèi)致癌的作用進(jìn)行致癌物檢測(cè)的一種技術(shù)，可以有效的體外篩查致癌物質(zhì)的致癌活性。不僅可以檢測(cè)具有遺傳毒性的潛在致癌物，還可以檢測(cè)非遺傳毒性致癌物的致癌活性。體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是以所培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化從而產(chǎn)生的形態(tài)改變?yōu)樵囼?yàn)終點(diǎn)，可直接在體外觀察并記錄細(xì)胞由正常轉(zhuǎn)化為具有腫瘤細(xì)胞性質(zhì)的過(guò)程。]四個(gè)短期試驗(yàn)系統(tǒng)分別與動(dòng)物誘癌試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)比可見(jiàn)Ames試驗(yàn)與動(dòng)物試驗(yàn)相關(guān)顯著性最高，特異性亦最高（91%），但敏感性最低（48%）。Ames試驗(yàn)陽(yáng)性預(yù)測(cè)率亦最高（89%）。姐妹染色體交換與小鼠淋巴瘤試驗(yàn)則敏感性較高（分別為69%與72%），但陽(yáng)性預(yù)測(cè)率低（64%，63%）。由此可見(jiàn)Ames試驗(yàn)對(duì)于誘變作用的致癌性可檢出大部分，但對(duì)于無(wú)誘變性的致癌物則不能準(zhǔn)確判定。當(dāng)前短期試驗(yàn)在預(yù)測(cè)致癌性方面所遇到的最大問(wèn)題是如何檢出非誘變性致癌物。一些化合物可通過(guò)影響細(xì)胞的自穩(wěn)狀態(tài)或代謝，通過(guò)引起炎癥或抑制修復(fù)過(guò)程，或者影響細(xì)胞增殖周期、細(xì)胞分化、基因表達(dá)程度等方面作用于致癌過(guò)程。這些作用利用現(xiàn)有的短期試驗(yàn)無(wú)法檢出。迄今為止，只有動(dòng)物誘癌試驗(yàn)可以準(zhǔn)確判別人類致癌物的致癌性。二、哺乳動(dòng)物短期致癌試驗(yàn)哺乳動(dòng)物短期致癌試驗(yàn)又稱為有限體內(nèi)試驗(yàn)，指時(shí)間有限(數(shù)月)，靶器官有限。較受重視的短期致癌試驗(yàn)有下列四種：1.小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗(yàn)，于小鼠皮膚局部連續(xù)涂抹受試物，以觀察皮膚乳頭瘤和癌的發(fā)生，一般20周可結(jié)束實(shí)驗(yàn)，較敏感的小鼠為SENCAR小鼠。此試驗(yàn)也可設(shè)計(jì)為檢測(cè)受試物的引發(fā)活性或促長(zhǎng)活性。典型的引發(fā)劑為致癌性多環(huán)芳烴，促長(zhǎng)劑為佛波醇酯(TPA)。2.小鼠肺瘤誘發(fā)試驗(yàn)。染毒途徑常用腹腔注射，也可灌胃或吸人，一般30周可結(jié)束實(shí)驗(yàn)，觀察肺腫瘤的發(fā)生。較敏感的小鼠為A系小鼠。此試驗(yàn)也可設(shè)計(jì)為檢測(cè)受試物的引發(fā)活性或促長(zhǎng)活性。典型的引發(fā)劑為烏拉坦，促長(zhǎng)劑為二丁基羥基甲苯(BHT)。3.大鼠肝轉(zhuǎn)化灶誘發(fā)試驗(yàn)。對(duì)大鼠進(jìn)行肝大部切除術(shù)后，給以受試物，一般可在8-14周結(jié)束實(shí)驗(yàn)，觀察肝轉(zhuǎn)化灶生成。肝轉(zhuǎn)化灶是癌前病變，有r—谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(r-GT)活性升高，G6P酶(G6Pase)和ATP酶(ATPase)活性降低，以及鐵攝取能力降低。轉(zhuǎn)化灶可用組織化學(xué)或免疫化學(xué)方法鑒定。此試驗(yàn)也可設(shè)計(jì)為檢測(cè)受試物的引發(fā)活性或促長(zhǎng)活性。典型的引發(fā)劑為二乙基亞硝胺(DEN)，促長(zhǎng)劑為苯巴比妥(PB)。4.雌性大鼠乳腺癌誘發(fā)試驗(yàn)，一般可用SD大鼠(或Wistar大鼠)，實(shí)驗(yàn)周期為6個(gè)月。此四個(gè)試驗(yàn)不是成組試驗(yàn)，應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)選擇使用。此四個(gè)試驗(yàn)任一試驗(yàn)得到陽(yáng)性結(jié)果的意義與長(zhǎng)期動(dòng)物致癌試驗(yàn)相似，但陰性結(jié)果并不能排除受試物的致癌性。