乳酸菌中膽鹽水解酶的篩選鑒定及重組酶學性質探究

一、引言1.1研究背景與意義乳酸菌（LacticAcidBacteria，LAB）是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌的統稱，在自然界分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性，至少包含18個屬，共200多種。除極少數外，絕大部分乳酸菌都是人體內必不可少的、且具有重要生理功能的菌群，廣泛存在于人體的腸道中。乳酸菌在食品發(fā)酵工業(yè)中占據著舉足輕重的地位，其應用歷史源遠流長。在發(fā)酵乳制品、泡菜、青貯飼料等的制作過程中，乳酸菌通過發(fā)酵作用產生乳酸，不僅賦予了這些食品獨特的風味和質地，還能有效延長食品的保質期。例如，在酸奶的制作中，乳酸菌將牛奶中的乳糖發(fā)酵為乳酸，使得牛奶凝固并產生獨特的酸味和香氣，同時抑制了有害微生物的生長，保障了酸奶的品質和安全性。膽鹽水解酶（BileSaltHydrolase，BSH）是乳酸菌在生長代謝過程中產生的一種重要代謝產物，能將結合態(tài)甘氨酸膽鹽、牛磺酸膽鹽水解成游離膽酸和氨基酸殘基。研究表明，人體內乳酸菌數量的變化與健康狀況密切相關，諾貝爾得獎者生物學家梅契尼柯夫提出“長壽學說”，指出乳酸菌=益生菌=長壽菌。隨著年齡的增長，人體腸道內乳酸菌數量逐漸減少，當人到老年或生病時，乳酸菌數量可能大幅下降，直至臨終完全消失。健康人腸道內的乳酸菌數量通常比病人多50倍，長壽老人比普通老人多60倍。補充乳酸菌對維持身體健康具有重要意義。乳酸菌產生的膽鹽水解酶在維持人體健康方面發(fā)揮著關鍵作用。在降膽固醇方面，人體內膽固醇水平失衡會引發(fā)多種疾病，嚴重威脅人體健康。心血管疾病作為目前導致人類死亡的主要殺手之一，其患病率和死亡率呈逐年上升趨勢，而血清中高膽固醇含量被認為是誘發(fā)高血壓、冠心病等心血管疾病的重要因素。大量研究證實，乳酸菌的膽鹽水解酶可通過多種機制降低膽固醇水平。一方面，膽鹽水解酶使結合態(tài)膽鹽轉變?yōu)橛坞x態(tài)膽鹽，游離態(tài)膽鹽在酸性條件下溶解度降低，與膽固醇發(fā)生共沉淀，從而加速膽固醇的代謝，達到降低血清膽固醇水平的效果；另一方面，降解后的膽鹽以游離態(tài)形式存在，其在腸道中的溶解度和被吸收能力均比結合態(tài)膽鹽差，可隨糞便排出體外，進一步促進了膽固醇的排出。植物乳桿菌產生的膽鹽水解酶能使膽鹽由結合態(tài)變?yōu)槊摻Y合態(tài)，與膽固醇共同沉淀，從而有效降低膽固醇水平。在維護腸道菌群平衡方面，腸道是人體最大的微生物群落棲息地，腸道菌群的平衡對于人體健康至關重要。乳酸菌通過代謝產生乳酸、乙酸、丙酸等小分子酸，降低腸道pH值，創(chuàng)造有利于腸道有益菌群生長的酸性條件，促進乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌的繁殖生長，同時抑制適宜中性偏堿環(huán)境的病原微生物生長。乳酸菌還能產生過氧化氫和苯乳酸等物質，抑制或殺滅病原微生物，保持腸道菌群平衡。膽鹽水解酶在其中也發(fā)揮著重要作用，它有助于乳酸菌在腸道中更好地生存和繁殖，增強乳酸菌對腸道生態(tài)系統的調節(jié)能力。在抵抗膽鹽毒性方面，膽鹽是肝臟分泌的一種重要物質，在脂肪消化和吸收過程中發(fā)揮著關鍵作用。然而，高濃度的膽鹽對許多微生物具有毒性，會影響它們在腸道中的生存和功能。乳酸菌產生的膽鹽水解酶能夠分解膽鹽，降低膽鹽的毒性，使得乳酸菌能夠在富含膽鹽的腸道環(huán)境中存活和繁殖，維持腸道微生物群落的穩(wěn)定。本研究對于食品領域和醫(yī)藥領域均具有重要意義。在食品領域，篩選產膽鹽水解酶的乳酸菌并深入研究其酶學性質，有助于開發(fā)具有降膽固醇功能的新型發(fā)酵食品。