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第七章雜交育種2/27/20251第一節(jié)雜交育種概述第二節(jié)常規(guī)雜交育種第三節(jié)原生質(zhì)體融合育種主要內(nèi)容2/27/20252第一節(jié)雜交育種概述2/27/20253雜交育種(hybridization):指通過基因重組的方法獲得新基因型的一項(xiàng)育種技術(shù)。雜交的目的:使雙親或多親的遺傳物質(zhì)重新組合,以獲得綜合雙親優(yōu)良性狀的新品種。
雜交育種:2/27/202541.可以獲得新品種。可以提高菌株性能,避免誘變飽和現(xiàn)象。3.可以總結(jié)遺傳規(guī)律,促進(jìn)遺傳學(xué)理論發(fā)展。雜交育種的意義2/27/20255原核生物(細(xì)菌和放線菌)雜交過程:兩個(gè)親本菌株的染色體發(fā)生部分轉(zhuǎn)移,形成部分結(jié)合子(merozygote),最后經(jīng)交換、重組直致重組體產(chǎn)生。真菌雜交過程:通過有性生殖(sexualreproduction)或準(zhǔn)性生殖(Parasexualreproduction)來完成。一、微生物雜交理論基礎(chǔ)2/27/20256原核微生物雜交方式:接合(conjugation)
轉(zhuǎn)化(transformation)
轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)(一)原核微生物雜交理論基礎(chǔ)2/27/20257接合(conjugation)接合:指供體菌(“♂”)通過性菌毛與受體菌(“♀”)直接接觸,通過F因子轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的重組過程。通過接合而獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞,稱為接合子(conjugant)。E.coli接合電鏡圖♂♀性菌毛2/27/202582/27/20259F-×F+F+F++F-×+F'F'F'×+F-HfrHfrF-(多數(shù)情況下)F-×+HfrHfrHfr(少數(shù)情況下)含F(xiàn)質(zhì)粒菌株雜交結(jié)果2/27/2025102/27/202511(二)真核微生物雜交理論基礎(chǔ)真核微生物雜交方式:有性雜交、準(zhǔn)性雜交和原生質(zhì)體融合等。1.有性雜交一般指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組,并產(chǎn)生新遺傳型后代的過程。凡能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌,原則上都可通過與高等動(dòng)、植物雜交育種相似的有性雜交方法進(jìn)行育種。2/27/2025122.準(zhǔn)性雜交(parasexualhybridization)準(zhǔn)性生殖是一種類似于有性生殖,但更為原始的生殖方式,它可使同種生物兩個(gè)不同菌株的體細(xì)胞發(fā)生融合,且不以減數(shù)分裂的方式而發(fā)生低頻率基因重組并產(chǎn)生重組子。準(zhǔn)性生殖常見于某些真菌,尤其是半知菌中。2/27/2025132/27/202514二、微生物雜交育種基本程序選擇原始親本誘變篩選直接親本直接親本之間親和力鑒定直接親本雜交分離與篩選重組體重組體分析鑒定2/27/2025152/27/2025161.原始親本菌株的選擇①原始親本:微生物雜交育種中具有不同遺傳背景的優(yōu)質(zhì)出發(fā)菌株。②選擇:主要根據(jù)雜交目的。選擇產(chǎn)量高、代謝快、產(chǎn)孢子能力強(qiáng)、無色素、泡沫少、粘性小等發(fā)酵性能好的菌株為原始親本。它們可以來自生產(chǎn)用菌或誘變過程中的某些符合要求的菌株,也可以是自然分離的野生型菌株。③標(biāo)記特征:原始親本還應(yīng)該具有野生型遺傳標(biāo)記,如抗性標(biāo)記等性狀。雜交育種中親本和培養(yǎng)基的選擇2/27/2025172.直接親本的選擇①直接親本:在雜交育種中由原始親本經(jīng)誘變劑處理后選出的具營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記或其他遺傳標(biāo)記,又通過親和力測(cè)定的直接用于雜交的菌株。