海洋生物體中皮質(zhì)醇的測定

1DB21/XXXXX—XXXX海洋生物體中皮質(zhì)醇的測定本文件規(guī)定了海洋生物體中皮質(zhì)醇檢測的原理、試劑、儀器和設(shè)備、樣品前處理、樣品測定與結(jié)果、方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。本文件適用于魚類、蝦類、棘皮類、貝類生物體中皮質(zhì)醇的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB/T30891水產(chǎn)品抽樣規(guī)范3方法原理生物樣品中的皮質(zhì)醇，用0.2%甲酸乙腈溶液提取，固相萃取柱凈化、濃縮，超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，外標(biāo)法定量。4試劑4.1乙腈：色譜純。4.2甲酸：色譜純。4.3氯化鈉：分析純。4.4無水硫酸鈉：分析純。4.50.1%甲酸溶液：用移液管量取1mL甲酸，用水稀釋并定容至1000mL。4.60.2%甲酸乙腈溶液：用移液管量取1mL甲酸，用乙腈（80%）稀釋并定容至500mL。4.7標(biāo)準(zhǔn)品：皮質(zhì)醇（hydrocortisone，C21H30O5，CAS號50-23-7，純度98%以上）。4.8標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液（10mg/L）：準(zhǔn)確稱取1.00mg皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈稀釋至10mg/L，避光貯存在-18℃下。4.9標(biāo)準(zhǔn)溶液(1mg/L)：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1mL于10mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，避光冷藏貯存于2~6℃下。4.10針孔式微孔濾膜：0.22μm，有機系。（親水性聚丙烯、玻璃纖維、親水性PTFE、聚醚砜或其它等效材質(zhì)）4.11除非另有說明，在分析中所使用的水均符合GB/T6682規(guī)定的一級用水。5儀器和設(shè)備2DB21/XXXXX—XXXX5.1超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源、三重四級桿。5.2固相萃取裝置：固相萃取柱，CaptivateEMR（200mg，6cc）。5.3離心機：轉(zhuǎn)速：5000r/min。5.4分析天平：感量0.0001g和感量0.01g。5.5高速組織搗碎機。5.6均質(zhì)機。5.7氮吹儀。5.8渦旋混勻儀。6測定步驟6.1樣品制備與保存6.1.1水產(chǎn)品的試樣抽?。喊碐B/T30891的規(guī)定執(zhí)行。6.1.2水產(chǎn)品試樣制備：取樣品約100g，用高速組織搗碎機充分搗碎，均質(zhì)機混勻，均分成2份，一份用于檢測，另一份作為留樣。6.1.3樣品于-18℃下冷凍避光存放。6.2提取稱取樣品5.00g，置于50mL聚丙烯塑料離心管中，加入10mL的0.2%甲酸乙腈溶液，充分搖勻，渦旋，加入1g的氯化鈉和4g的無水硫酸鈉，充分渦旋混勻1min，超聲10min，靜置，以5000r/min4℃離心15min，取上清液4mL，放入空的聚丙烯塑料離心管中，加入1mL水，混勻，待凈化。6.3凈化和濃縮將待凈化溶液全部倒入固相萃取柱，保持約每秒一滴的流速，收集全部流出液(抽干)，45℃水浴濃縮氮吹儀氮吹至液面高度恒定，用水定容至1mL，上清液經(jīng)有機濾膜0.22μm過濾至進樣瓶中，供超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。6.4樣品測定參照下述條件進行測定：-BEHC18柱（2.1×50mmi.d.,1.7μm）；—流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫順序見表1；—進樣量：10μL；—柱溫：30℃;—流速：0.2mL/min。表1梯度洗脫順序3DB21/XXXXX—XXXX—電離模式電噴霧電離，正模式?！獟呙枘Ｊ剑憾喾磻?yīng)監(jiān)測（MRM）模式，監(jiān)測離子對（m/z）參見表2。表2質(zhì)譜條件sVESI+363.2>121代表定量離子6.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.9）5mL，用流動相逐級稀釋，配制成濃度分別為0、5.0、10.0、20.0、50.0、100μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，將此混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液按色譜、質(zhì)譜條件測定，通過儀器工作站制定外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖參見附錄A。6.6分析將樣品溶液注入液相色譜質(zhì)譜儀中，得到峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品溶液中皮質(zhì)醇的質(zhì)量濃度。 在同樣測試條件下，樣品溶液中皮質(zhì)醇的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中皮質(zhì)醇的保留時間之間的偏差在±2.5%以內(nèi)，且樣品溶液中皮質(zhì)醇的定性離子的相對豐度與質(zhì)量濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中皮質(zhì)醇的定性離子的相對豐度一致，其豐度比偏差應(yīng)符合表3的要求，則可判定樣品溶液中存在被測化合物。表3定性離子相對豐度的最大允許偏差±20%±25%±30%±50%7計算試樣中皮質(zhì)醇的含量，按下列公式（1）計算，結(jié)果保留3位有效數(shù)字，符合GB/T8170的數(shù)字修約要求。X=m...................................................................X——試樣中皮質(zhì)醇含量，單位為微克每千克(μg/kg）；C——通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的皮質(zhì)醇濃度，單位為微克每毫升(μg/mLV——試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）；m——試樣的稱取量，單位為克（g）。8線性范圍、靈敏度、精密度4DB21/XXXXX—XXXX8.1線性范圍皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)溶液線性范圍為0μg/L～100μg/L。8.2靈敏度皮質(zhì)醇的檢出限濃度為0.11μg/kg