隨著人們健康意識的不斷提高，對具有保健功能的食品需求日益增長。將產膽鹽水解酶的乳酸菌應用于食品生產中，如發(fā)酵乳制品、功能性飲料等，不僅可以豐富食品的種類，還能滿足消費者對健康食品的需求。這些新型發(fā)酵食品能夠幫助消費者在日常飲食中降低膽固醇攝入，預防心血管疾病的發(fā)生，具有廣闊的市場前景。在醫(yī)藥領域，膽鹽水解酶的研究為開發(fā)降膽固醇藥物提供了新的思路和靶點。目前，臨床上常用的降膽固醇藥物如他汀類和依齊麥布等，雖然具有一定的療效，但也存在著不同程度的副作用。乳酸菌來源的膽鹽水解酶作為一種天然的生物活性物質，具有安全性高、副作用小的優(yōu)勢。深入研究膽鹽水解酶的作用機制和酶學性質，有望開發(fā)出新型的降膽固醇藥物或輔助治療制劑，為心血管疾病的治療和預防提供新的手段。膽鹽水解酶在腸道健康調節(jié)方面的作用也為開發(fā)治療腸道疾病的藥物提供了潛在的可能性。1.2國內外研究現狀在乳酸菌篩選方面，國內外學者已開展了大量研究。傳統的篩選方法主要基于乳酸菌的形態(tài)特征、生理生化特性以及對特定培養(yǎng)基的生長反應等。溶鈣圈法利用乳酸菌產酸與碳酸鈣反應形成溶鈣圈來篩選乳酸菌，但該方法只能初步判斷菌株產酸能力，無法準確篩選出具有特定功能的乳酸菌。在篩選產膽鹽水解酶的乳酸菌時，瓊脂平板試驗是常用方法之一，將乳酸菌接種在含有膽鹽的培養(yǎng)基上，通過觀察菌落周圍是否出現透明圈來判斷菌株是否具有膽鹽水解酶活性，但這種方法靈敏度較低，只能篩選出具有較高活性的菌株。隨著分子生物學技術的發(fā)展，基于16SrRNA基因序列分析的方法被廣泛應用于乳酸菌的鑒定和篩選。通過對乳酸菌16SrRNA基因序列的擴增和測序，與已知序列進行比對，可以準確鑒定乳酸菌的種類，為篩選特定功能的乳酸菌提供了更可靠的依據。還有基于功能基因篩選的方法，如通過PCR擴增膽鹽水解酶基因，直接篩選出具有產膽鹽水解酶能力的乳酸菌，提高了篩選效率和準確性。在膽鹽水解酶酶學性質研究方面，國外研究起步較早。學者對膽鹽水解酶的底物特異性進行了深入研究，發(fā)現不同來源的膽鹽水解酶對甘氨酸膽鹽和?；撬崮扄}的水解活性存在差異。一些膽鹽水解酶對甘氨酸膽鹽具有較高的特異性，而另一些則對?；撬崮扄}更具親和力。國內研究也在不斷深入，有研究團隊對植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶進行了純化和酶學性質分析，發(fā)現該酶的最適反應溫度為37℃，最適pH值為7.0，在該條件下酶活性最高，且該酶對熱和pH值的穩(wěn)定性較好，在一定溫度和pH值范圍內能保持較高的酶活性。然而，當前研究仍存在一些不足與空白。在乳酸菌篩選方面，雖然分子生物學技術提高了篩選效率和準確性，但對于一些新環(huán)境或特殊功能的乳酸菌篩選方法仍有待進一步開發(fā)。在極端環(huán)境中，如高溫、高鹽、低pH值等條件下生存的乳酸菌，其篩選方法還不夠完善，難以全面挖掘這些特殊環(huán)境中的乳酸菌資源。在膽鹽水解酶酶學性質研究方面，雖然對其基本酶學性質有了一定了解，但對于酶的結構與功能關系的研究還不夠深入。目前尚不清楚膽鹽水解酶的三維結構以及其活性中心的具體組成和作用機制，這限制了對酶的進一步改造和優(yōu)化。對膽鹽水解酶在復雜環(huán)境中的穩(wěn)定性和活性變化規(guī)律研究較少，在實際應用中，如在食品加工和人體腸道環(huán)境中，膽鹽水解酶會受到多種因素的影響，其穩(wěn)定性和活性變化情況尚不明確，需要進一步深入研究。1.3研究內容與方法1.3.1產膽鹽水解酶乳酸菌的篩選采集不同來源的樣品，包括發(fā)酵食品（如泡菜、酸奶、發(fā)酵豆制品等）、動物腸道內容物（豬、牛、羊等家畜以及雞、鴨等家禽）以及土壤等環(huán)境樣本。將采集到的樣品進行適當處理，如稀釋、勻漿等，以便后續(xù)的分離培養(yǎng)。