三、轉(zhuǎn)基因小鼠在致癌作用的研究轉(zhuǎn)基因小鼠可用于研究在致癌過(guò)程中特定基因的作用，可用于分析化學(xué)物-基因的相互作用?？煞譃?類。1.轉(zhuǎn)癌基因小鼠。與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子連接的癌基因轉(zhuǎn)入后可直接在某些特定的組織中高效表達(dá)，使該組織細(xì)胞處于引發(fā)狀態(tài)，這類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是研究化學(xué)物致癌作用的敏感體系。攜帶癌基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于致癌試驗(yàn)，試驗(yàn)周期僅3個(gè)月左右，有希望發(fā)展成代替長(zhǎng)期動(dòng)物致癌試驗(yàn)的試驗(yàn)系統(tǒng)。這些攜帶有癌基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可用來(lái)研究外源化學(xué)物與腫瘤相關(guān)基因的作用及外源化學(xué)物在致癌不同階段中的作用機(jī)制。以各種組織特異性的促長(zhǎng)劑處理轉(zhuǎn)入不同癌基因的小鼠，可為致癌過(guò)程的研究提供新線索。2.腫瘤抑制基因敲除小鼠。在P53-／-小鼠，腫瘤(特別是淋巴肉瘤)的發(fā)生比正常小鼠(P53+／+)增加而且提前。由于P53-／-小鼠的腫瘤發(fā)生具有組織特異性，進(jìn)一步研究這些腫瘤的遺傳學(xué)基礎(chǔ)有助于鑒定P53基因的功能。而半合子小鼠(P53+／-)在出生后6個(gè)月內(nèi)自發(fā)癌發(fā)生率低，但在之后發(fā)生淋巴瘤和軟組織肉瘤，其中大部分丟失P53野生型等位基因。這種小鼠對(duì)遺傳毒性致癌物敏感性并不增加。這種半合子小鼠也可用于鑒定致癌過(guò)程中的協(xié)作基因。而且缺P(pán)53小鼠加速形成惡性腫瘤，提示此基因主要在進(jìn)展階段起作用。P53在腫瘤發(fā)生中的作用有待進(jìn)一步研究。3.轉(zhuǎn)穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物小鼠：轉(zhuǎn)入帶有報(bào)告基因的穿梭載體是研究體內(nèi)基因突變的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。常用的靶基因如laeI、lacZ可通過(guò)噬菌體體外包裝等方法，從小鼠基因組內(nèi)回收，再在大腸桿菌內(nèi)檢測(cè)靶基因突變，可為研究不同器官基因的自發(fā)突變和誘發(fā)突變的分子機(jī)制提供有效的方法。二、動(dòng)物誘癌試驗(yàn)一般認(rèn)為動(dòng)物誘癌試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于判別化學(xué)物質(zhì)致癌性具有很高價(jià)值，短期試驗(yàn)固然不能取而代之，即使是人類流行病資料，雖然在一定條件下，單獨(dú)就可以證實(shí)是否屬人類致癌物，但動(dòng)物誘癌模型對(duì)于闡明其致癌原理，研究有關(guān)作用因素具有不可替代的作用。動(dòng)物誘癌試驗(yàn)至今仍然是鑒定致癌性的重要條件，目前可用的化學(xué)致癌動(dòng)物模型已有多種（表9一2）。短期試驗(yàn)固然不可取代動(dòng)物誘癌試驗(yàn)，但短期試驗(yàn)對(duì)于幫助選擇適當(dāng)?shù)膭?dòng)物試驗(yàn)受試物具有重要的價(jià)值。三、人群流行病學(xué)觀察要判別人類致癌物，流行病學(xué)資料是具有決定意義的，甚至只根據(jù)完整的人類流行病學(xué)資料，即可判別某種物質(zhì)是否為人類致癌物。砷化物即為一例。但完整的、可信的流行病學(xué)材料來(lái)之不易。過(guò)去流行病調(diào)查都以腫瘤發(fā)病數(shù)或死亡作為觀察單位，其判別的準(zhǔn)確性是無(wú)疑的。但這是屬最后期的結(jié)果，不能用于早期發(fā)現(xiàn)、早期阻斷。近年在流行病學(xué)研究中引進(jìn)了生物標(biāo)記，其中包括一些早期、中期生物標(biāo)記，特別是分子水平標(biāo)記的方法。