②要求:a.各自的性狀優(yōu)良、突出,經(jīng)過重組后產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì);b.最好采用具有明顯遺傳性狀差異的近親菌株為直接親本。2/27/2025183.培養(yǎng)基常用的培養(yǎng)基:完全培養(yǎng)基(CM)、基本培養(yǎng)基(MM)、補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)和有限培養(yǎng)基(Limitedmedium,LM)。有限培養(yǎng)基:是專供異核體菌株生長(zhǎng)使用的培養(yǎng)基。通常在基本培養(yǎng)基或蒸餾水中加入適量(10%-20%)的完全培養(yǎng)基,加入的量只限兩直接親本菌株稍許生長(zhǎng),以提供相互接觸、吻合的菌絲體需要。加量過多,菌絲體也隨之增多,會(huì)影響異核體菌株的檢出。2/27/202519一般雜交親本用營(yíng)養(yǎng)缺陷型或抗藥性突變型等遺傳標(biāo)記,作為選擇重組體的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。此外,還要利用親本菌株本身具有的某些特殊遺傳性狀作為輔助標(biāo)記,如溫度敏感性、孢子顏色、代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高低等。雜交育種的遺傳標(biāo)記2/27/202520(一)常規(guī)雜交育種細(xì)菌、放線菌:接合(conjugation)、轉(zhuǎn)化(transfor-mation)、轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)等技術(shù)。真菌:有性生殖、準(zhǔn)性生殖三、雜交育種方法(二)原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)育種通過酶解破除細(xì)胞壁后制備微生物原生質(zhì)體,然后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合雜交,雙親本不受親合力限制,甚至可打破種屬間遺傳障礙,獲得遠(yuǎn)緣雜交重組體,這種特殊的雜交方式稱為原生質(zhì)體融合育種。2/27/202521第二節(jié)常規(guī)雜交育種
(放線菌雜交育種)2/27/202522放線菌雜交育種1955年在天藍(lán)色鏈霉菌中最早發(fā)現(xiàn)。放線菌的遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)菌相似,所以基因重組過程類似于細(xì)菌。通過供體菌向受體菌轉(zhuǎn)移部分染色體,經(jīng)過遺傳物質(zhì)交換,最終達(dá)到基因重組。但放線菌的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)習(xí)性與霉菌很相似,具有較復(fù)雜的形態(tài)分化,生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生菌絲體和分生孢子,所以育種操作方法與霉菌基本相同。放線菌的雜交只發(fā)生在具有一定感受態(tài)菌株之間。2/27/202523一、放線菌雜交原理2/27/2025241.接合由兩個(gè)基因型不同的直接親本菌絲體混合培養(yǎng),體細(xì)胞間接觸和融合,在雙方細(xì)胞增殖過程中兩個(gè)遺傳類型不一致的細(xì)胞核的部分染色體進(jìn)行轉(zhuǎn)移和遺傳信息交換,形成部分結(jié)合子。二、放線菌雜交過程2/27/202525