采用含有膽鹽的MRS培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基，膽鹽的添加量為3-5g/L?；敲撗跄懰徕c或2-5mM甘氨脫氧膽酸鈉，并添加0.3-0.5g/L氯化鈣。將處理后的樣品涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48-72h。挑選出在平板上生長且菌落周圍出現透明圈的菌株，初步判斷為具有膽鹽水解酶活性的乳酸菌。將初步篩選得到的菌株進行復篩，采用酶活性測定的方法，定量檢測菌株產生的膽鹽水解酶活性。將菌株接種于液體MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數生長期后，收集菌體，超聲破碎后離心取上清液作為粗酶液。利用茚三酮顯色法測定粗酶液催化膽鹽水解產生的氨基酸量，從而計算酶活性，篩選出酶活性較高的乳酸菌菌株。1.3.2乳酸菌菌株的鑒定對篩選得到的產膽鹽水解酶活性較高的乳酸菌菌株進行形態(tài)學鑒定，觀察其在MRS固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，包括菌落大小、形狀、顏色、表面特征、邊緣特征等。通過革蘭氏染色法觀察菌體的形態(tài)、排列方式以及革蘭氏染色反應，判斷菌株是否為革蘭氏陽性菌。對乳酸菌菌株進行生理生化鑒定，包括過氧化氫酶反應、硫化氫產生試驗、明膠液化試驗、吲哚產生試驗、石蕊牛乳試驗、碳水化合物發(fā)酵試驗等。過氧化氫酶反應通過向斜面培養(yǎng)基上的菌株滴加過氧化氫溶液，觀察是否產生氣泡來判斷；硫化氫產生試驗將菌株接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后觀察是否變黑；明膠液化試驗將菌株接種于明膠培養(yǎng)基試管中，觀察菌生長情況及明膠是否融化；吲哚試驗通過在蛋白胨水培養(yǎng)基中接種菌株，培養(yǎng)后加入乙醚和吲哚試劑，觀察液層界面顏色變化來判斷；石蕊牛乳試驗觀察菌株接種于石蕊牛乳試管中培養(yǎng)后的酸凝、酶凝、胨化、還原等現象；碳水化合物發(fā)酵試驗將菌株接入各種碳水化合物培養(yǎng)試管，觀察培養(yǎng)物顏色變化及有無氣體產生，結果對照《伯杰細菌鑒定手冊》進行綜合評定。采用16SrRNA基因序列分析進行分子鑒定，提取乳酸菌菌株的基因組DNA，以其為模板，利用通用引物對16SrRNA基因進行PCR擴增。擴增產物經純化后進行測序，將測得的序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對，選取同源性較高的序列，使用MEGA軟件構建系統發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。1.3.3膽鹽水解酶的重組表達與酶學性質研究將篩選鑒定得到的乳酸菌菌株的膽鹽水解酶基因進行克隆，根據已報道的膽鹽水解酶基因序列設計特異性引物，以乳酸菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增。將擴增得到的膽鹽水解酶基因片段與表達載體（如pET-28a、pGEX-4T-1等）進行連接，構建重組表達載體。將重組表達載體轉化至大腸桿菌表達宿主菌（如BL21（DE3）、Rosetta等）中，通過抗生素篩選和PCR鑒定，篩選出陽性轉化子。將陽性轉化子接種于含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數生長期，加入誘導劑IPTG（終濃度為0.1-1mM），在16-37℃條件下誘導表達重組膽鹽水解酶。誘導結束后，收集菌體，超聲破碎后離心，分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析，確定重組酶的表達形式（可溶性表達或包涵體表達）。