使分子流行病學(xué)在一定條件下應(yīng)用于判別某些化合物對(duì)于人類的致癌性、致癌危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)以及腫瘤化學(xué)預(yù)防的干預(yù)試驗(yàn)等方面。目前已在使用的化學(xué)致癌生物標(biāo)記有以下幾類：(1)接觸標(biāo)記可檢查在細(xì)胞、組織或體液內(nèi)某些致癌物的含量，用以衡量接觸的水平，例如檢查血清及脂肪組織內(nèi)DDT、多氯聯(lián)苯的濃度，吸煙者血清及唾液中N-甲-2-(3-吡啶基）-5-吡咯烷酮等。這類標(biāo)記測(cè)定結(jié)果只說(shuō)明機(jī)體接觸情況，不說(shuō)明所接觸物質(zhì)對(duì)機(jī)體，特別是靶細(xì)胞是否已起作用。另一方面可檢查生物有效劑量，即檢查致癌物到達(dá)細(xì)胞的劑量或反映與細(xì)胞大分子相互作用的程度。雖然所作用的細(xì)胞不一定是靶細(xì)胞而是它的替代物，但二者之間有一致的關(guān)系。目前常用的有各種致癌物-DNA加合物或致癌物-蛋白質(zhì)加合物。由于這是致癌物經(jīng)歷體內(nèi)一系列吸收、分布、排泄以及生物轉(zhuǎn)化后在靶分子上所呈現(xiàn)的結(jié)果，比一般內(nèi)劑量有更直接的生物學(xué)意義。(2）生物效應(yīng)標(biāo)記反映致癌物對(duì)于靶子或相類似部位所造成的損害，這些損害可能與腫瘤有關(guān)。這類標(biāo)記很多，但最終能完全證明它與腫瘤發(fā)生的因果關(guān)系的標(biāo)記為數(shù)尚不多。這類標(biāo)記常用的有姐妹染色體交換（接觸多種工業(yè)毒物、電離輻射），微核形成（有機(jī)溶劑、重金屬、吸煙、咀嚼檳榔），染色體畸變（工業(yè)毒物、電離輻射、大氣污染物），次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（腫瘤化療藥物、電離輻射），MN血型糖蛋白（GPT），突變（腫瘤化療藥物、電離輻射）、腫瘤抑制基因（例如p53)突變（黃曲霉毒素），癌基因活化（多環(huán)芳烴、吸煙）等。(3)敏感性標(biāo)記這是一類衡量致癌物反應(yīng)性個(gè)體差異的標(biāo)記?？捎糜跈z出腫瘤高危個(gè)體。目前多注意參與致癌物活化與滅活代謝的酶系多態(tài)性。以上三類生物標(biāo)記在化學(xué)致癌研究中常用于三個(gè)方面：一是病因?qū)W研究，用以確立某種因素與某種腫瘤之間的因果關(guān)系。用一種特異性的生物標(biāo)記作為觀察終點(diǎn)，代替?zhèn)鹘y(tǒng)流行病學(xué)所選用的疾病或死亡終點(diǎn)，可達(dá)到早期判別、早期預(yù)防的目的。例如在20世紀(jì)90年代，有些學(xué)者以多環(huán)烴-DNA(PAH-DNA）加合物作為標(biāo)記，觀察工業(yè)大氣污染及吸煙接觸PAH后，白細(xì)胞內(nèi)、肺組織內(nèi)、胎盤(pán)組織內(nèi)PAH-DNA的出現(xiàn)與分布規(guī)律。二是用于危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)。使用生物有效劑量衡量PAH的危險(xiǎn)度比其它接觸參數(shù)更為直接，是一次有應(yīng)用前景的嘗試。它比利用腫瘤發(fā)生率（或死亡率）作為觀察指標(biāo)更為敏惑，更有利于使危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)應(yīng)用于預(yù)防。三是用于干預(yù)試驗(yàn)中臨床流行病學(xué)觀察。腫瘤化學(xué)預(yù)防的干預(yù)試驗(yàn)過(guò)去是利用腫瘤發(fā)生率的變化作為判別終點(diǎn)。凡能降低腫瘤發(fā)生率的物質(zhì)就是具有化學(xué)預(yù)防作用，但是得到這一結(jié)果往往需要長(zhǎng)至10年的觀察期，這期間有很多干擾因素，要作出準(zhǔn)確的結(jié)論是不容易的。致癌性判別不單純是一個(gè)學(xué)術(shù)上的問(wèn)題，而且和管理部門(mén)制定政策有密切關(guān)系。必須將短期試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)以及人群流行病學(xué)資料所得結(jié)果綜合起來(lái)，詳加分析，才能得出準(zhǔn)確的結(jié)論。目前這三個(gè)方面試驗(yàn)的方法學(xué)仍然有許多不足之處，有待進(jìn)一步完善。思考題