部分結(jié)合子是由一個(gè)供體細(xì)胞的部分染色體和一個(gè)受體細(xì)胞整套染色體相結(jié)合,同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞質(zhì)中。也有時(shí)兩個(gè)親本細(xì)胞的染色體都是以部分染色體進(jìn)行結(jié)合。ab2/27/2025262.雜合系和重組雜合系形成部分結(jié)合子形成后,在繁殖復(fù)制過程中,兩種不同基因型的染色體進(jìn)行一次交換,產(chǎn)生了雜合系,交換后的染色體不是封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)而是呈線狀,并且在染色體末端具有串連的重復(fù)體。這種重復(fù)結(jié)構(gòu),有的成為一個(gè)二體區(qū),有的是兩個(gè)二體區(qū)。2/27/202527雜合系和重組雜合系形成在復(fù)制過程中,開口的環(huán)狀染色體上基因再一次交換,由于位置不同而成為雜合狀態(tài),產(chǎn)生了各種不同基因型的重組雜合系。2/27/2025283.重組體以上產(chǎn)生的雜合系或重組雜合系,在以后進(jìn)一步繁殖過程中,雜合狀態(tài)染色體的不同區(qū)段還要進(jìn)行幾次交換。根據(jù)交換的位置不同,所攜帶的基因種類、數(shù)量也不一致,形成了一系列基因型的環(huán)狀染色體細(xì)胞,從產(chǎn)生的菌落中可檢出不同類型重組分離子。雜合系是形成重組體所必須的階段。2/27/202529放線菌雜交技術(shù):混合培養(yǎng)法玻璃紙法平板雜交法三、放線菌雜交技術(shù)2/27/202530混合培養(yǎng)法1準(zhǔn)備直接親本2斜面混合接種5雜合系分析4檢出重組體3制備單孢子懸液2/27/202531P平板雜交法2/27/202532第三節(jié)原生質(zhì)體融合育種2/27/202533一、原生質(zhì)體育種與原生質(zhì)體融合育種1953年,weibull等首次用溶菌酶處理巨大芽孢桿菌細(xì)胞獲得原生質(zhì)體,并首先提出原生質(zhì)體概念。1955年,Mcquillen首次發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌原生質(zhì)體的再生方法,使之恢復(fù)成正常細(xì)胞并能繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖。20th70s以來,各種原生質(zhì)體操作技術(shù)已成為工業(yè)微生物育種的重要手段,并取得了較大成就。
細(xì)胞壁被酶水解剝離,剩下由原生質(zhì)膜包圍著的原生質(zhì)部分成為原生質(zhì)體。2/27/202534原生質(zhì)體再生育種原生質(zhì)體誘變育種原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種原生質(zhì)體融合育種…常見原生質(zhì)體育種方法:2/27/202535
原生質(zhì)體再生育種是將微生物制備原生質(zhì)體后直接再生,從再生菌落中分離篩選變異菌株,最終得到優(yōu)良性狀提高的正變菌株。原生質(zhì)體再生育種不用任何誘變劑處理,而能產(chǎn)生比常規(guī)誘變還高的正變率。原生質(zhì)體再生育種2/27/202536是以微生物原生質(zhì)體為育種材料,采用物理或化學(xué)誘變劑處理,然后分離到再生培養(yǎng)基中再生,并從再生菌落中篩選高產(chǎn)突變菌株。1983年,Kim等首先采用該法誘變玫瑰色小單孢菌(Micromonosporarosaria)取得成功以來,應(yīng)用逐漸廣泛,已在抗生素、酶制劑、有機(jī)酸及維生素等高產(chǎn)突變株的選育中起到重要的作用。原生質(zhì)體誘變育種2/27/202537原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種是將整條染色體DNA或片斷DNA或質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的技術(shù),轉(zhuǎn)化育種為實(shí)現(xiàn)定向育種的目標(biāo)和原生質(zhì)體育種技術(shù)開拓了一個(gè)更廣闊的領(lǐng)域。一般來說,用染色體DNA或其他線狀DNA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體效率較低,而用質(zhì)粒DNA能得到高頻轉(zhuǎn)化率,完整質(zhì)粒、單鏈質(zhì)粒和重組質(zhì)粒都能成功地轉(zhuǎn)化。