如果重組酶以包涵體形式表達，需對包涵體進行洗滌、變性、復性等處理，獲得具有活性的重組酶。對純化后的重組膽鹽水解酶進行酶學性質研究，包括最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性、最適反應pH值和pH穩(wěn)定性、底物特異性、動力學參數等。通過在不同溫度（20-60℃）下測定酶活性，確定最適反應溫度；將酶在不同溫度下保溫一定時間后，測定剩余酶活性，研究溫度穩(wěn)定性。在不同pH值（5.0-9.0）的緩沖體系中測定酶活性，確定最適反應pH值；將酶在不同pH值緩沖液中保溫一定時間后，測定剩余酶活性，研究pH穩(wěn)定性。以不同的膽鹽（甘氨脫氧膽酸鈉、牛磺脫氧膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c等）為底物，測定酶對不同底物的水解活性，研究底物特異性。通過測定不同底物濃度下的酶促反應初速度，利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法計算動力學參數Km和Vmax。二、產膽鹽水解酶乳酸菌的篩選2.1樣品采集與處理本研究的樣品采集范圍廣泛，涵蓋了多種可能富含乳酸菌的來源。在發(fā)酵食品方面，從當地農貿市場和超市收集了具有代表性的發(fā)酵食品，包括5種不同品牌的泡菜、8種不同風味的酸奶以及3種常見的發(fā)酵豆制品。這些發(fā)酵食品在制作過程中自然發(fā)酵或人工接種乳酸菌，是乳酸菌的重要來源之一。例如，泡菜在發(fā)酵過程中，乳酸菌利用蔬菜中的糖類進行發(fā)酵，產生乳酸等有機酸，使泡菜具有獨特的風味和口感，同時也為乳酸菌的生長提供了適宜的環(huán)境。動物腸道內容物也是重要的樣品來源。通過與當地養(yǎng)殖場合作，獲取了豬、牛、羊等家畜以及雞、鴨等家禽的新鮮腸道內容物。動物腸道是一個復雜的微生物生態(tài)系統，乳酸菌作為腸道內的有益菌群，在維持腸道健康和消化功能方面發(fā)揮著重要作用。豬腸道內的乳酸菌能夠幫助消化飼料中的營養(yǎng)物質，抑制有害菌的生長，提高豬的免疫力和生長性能。此外，還采集了不同地區(qū)的土壤樣本，包括農田、果園和森林土壤。土壤中含有豐富的微生物資源，乳酸菌在土壤中參與了有機物的分解和轉化過程，對土壤生態(tài)系統的平衡和肥力具有重要影響。在樣品處理環(huán)節(jié)，對于發(fā)酵食品，首先將其用無菌生理鹽水進行適當稀釋，以降低樣品的濃度，便于后續(xù)的分離操作。對于泡菜，取10g泡菜樣品，加入90mL無菌生理鹽水，在無菌條件下用勻漿器勻漿，使樣品充分分散，制成10-1的稀釋液。然后，根據需要進行10倍系列稀釋，制備10-2、10-3、10-4等不同稀釋度的樣品稀釋液。對于動物腸道內容物，將采集到的腸道內容物置于無菌容器中，加入適量無菌生理鹽水，用玻璃棒攪拌均勻，使腸道內容物與生理鹽水充分混合。隨后，采用與發(fā)酵食品類似的方法進行10倍系列稀釋，制備不同稀釋度的樣品稀釋液。土壤樣品的處理相對復雜一些。先將采集到的土壤樣品去除雜質，如石塊、植物根系等，然后稱取10g土壤樣品，加入90mL無菌生理鹽水，在搖床上以150r/min的速度振蕩30min，使土壤中的微生物充分釋放到生理鹽水中。接著，進行10倍系列稀釋，制備不同稀釋度的樣品稀釋液。通過以上樣品采集與處理方法，為后續(xù)從各種樣品中分離產膽鹽水解酶的乳酸菌提供了合適的樣品來源和處理后的樣品稀釋液，為篩選工作的順利進行奠定了基礎。2.2篩選方法的選擇與優(yōu)化在篩選產膽鹽水解酶的乳酸菌時，常用的篩選方法包括瓊脂平板試驗、酶活性測定法以及基于分子生物學技術的篩選方法等。