藥品微生物檢驗(yàn)技術(shù) 課件 模塊二 項(xiàng)目五 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

《藥品微生物檢驗(yàn)技術(shù)》模塊二藥品安全性檢查項(xiàng)目五細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

任務(wù)一鱟試劑的靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

任務(wù)二碳酸氫鈉注射液的干擾試驗(yàn)

任務(wù)三

碳酸氫鈉注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查

目錄項(xiàng)目五細(xì)菌內(nèi)毒素檢查任務(wù)一鱟試劑的靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

任務(wù)引入請思考

凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理進(jìn)行限度檢測或半定量檢測內(nèi)毒素的方法。鱟試劑是從鱟（見圖2-5-1）的血液中提取出的凍干試劑，可以與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)。某企業(yè)近期新采購了一批鱟試劑，根據(jù)《中國藥典》2020年版要求，在對供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查之前，首先要進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。那么，鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)什么時候要做，什么時候可以省略不做呢？

任務(wù)分析當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。鱟試劑復(fù)核后才可以使用，以后使用同批次鱟試劑可不進(jìn)行復(fù)核。本任務(wù)的工作內(nèi)容及要求見表2-5-1。相關(guān)知識取細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品1支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪藥品微生物檢驗(yàn)技術(shù)在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%乙醇擦拭后啟開，開啟過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。一、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ），將標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，放置在旋渦混合器上混勻15min或參照標(biāo)準(zhǔn)品說明書中要求的混勻時間進(jìn)行操作，然后制成２λ、λ、0.5λ和0.25λ４個濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30s或參照標(biāo)準(zhǔn)品說明書中要求的混勻時間進(jìn)行操作。相關(guān)知識取0.1mL/支的鱟試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，用75%乙醇擦拭后啟開備用，應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1mL檢查用水，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，溶解過程中應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。若待復(fù)核鱟試劑規(guī)格不是0.1mL/支時，取若干支按標(biāo)示量加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，充分混勻后每0.1mL分裝到1支試管中，至少分裝18支管備用。二、待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備

相關(guān)知識將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支管放在試管架上，排成5列，取不同濃度（即2λ、λ、0.5λ和0.25λ）的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別與等體積（0.1mL）的鱟試劑溶液混合，每一個內(nèi)毒素濃度行做4管；另外取2管加入等體積的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。加樣結(jié)束后，將試管中溶液輕輕振動混勻，用封口膜封閉管口，垂直放入37℃±1℃的試管恒溫儀中，保溫60min±2min。三、加樣試管恒溫儀相關(guān)知識將試管從試管恒溫儀中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°觀察，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（+）；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（+）。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免振動，防止造成假陰性結(jié)果。四、結(jié)果觀察與記錄當(dāng)最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。按下式計算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc）。五、結(jié)果計算式中，Ｘ為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg），反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度；ｎ為每個濃度的平行管數(shù)，即4。相關(guān)知識λc在0.5λ～２λ（包括0.5λ和2λ）時，判定該批鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，可用于干擾試驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。六、結(jié)果判斷任務(wù)實(shí)施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負(fù)責(zé)人1玻璃器皿的洗滌與滅菌2細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備3待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備4加樣、觀察與記錄5結(jié)果計算與判斷根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進(jìn)度計劃，并根據(jù)小組成員的特點(diǎn)進(jìn)行分工。任務(wù)實(shí)施二、試驗(yàn)前準(zhǔn)備設(shè)備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途電熱干燥箱去除外源性內(nèi)毒素水銀溫度計或酒精溫度計測量溫度旋渦混合器混合細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶液鱟試劑供試品細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制備細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑移液管、無熱原吸頭、試管（１０ｍｍ×７５ｍｍ）、燒杯、試管架、洗耳球、計時器、７５％乙醇、棉球、剪刀、砂輪、鋁箔等用于試驗(yàn)任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作

根據(jù)鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)的具體操作步驟進(jìn)行操作，按照表2-5-4填寫鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)記錄。任務(wù)測評項(xiàng)目五細(xì)菌內(nèi)毒素檢查任務(wù)二碳酸氫鈉注射液的干擾試驗(yàn)任務(wù)引入請思考

碳酸氫鈉注射液為無色澄明液體，主要用于治療代謝性酸中毒和胃酸過多引起的癥狀，也可用于堿化尿液。為了減少不良反應(yīng)，確保用藥安全，需要建立碳酸氫鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，還須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。那么，如何進(jìn)行干擾試驗(yàn)?zāi)兀?/p>

某企業(yè)生產(chǎn)了一批碳酸氫鈉注射液，依據(jù)《中國藥典》2020年版通則1143，在對碳酸氫鈉注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查之前，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)，以建立碳酸氫鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的常規(guī)方法。

任務(wù)分析

干擾試驗(yàn)是比較鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)在水溶液中和在供試品中進(jìn)行的差異，即比較本反應(yīng)在不同介質(zhì)中進(jìn)行的差異，有差異就表示供試品對反應(yīng)存在干擾作用。