2/27/202538原生質(zhì)體融合育種用水解酶除去遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的最大障礙——細(xì)胞壁,制成由原生質(zhì)膜包被的裸細(xì)胞,然后用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法,誘導(dǎo)遺傳特性不同的兩親本原生質(zhì)體融合,經(jīng)染色體交換、重組而達(dá)到雜交的目的,經(jīng)篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子。近年來,該技術(shù)已成為生物界頗受矚目的研究領(lǐng)域,是細(xì)胞生物學(xué)中迅速發(fā)展的方向之一。2/27/202539研究表明,由聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)的原生質(zhì)體融合是微生物獲得高頻重組的主要方法,種內(nèi)的融合頻率可高達(dá)27%,種間的融合頻率也可達(dá)10%,比常規(guī)的雜交重組頻率提高數(shù)千倍以上。最近出現(xiàn)的電場(chǎng)誘導(dǎo)融合又將融合率提高10倍。2/27/202540原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)缺點(diǎn):
第一,大幅度提高親本之間重組頻率。不少鏈霉菌通過原生質(zhì)體融合,其后代的重組率達(dá)1%左右,比準(zhǔn)性重組率高20-20000倍。如果融合前結(jié)合紫外線處理,重組頻率可達(dá)20%-30%。2/27/202541第二,擴(kuò)大重組的親本范圍。常規(guī)雜交的親本間必須具有感受態(tài),有些菌株由于其表面結(jié)構(gòu)緣故而無法用常規(guī)方法進(jìn)行雜交重組。原生質(zhì)體由于完全或部分去除了細(xì)胞壁,因此,實(shí)現(xiàn)常規(guī)雜交無法做到的種間、屬間、門間等遠(yuǎn)緣雜交。2/27/202542第三,原生質(zhì)體融合時(shí)親本整套染色體參與交換,遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和重組較多,集中雙親本優(yōu)良性狀機(jī)會(huì)更大。第四,與常規(guī)誘變育種途徑相比,還具有定向育種的特點(diǎn)。2/27/202543不足之處:①原生質(zhì)體融合后DNA交換和重組隨機(jī)發(fā)生,增加重組體分離篩選的難度。②細(xì)胞對(duì)異體遺傳物質(zhì)的降解和排斥作用,以及遺傳物質(zhì)非同源性等因素也會(huì)影響原生質(zhì)體融合的重組頻率,使遠(yuǎn)緣融合雜交存在較大困難。2/27/202544原理:原生質(zhì)體融合本質(zhì)是二親本菌株去除細(xì)胞壁后的一種體細(xì)胞雜交育種方法。兩個(gè)具有不同基因型的細(xì)胞,采用適宜的水解酶去除細(xì)胞壁后,在促融劑誘導(dǎo)作用下,兩個(gè)裸露的原生質(zhì)體接觸,融合成為異核體,經(jīng)過繁殖復(fù)制進(jìn)一步核融合,形成雜合二倍體,再經(jīng)過染色體交換產(chǎn)生重組體,達(dá)到基因重組目的,最后對(duì)重組體進(jìn)行生產(chǎn)性能、生理生化和遺傳特性分析。二、原生質(zhì)體融合育種的原理
2/27/202545三、原生質(zhì)體融合育種的步驟一)直接親本及其遺傳標(biāo)記選擇二)雙親本原生質(zhì)體制備與再生三)親本原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合四)融合重組體(稱為融合子)分離五)遺傳特性分析與測(cè)定六)生產(chǎn)性能篩選2/27/202546一)直接親本及其遺傳標(biāo)記的選擇