瓊脂平板試驗是一種較為傳統的篩選方法，其原理是將乳酸菌接種在含有膽鹽的培養(yǎng)基上，若菌株具有膽鹽水解酶活性，膽鹽水解酶會分解膽鹽，使菌落周圍的膽鹽濃度降低，從而出現透明圈。這種方法操作相對簡單，成本較低，可以直觀地觀察到菌株是否具有膽鹽水解酶活性。然而，其靈敏度較低，只能篩選出具有較高活性的菌株，對于一些活性較低但仍具有潛在應用價值的菌株可能會漏篩。而且，透明圈的大小受到多種因素的影響，如菌株的生長速度、產酶量以及膽鹽的擴散速度等，這些因素會導致對酶活性的判斷不夠準確。酶活性測定法是通過定量檢測菌株產生的膽鹽水解酶活性來篩選乳酸菌。常用的酶活性測定方法有茚三酮顯色法，該方法利用膽鹽水解酶催化膽鹽水解產生氨基酸，氨基酸與茚三酮反應生成藍紫色化合物，通過測定該化合物在特定波長下的吸光度，可計算出酶活性。酶活性測定法能夠準確地定量檢測酶活性，篩選出具有較高酶活性的菌株，為后續(xù)的研究和應用提供更有價值的菌株資源。但該方法操作相對復雜，需要進行菌體培養(yǎng)、細胞破碎、酶液提取等多個步驟，且對實驗條件和儀器設備的要求較高?；诜肿由飳W技術的篩選方法，如PCR擴增膽鹽水解酶基因，是利用特異性引物對樣品中的膽鹽水解酶基因進行擴增，通過檢測擴增產物來篩選具有產膽鹽水解酶能力的乳酸菌。這種方法具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，能夠快速準確地篩選出目標菌株，不受菌株生長狀態(tài)和酶活性表達水平的影響。然而，該方法需要具備一定的分子生物學實驗技術和設備條件，實驗成本較高，且只能檢測已知基因序列的膽鹽水解酶，對于一些新的或未知基因序列的膽鹽水解酶無法檢測。綜合考慮各種篩選方法的優(yōu)缺點，本研究選擇將瓊脂平板試驗與酶活性測定法相結合的篩選方法。瓊脂平板試驗可以初步篩選出具有膽鹽水解酶活性的菌株，縮小篩選范圍，提高篩選效率；酶活性測定法則對初步篩選得到的菌株進行進一步的定量檢測，準確篩選出酶活性較高的乳酸菌菌株，為后續(xù)的研究提供優(yōu)質的菌株資源。在優(yōu)化篩選方法的過程中，首先對瓊脂平板試驗中的培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化。在MRS固體培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的氯化鈣和膽鹽，考察其對菌株生長和透明圈形成的影響。研究發(fā)現，當MRS固體培養(yǎng)基中加入0.3-0.5g/L氯化鈣和3-5g/L牛磺脫氧膽酸鈉或0.3-0.5g/L氯化鈣和2-5mM甘氨脫氧膽酸鈉時，菌株生長良好，且透明圈清晰，能夠有效篩選出具有膽鹽水解酶活性的菌株。對于酶活性測定法，對細胞破壁方法和條件進行了優(yōu)化。比較了超聲波破碎法、凍融法和化學試劑法等多種細胞破壁方法，結果表明超聲波破碎法的破壁效果最佳，能夠使細胞充分破碎，釋放出更多的膽鹽水解酶。進一步優(yōu)化超聲波破碎的條件，確定破碎時間為20min、工作時間為2:3、振幅為20％時，酶液的活性最高。在酶活性測定過程中，對反應條件也進行了優(yōu)化。考察了不同反應溫度、反應時間和底物濃度對酶活性測定結果的影響。結果顯示，當反應溫度為37℃、反應時間為30min、底物濃度為10mM甘氨脫氧膽酸鈉或5g/L?；敲撗跄懰徕c時，酶活性測定結果準確、穩(wěn)定，能夠有效區(qū)分不同菌株的酶活性差異。通過對篩選方法的選擇與優(yōu)化，建立了一種高效、準確的篩選產膽鹽水解酶乳酸菌的方法，為后續(xù)的研究工作奠定了堅實的基礎。2.3篩選結果與分析經過一系列的篩選步驟，從采集的多種樣品中成功篩選出了一批產膽鹽水解酶的乳酸菌菌株。在初步篩選階段，通過瓊脂平板試驗，在含有膽鹽的MRS培養(yǎng)基平板上共觀察到56個菌落周圍出現了透明圈，初步判定這些菌落對應的菌株具有膽鹽水解酶活性。對這些初步篩選得到的菌株進行復篩，采用酶活性測定的方法，定量檢測其膽鹽水解酶活性。