當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。相關(guān)知識

預(yù)試驗(yàn)的目的是初步確定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值以EU/mg或EU/U表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值以EU/mL表示），為正式干擾試驗(yàn)提供依據(jù)。一、干擾預(yù)試驗(yàn)相關(guān)知識【舉例】設(shè)某注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值為2.5EU/mL，按MVD＝cL/λ計算出靈敏度為0.03EU/mL下的MVD為約80倍，將供試品溶液稀釋一系列濃度梯度進(jìn)行檢驗(yàn)，用靈敏度為0.25EU/mL的鱟試劑進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果如下：一、干擾預(yù)試驗(yàn)相關(guān)知識二、干擾試驗(yàn)制備細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備含內(nèi)毒素的供試品溶液鱟試劑的準(zhǔn)備加樣結(jié)果計算干擾排除相關(guān)知識二、干擾試驗(yàn)【舉例】某注射液預(yù)試驗(yàn)中初步確定其最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，使用靈敏度為0.125EU/mL的鱟試劑檢測供試品是否對內(nèi)毒素檢查存在干擾，結(jié)果如下：相關(guān)知識二、干擾試驗(yàn)【舉例】某注射液預(yù)試驗(yàn)中初步確定其最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，使用靈敏度為0.125EU/mL的鱟試劑檢測供試品是否對內(nèi)毒素檢查存在干擾，結(jié)果如下：任務(wù)實(shí)施一、制訂工作計劃任務(wù)實(shí)施二、試驗(yàn)前準(zhǔn)備任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作1.干擾預(yù)試驗(yàn)2.干擾試驗(yàn)3.結(jié)果取一批供試品進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)，以得出無干擾稀釋倍數(shù)。如果該稀釋倍數(shù)下還存在干擾，繼續(xù)擴(kuò)大稀釋倍數(shù)，選擇更高靈敏度的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)。若試驗(yàn)不存在干擾，則選擇相對應(yīng)靈敏度的鱟試劑或更高靈敏度的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)。取3個批號供試品進(jìn)行干擾試驗(yàn)，3批供試品的試驗(yàn)結(jié)果ES均應(yīng)在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)，包括0.5λ和2.0λ；ET均應(yīng)在0.5ES～2.0ES范圍內(nèi)，包括0.5ES和2.0ES。確認(rèn)結(jié)果，記錄于書上表2-5-10。任務(wù)測評考核內(nèi)容考核標(biāo)準(zhǔn)配分得分干擾預(yù)試驗(yàn)供試品的稀釋能正確操作供試品的稀釋5

試驗(yàn)觀察能認(rèn)真觀察試驗(yàn)，并準(zhǔn)確記錄試驗(yàn)現(xiàn)象5

結(jié)果判斷能正確進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果判斷10

干擾試驗(yàn)制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液能正確制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液5

制備含內(nèi)毒素的供試品溶液能按要求制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液10

鱟試劑的準(zhǔn)備能正確開啟鱟試劑5

能按要求溶解鱟試劑5

加樣與觀察能按要求完成加樣的操作10

能按要求記錄試驗(yàn)觀察結(jié)果10

結(jié)果計算與判斷能準(zhǔn)確計算試驗(yàn)結(jié)果10

能正確進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷10

能準(zhǔn)確填寫試驗(yàn)結(jié)果記錄表10

清場能按要求完成實(shí)驗(yàn)室的清場5

合計100

項(xiàng)目五細(xì)菌內(nèi)毒素檢查任務(wù)三碳酸氫鈉注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查

任務(wù)引入請思考某制藥企業(yè)生產(chǎn)了一批碳酸氫鈉注射液，質(zhì)量檢驗(yàn)部門需要對該注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

依據(jù)《中國藥典》2020年版，藥品中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法是什么？凝膠限度試驗(yàn)對供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的具體操作步驟是什么？任務(wù)分析供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時，需要根據(jù)供試品的內(nèi)毒素限量選擇合適效價的鱟試劑。《中國藥典》2020年版規(guī)定，在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照，同時每次試驗(yàn)必須做2支陽性對照和2支陰性對照。相關(guān)知識供試品的抽取同熱原檢查。一、供試品抽取二、供試品的處理某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。必要時，可調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0～8.0為宜，可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖液調(diào)節(jié)pH值。酸、堿溶液或緩沖液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。所用溶劑，酸、堿溶液及緩沖液應(yīng)不含內(nèi)毒素和干擾因素。任務(wù)實(shí)施-碳酸氫鈉注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查一、制訂工作計劃任務(wù)實(shí)施-碳酸氫鈉注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查二、試驗(yàn)前準(zhǔn)備任務(wù)實(shí)施-碳酸氫鈉注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查三、凝膠限度試驗(yàn)操作1.操作方法供試品溶液配制供試品陽性對照溶液制備陽性對照溶液制備陰性對照溶液制備加樣、觀察與記錄任務(wù)實(shí)施-碳酸氫鈉注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查三、凝膠限度試驗(yàn)操作2.結(jié)果判斷若陰性對照溶液Ｄ的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液Ｂ的平行管均為陽性，陽性對照溶液Ｃ的平行管均為陽性，試驗(yàn)有效。若溶液Ａ的兩支平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。若溶液Ａ的兩支平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液Ａ的兩支平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，應(yīng)進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時溶液Ａ須做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。若供試品的稀釋倍數(shù)小于最大有效稀釋倍數(shù)而溶液Ａ結(jié)果不符合規(guī)定時，可將供試品稀釋至最大有效稀釋倍數(shù)重新試驗(yàn)，再對結(jié)果進(jìn)行判斷。任務(wù)實(shí)施-碳酸氫鈉注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查三、凝膠限度試驗(yàn)操作2.結(jié)果判斷任務(wù)實(shí)施-碳酸氫鈉注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查三、凝膠限度試驗(yàn)操作2.結(jié)果判斷任務(wù)測評考核內(nèi)容考核標(biāo)準(zhǔn)配分得分供試品溶液的配制能正確吸取細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水5

能按要求配制供試品溶液10

陽性