從育種角度,一般把誘變系譜中篩選獲得的不同“正突變株”作為直接親本進(jìn)行融合,通過交換、重組,使優(yōu)良性狀集中于重組體中,以加快育種速度?,F(xiàn)在一般認(rèn)為原生質(zhì)體融合的親本應(yīng)采用具有較大遺傳差異的近親菌株,重組后的新個(gè)體具有更大的雜種優(yōu)勢(shì)。2/27/202547遺傳標(biāo)記除常用的營(yíng)養(yǎng)缺陷和抗性標(biāo)記之外,也可采用熱致死(滅活)、孢子顏色和菌落形態(tài)等作為標(biāo)記。1.如果目的是為了進(jìn)行遺傳分析,應(yīng)該采用帶隱性基因的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株或抗性菌株。2.如果從育種角度進(jìn)行原生質(zhì)體融合,由于多數(shù)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株都會(huì)影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量(尤其對(duì)一些抗生素產(chǎn)生菌),選擇營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記時(shí),應(yīng)盡量避免采用對(duì)正常代謝有影響的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。2/27/2025483.采用滅活標(biāo)記。把雙親中任何一方的原生質(zhì)體用熱滅活(如50℃2h或60℃5min)或用紫外線、藥物滅活,使細(xì)胞內(nèi)的某些酶或代謝途徑鈍化,然后和另一方具有正?;钚缘脑|(zhì)體融合而獲得重組體。前者為供體,后者為受體,這樣可以省去營(yíng)養(yǎng)缺陷型的遺傳標(biāo)記。采用滅活標(biāo)記融合頻率較低,但重組體產(chǎn)量較高。2/27/202549二)原生質(zhì)體制備與再生
1原生質(zhì)體制備活性原生質(zhì)體制備過程包括原生質(zhì)體的分離、收集、純化、活性鑒定和保存等操作步驟。細(xì)胞去壁后,原生質(zhì)體從中釋放出來,此過程為原生質(zhì)體分離。
去壁的方法有三種:機(jī)械法、非酶分離法和酶法。2/27/202550酶法分離原生質(zhì)體:首先選擇原始親株,經(jīng)過遺傳標(biāo)記篩選,得到直接親本,采用培養(yǎng)皿平板玻璃紙法或搖瓶振蕩法培養(yǎng),取年輕的菌體轉(zhuǎn)入到高滲溶液中,加入有關(guān)水解酶,在一定條件下酶解細(xì)胞壁。注意:不同的微生物選擇不同的酶。細(xì)菌、放線菌:溶菌酶真菌:蝸牛酶、纖維素酶、葡聚糖酶2/27/202551酶法分離原生質(zhì)體的影響因素
(1)培養(yǎng)基組成
(2)菌體培養(yǎng)方式
(3)菌體菌齡
(4)穩(wěn)定劑
(5)酶解前的預(yù)處理
(6)酶系和酶的濃度
(7)酶的作用溫度和作用pH值
(8)菌體密度
(9)酶解方式
2/27/2025522.原生質(zhì)體的觀察
水解酶作用于菌體后,必須定時(shí)取樣觀察原生質(zhì)體分離的程度,以確定酶解終點(diǎn)。(1)低滲爆破法:直接在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體在低滲溶液中吸水膨脹、破裂的過程。細(xì)胞壁去除完全的原生質(zhì)體吸水破裂后細(xì)胞徹底解體,沒有殘骸;如果原生質(zhì)體破壁不完全,還有部分剩余細(xì)胞壁,則原生質(zhì)體從無細(xì)胞壁處吸水,膨脹破裂并留下一個(gè)殘存的細(xì)胞形態(tài);對(duì)于那些正常細(xì)胞或酶解程度不徹底的細(xì)胞,吸水后由于細(xì)胞壁的保護(hù)作用,不會(huì)脹裂,能維持正常形態(tài)。2/27/202553(2)熒光染色法:原生質(zhì)體混懸液用0.05%-0.1%的熒光增白劑(VBL)染色,離心棄染料、洗滌后在熒光顯微鏡下觀察(波長(zhǎng)用360-440nm),如發(fā)出紅色光則為完全原生質(zhì)體,如發(fā)出綠色光則表明還有細(xì)胞壁成分存在。2/27/2025543.原生質(zhì)體的收集和純化