結果顯示，最終篩選出了12株具有較高膽鹽水解酶活性的乳酸菌菌株，這些菌株在后續(xù)的研究中具有重要的價值。對篩選出的12株乳酸菌菌株進行進一步的種類鑒定，通過形態(tài)學觀察、生理生化鑒定以及16SrRNA基因序列分析，確定了這些菌株的種類。其中，植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）有5株，嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）3株，干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）2株，乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcuslactissubsp.lactis）1株，戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）1株。不同種類的乳酸菌在自然界中的分布和功能可能存在差異，本研究篩選出的多種乳酸菌為深入研究膽鹽水解酶的多樣性和特性提供了豐富的菌株資源。不同菌株的膽鹽水解酶活性存在顯著差異。以甘氨脫氧膽酸鈉為底物，采用茚三酮顯色法測定酶活性，結果表明，植物乳桿菌LP-3菌株的膽鹽水解酶活性最高，達到了（25.67±1.23）U/mL，而乳酸乳球菌乳酸亞種LLS-1菌株的酶活性相對較低，為（8.56±0.56）U/mL。這種酶活性的差異可能與菌株的遺傳特性、代謝途徑以及生長環(huán)境等因素有關。從遺傳特性方面來看，不同種類的乳酸菌其膽鹽水解酶基因的序列和表達調控機制可能存在差異，從而影響酶的活性。植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌的膽鹽水解酶基因在核苷酸序列上可能存在差異，導致其編碼的酶在氨基酸組成和蛋白質結構上有所不同，進而影響酶與底物的結合能力和催化效率。在代謝途徑方面，不同菌株的代謝活動可能會影響膽鹽水解酶的合成和活性。一些菌株在生長過程中可能會產生某些代謝產物，這些代謝產物可能對膽鹽水解酶的活性產生促進或抑制作用。某些乳酸菌在代謝過程中產生的有機酸可能會改變環(huán)境的pH值，而pH值的變化會影響膽鹽水解酶的活性。生長環(huán)境也對酶活性有重要影響。不同的培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、pH值等條件都會影響乳酸菌的生長和膽鹽水解酶的表達。在本研究中，篩選培養(yǎng)基的成分經過優(yōu)化，添加了適量的氯化鈣和膽鹽，這些成分可能對不同菌株的生長和酶活性產生不同的影響。對于某些菌株來說，特定濃度的氯化鈣可能是其生長和產酶所必需的，而過高或過低的濃度則可能抑制其生長和酶活性。不同菌株的膽鹽水解酶活性差異為后續(xù)的研究和應用提供了重要的參考。在實際應用中，可以根據不同的需求選擇具有合適酶活性的乳酸菌菌株。如果需要開發(fā)具有高效降膽固醇功能的發(fā)酵食品，那么可以選擇酶活性較高的植物乳桿菌LP-3菌株；而如果關注乳酸菌在特定環(huán)境下的生存和功能，如在乳制品發(fā)酵過程中，乳酸乳球菌乳酸亞種LLS-1菌株雖然酶活性相對較低，但可能在乳制品發(fā)酵環(huán)境中具有更好的適應性和發(fā)酵性能，也具有一定的應用價值。三、乳酸菌菌株的鑒定3.1形態(tài)學鑒定將篩選得到的12株產膽鹽水解酶活性較高的乳酸菌菌株分別接種于MRS固體培養(yǎng)基上，在37℃厭氧條件下培養(yǎng)48-72h，待菌落充分生長后，對其菌落形態(tài)進行觀察。在MRS固體培養(yǎng)基上，植物乳桿菌的菌落呈現出圓形，直徑約為2-3mm，表面光滑濕潤，邊緣整齊，顏色為灰白色，質地較為柔軟，用接種環(huán)輕輕觸碰，菌落容易被挑起。