(1)過濾法:適用于絲狀微生物(如放線菌、霉菌及絲狀微藻等),根據(jù)細(xì)胞大小,選用孔徑略小于細(xì)胞的砂芯漏斗,過濾。原生質(zhì)體由于外層細(xì)胞膜柔軟可變形,可以由比它小的微孔中穿過,而未酶解細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)卻不能,由此原生質(zhì)體和正常細(xì)胞分離而得到純化。對(duì)一些細(xì)胞較大的微生物(如微藻),也可采用微孔徑網(wǎng)篩來過濾原生質(zhì)體。2/27/202555(4)漂浮法:適用于一些細(xì)胞較大的微生物,原生質(zhì)體的比重小于細(xì)胞,能在一定滲透濃度的溶液中漂浮在液面上,從而得到純化。(3)界面法:將原生質(zhì)體分離液置于兩種液體的混懸液中,這兩種液體密度有區(qū)別,上層密度小于下層密度,離心后原生質(zhì)體就集中在兩層液面交界處而得到純化。(2)密度梯度離心法:用蔗糖或氯化銫等制成濃度梯度溶液,由于密度差別,經(jīng)離心后原生質(zhì)體漂浮于上部,未酶解細(xì)胞和細(xì)胞碎片沉于溶液下部。2/27/2025564.原生質(zhì)體的活力鑒定
染色鑒定法:
熒光素雙醋酸酯(FDA)染色法,F(xiàn)DA本身不發(fā)熒光,被細(xì)胞吸收酯解后產(chǎn)生具有熒光的極性物質(zhì)。熒光物質(zhì)不能透過質(zhì)膜,存在于活細(xì)胞內(nèi),這樣就可通過觀察原生質(zhì)體是否發(fā)生熒光來判斷其活性有無,能發(fā)出熒光的原生質(zhì)體具有活性。
2/27/2025575原生質(zhì)體的保存
低溫下保存:在一般冷藏條件下保存時(shí)間很短,有些種類幾小時(shí)就失活。在液氮中超低溫狀態(tài)下保存時(shí)間可長(zhǎng)些。方法是加入5%的二甲亞砜(DMS)或甘油等其他保護(hù)劑,迅速降溫保藏。
2/27/2025586原生質(zhì)體再生原生質(zhì)體具有細(xì)胞全能性,但本身不能立即進(jìn)行分裂、增殖,必須首先重新合成細(xì)胞壁物質(zhì),恢復(fù)至完整細(xì)胞形態(tài),才能進(jìn)一步生長(zhǎng)、分裂和增殖,這就是原生質(zhì)體的再生。(1)原生質(zhì)體再生的過程①大分子合成與原生質(zhì)體生長(zhǎng),這一時(shí)期原生質(zhì)體主要是合成細(xì)胞器成分,表現(xiàn)為原生質(zhì)體的體積增大;②細(xì)胞壁合成與再生,此時(shí)期主要合成細(xì)胞壁物質(zhì),組裝、恢復(fù)成完整細(xì)胞;③分裂能力恢復(fù)并開始分裂繁殖成為正常的細(xì)胞形態(tài)和菌落。
2/27/202559(2)原生質(zhì)體再生的影響因素
①菌體生理狀態(tài)②穩(wěn)定劑
細(xì)菌、放線菌和酵母菌多用糖醇系統(tǒng)的穩(wěn)定液,如放線菌常用10%-15%蔗糖溶液;霉菌常用鹽溶液系統(tǒng),如NaCl、KCl、MgSO4等組成的穩(wěn)定液,濃度為0.3-1.0mo1/L;③酶濃度和酶作用時(shí)間2/27/202560④再生培養(yǎng)基組成⑤殘存菌體的分離⑥原生質(zhì)體密度⑦排除再生培養(yǎng)基上的冷凝水2/27/202561(3)再生方法一般采用雙層平板法:其下層為再生培養(yǎng)基,瓊脂含量約2%,制成平板后除去冷凝水,取原生質(zhì)體懸浮液0.1ml加到平板上,然后上層加入含0.8%瓊脂或0.4%瓊脂糖的半固體同一成分的培養(yǎng)基3-10ml,迅速攤布均勻,使原生質(zhì)體植于固體培養(yǎng)基中,有利于再生。2/27/202562(4)再生率
通過再生率測(cè)定,可以檢驗(yàn)并進(jìn)一步找出最佳的原生質(zhì)體制備和再生條件及再生培養(yǎng)基。
再生頻率(%)=(再生培養(yǎng)基上總菌落數(shù)-酶處理后未原生質(zhì)體化菌落數(shù))/原生質(zhì)體總數(shù)×100%=[(C-B)/(A-B)]×100%。式中,A:總菌落數(shù),未經(jīng)酶處理的菌懸液涂布于平板生長(zhǎng)的菌落。B:未原生質(zhì)體化細(xì)胞,酶解混合液加蒸餾水破壞原生質(zhì)體,涂布平板后生長(zhǎng)的菌落。C:再生菌落數(shù),酶解混合液加高滲溶液,涂布于再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落。2/27/202563三)原生質(zhì)體融合
原生質(zhì)體融合過程(以霉菌為例)兩親株原生質(zhì)體混合于高滲透壓的穩(wěn)定液中,在PEG的誘導(dǎo)下,兩個(gè)或兩個(gè)以上凝聚成團(tuán),相鄰原生質(zhì)體緊密接觸的質(zhì)膜面擴(kuò)大,相互接觸的質(zhì)膜消失,細(xì)胞質(zhì)融合,形成一個(gè)異核體細(xì)胞,異核體的細(xì)胞在繁殖過程中發(fā)生核融合,形成雜合二倍體,通過染色體交換,產(chǎn)生各種重組體,稱融合子(fusant)。
2/27/202564原生質(zhì)體融合的影響因素
現(xiàn)在普遍采用的融合手段是PEG介導(dǎo)的化學(xué)融合法。有學(xué)者研究認(rèn)為低濃度PEG有穩(wěn)定原生質(zhì)體和促進(jìn)核分裂作用,也有利于細(xì)胞壁的形成和再生。(1)融合劑化學(xué)融合劑2/27/202565促融機(jī)制:PEG本身是一種特殊的脫水劑,它以分子橋形式在相鄰原生質(zhì)體膜間起中介作用,進(jìn)而改變質(zhì)膜的流動(dòng)性能,降低原生質(zhì)膜表面勢(shì)能,使膜中的鑲嵌蛋白質(zhì)顆粒凝聚,形成一層易于融合的無蛋白顆粒的磷酯雙分子層區(qū)。在Ca2+存在下,引起細(xì)胞膜表面的電子分布的改變,從而使接觸點(diǎn)的質(zhì)膜形成局部融合,出現(xiàn)凹陷,構(gòu)成原生質(zhì)橋,成為細(xì)胞間通道并逐漸擴(kuò)大,直到兩個(gè)原生質(zhì)體全部融合。2/27/202566PEG相對(duì)分子量:真菌一般采用4000-6000,放線菌常用1000-1500,細(xì)菌用1500-6000。PEG常用濃度:30%-50%真菌在30%左右效果較好,低于20%失去穩(wěn)定性,導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂,高于30%會(huì)引起原生質(zhì)體皺縮,過高還會(huì)產(chǎn)生中毒現(xiàn)象。2/27/202567物理融合劑電場(chǎng)
電融合:主要分為兩個(gè)階段:①在交流(AC)電場(chǎng)作用下,細(xì)胞受到電介質(zhì)電泳力F的作用,根據(jù)電泳現(xiàn)象,原生質(zhì)體向電極的方向泳動(dòng)。與此同時(shí),細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生偶極化,促使原生質(zhì)體相互粘連,并使細(xì)胞沿電力線方向排列成串,待融合細(xì)胞之間形成緊密接觸;②在外加瞬間高頻直流強(qiáng)電壓作用下,以50
s的時(shí)程脈沖沖擊原生質(zhì)體粘連點(diǎn),擾亂原生質(zhì)體膜的分子排列,使之穿孔,然后發(fā)生原生質(zhì)體膜復(fù)原過程,相連接的原生質(zhì)體發(fā)生融合。
2/27/202568⑵溫度和時(shí)間絲狀真菌適宜融合的溫度約為30℃;放線菌通常在常溫(約20℃)下進(jìn)行融合。細(xì)菌原生質(zhì)體融合的適溫往往偏低,據(jù)認(rèn)為4℃或20℃比37℃更好??偟膩碚f在20-30℃下進(jìn)行融合效果較理想。融合處理時(shí)間從lmin到1h,但絕大多數(shù)微生物在1-10min,處理時(shí)間過長(zhǎng),原生質(zhì)體因脫水而失活,時(shí)間過短則融合率低。
2/27/202569⑶親株的親和力和原生質(zhì)體的活性親合力是指雙親親緣關(guān)系,最好是親緣關(guān)系近些,遠(yuǎn)緣融合染色體交換后重組體不穩(wěn)定,易分離,影響融合效果。2/27/202570⑷無機(jī)離子在PEG介導(dǎo)融合時(shí),通常需要一定濃度的Ca2+和Mg2+,能更有效地促進(jìn)融合。通常所用濃度為CaCl20.05mol/L,MgCl20.02mol/L。電融合時(shí),混合液中離子存在對(duì)電場(chǎng)及原生質(zhì)體偶極化形成偶極子有一定影響,會(huì)干擾融合,一般采用糖或糖醇為穩(wěn)定劑,盡量減少無機(jī)離子。
2/27/202571⑸其他條件細(xì)胞密度一般具有活性的原生質(zhì)體濃度要在107-108ml-1,不少于106m1-l,并且應(yīng)采用年輕的、含殘余菌絲少的原生質(zhì)體進(jìn)行融合,這些都有助于提高融合頻率。
2/27/202572四)融合體再生、檢出與分離
1融合體再生
融合體的再生,包括融合體細(xì)胞壁合成、重建和融合體的再生,具體過程與一般原生質(zhì)體再生相同。2/27/2025732融合體的檢出與分離
⑴利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記選擇融合體⑵利用抗藥性選擇融合體⑶用滅活標(biāo)記選擇融合體⑷利用熒光染色法選擇融合體⑸雙親對(duì)碳源利用不同而檢出融合體
⑹融合體的其他選擇方法
2/27/202574五)融合重組體檢出與遺傳特性分析
檢出和鑒別融合重組體細(xì)胞的主要依據(jù)是親本的遺傳標(biāo)記,同時(shí)還要結(jié)合DNA含量和孢子形態(tài)等遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)方面特性加以確定。另外還要對(duì)重組體含染色體的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性進(jìn)行研究,綜合研究其各種性質(zhì),從而判斷它是異核體、雜合二倍體、還是重組二倍體或單倍體。
2/27/2025751重組體的檢出和鑒別的方法
⑴直接選擇法把PEG處理或電場(chǎng)處理的融合產(chǎn)物直接分離在基本培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基平板上,其中融合體由于營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ),經(jīng)過再生,長(zhǎng)出的菌落為融合菌落,同時(shí)還涂布于完全培養(yǎng)基上,以作對(duì)照,則可直接檢出融合細(xì)胞。一般絲狀真菌核融合需要基本培養(yǎng)基的強(qiáng)制培養(yǎng),都是采用直接選擇法。此法雖簡(jiǎn)便易行,但難以檢出那些表型延遲而基因卻已重組的融合重組體。2/27/202576⑵間接選擇法把融合產(chǎn)物先分離到完全培養(yǎng)基上,使原生質(zhì)體再生形成菌落。但是在該培養(yǎng)基上融合體和非融合的親本原生質(zhì)體都會(huì)生長(zhǎng)。所以需要把再生菌落上的孢子進(jìn)一步用影印法,分離到各種選擇性培養(yǎng)基上,從長(zhǎng)出的菌落分離重組體。這種方法連表型延遲的融合體也能檢出來,但對(duì)融合頻率低的菌株來說,在完全培養(yǎng)基上產(chǎn)生的絕大多數(shù)菌落是由沒有融合的原生質(zhì)體形成的,要檢出重組體需要花相當(dāng)大的人力和時(shí)間。
2/27/202577⑶鈍化選擇法
用滅活原生質(zhì)體和活性原生質(zhì)體融合。先把親本中的一方原生質(zhì)體在50℃熱處理2-3h,使融合前原生質(zhì)體代謝途徑中的某些酶鈍化而不能再生和形成菌落,但其部分遺傳物質(zhì)(標(biāo)記基因)可以和另一未滅活的親株(營(yíng)養(yǎng)缺陷型)原生質(zhì)體融合而得到重組體。滅活親株原生質(zhì)體和營(yíng)養(yǎng)缺陷型親株原生質(zhì)體在基本培養(yǎng)基上都不能生長(zhǎng),只有融合體才能形成菌落。2/27/2025782融合率
采用直接法,融合率的計(jì)算公式為:融合率(%)=基本培養(yǎng)基上再生的菌落數(shù)/完全培養(yǎng)基上再生的菌落數(shù)×100%采用間接法,融合率的計(jì)算公式為:融合率(%)=重組體后代總數(shù)/所有后代總數(shù)×100%霉菌、放線菌種內(nèi)融合率約為10-1-10-3,細(xì)菌、酵母菌種內(nèi)融合率為10-3-10-6。2/27/2025793DNA含量等的檢測(cè)⑴DNA含量測(cè)定通常測(cè)定的項(xiàng)目是二倍體和單倍體親株的DNA含量,通過顯微分光光度計(jì)直接測(cè)定孢子或菌絲細(xì)胞核中的DNA含量;也可用生化方法提取DNA后用二苯胺或紫外分光光度計(jì)測(cè)定其含量。2/27/202580⑵異核體單倍化霉菌原生質(zhì)體融合產(chǎn)物中除含有雜合二倍體、重組體外,還含有異核體。它們都能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成為菌落。但異核體菌株是不穩(wěn)定的,在繁殖過程中會(huì)分離成親本分離子,有時(shí)異核體可延續(xù)幾代。要
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