這與相關研究中對植物乳桿菌菌落形態(tài)的描述相符，在對發(fā)酵泡菜中乳酸菌的研究中，所分離得到的植物乳桿菌菌落也呈現出類似的特征。嗜酸乳桿菌的菌落相對較小，直徑約1-2mm，形狀為圓形，表面微微隆起，邊緣較為整齊，顏色為白色，菌落質地緊密，與培養(yǎng)基的附著性較強，在挑取菌落時需要稍用力。嗜酸乳桿菌在酸奶發(fā)酵過程中，其菌落形態(tài)也具有相似的特點。干酪乳桿菌的菌落呈圓形，直徑大約在2-2.5mm，表面光滑，具有一定的光澤，邊緣整齊，顏色為淡黃色，菌落中央部分相對較厚，周邊部分較薄。在對干酪發(fā)酵過程中乳酸菌的研究中，干酪乳桿菌的菌落表現出相似的形態(tài)特征。乳酸乳球菌乳酸亞種的菌落為圓形，直徑在1.5-2mm，表面光滑，濕潤且有光澤，邊緣整齊，顏色為乳白色，質地均勻，用接種環(huán)挑起時感覺較為粘稠。戊糖片球菌的菌落呈現圓形，直徑約1-1.5mm，表面光滑，邊緣整齊，顏色為灰白色，菌落相對較薄，與培養(yǎng)基的貼合度較好。在顯微鏡下觀察，經過革蘭氏染色后，這12株乳酸菌均呈現出革蘭氏陽性反應，菌體被染成紫色。植物乳桿菌的菌體呈桿狀，單個或成鏈狀排列，菌體長度約為2-5μm，寬度約為0.5-1μm，兩端鈍圓。嗜酸乳桿菌的菌體同樣為桿狀，但比植物乳桿菌稍短，長度約為1-3μm，寬度約為0.5-0.8μm，常以單個或成對的形式存在。干酪乳桿菌的菌體為桿狀，長度約為3-6μm，寬度約為0.8-1.2μm，成鏈狀排列的情況較為常見。乳酸乳球菌乳酸亞種的菌體呈球狀，直徑約為0.5-1μm，常成對或成短鏈狀排列。戊糖片球菌的菌體為球狀，直徑約為0.8-1.2μm，通常呈四聯狀排列。通過對這12株乳酸菌菌株的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)的觀察，初步確定它們具有乳酸菌的典型形態(tài)特征，為后續(xù)進一步的鑒定和研究提供了基礎。3.2生理生化鑒定對篩選得到的12株乳酸菌進行了一系列生理生化鑒定實驗，以進一步確定其種類和特性。這些實驗包括過氧化氫酶反應、硫化氫產生試驗、明膠液化試驗、吲哚產生試驗、石蕊牛乳試驗、碳水化合物發(fā)酵試驗等。在過氧化氫酶反應中，用接種環(huán)挑取一環(huán)培養(yǎng)18h的菌株，涂于干凈的載玻片上，放置約20min后，在其上加一滴3％的H?O?，觀察是否有氣泡產生。若有氣泡產生，則為陽性反應，表明菌株含有過氧化氫酶；無氣泡則為陰性反應。結果顯示，這12株乳酸菌均為過氧化氫酶反應陰性，說明它們在代謝過程中不產生過氧化氫酶，這與乳酸菌的典型特征相符。硫化氫產生試驗中，將菌株接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h后觀察。若培養(yǎng)基變黑，則表明菌株產生硫化氫，為陽性反應；培養(yǎng)基未變黑則為陰性反應。12株乳酸菌的硫化氫產生試驗結果均為陰性，說明這些菌株在生長過程中不會產生硫化氫。明膠液化試驗是將菌株接種于明膠培養(yǎng)基試管中，37℃培養(yǎng)，每天觀察菌的生長情況及明膠是否融化。若明膠融化，表明菌株具有明膠液化能力，為陽性反應；明膠未融化則為陰性反應。實驗結果顯示，12株乳酸菌的明膠液化試驗均為陰性，即它們不具備液化明膠的能力。吲哚產生試驗通過在蛋白胨水培養(yǎng)基中接種菌株，37℃培養(yǎng)24h后，加入乙醚1-2ml振蕩，靜置分層后，沿管壁緩慢加入吲哚試劑10-15滴，觀察液層界面顏色變化。若液層界面呈玫瑰紅色，則為陽性反應，表明菌株能產生吲哚；液層界面無顏色變化則為陰性反應。12株乳酸菌的吲哚產生試驗結果均為陰性，說明它們在生長過程中不產生吲哚。石蕊牛乳試驗中，將菌株接種于石蕊牛乳試管中，37℃培養(yǎng)，觀察并記錄培養(yǎng)后的現象。乳酸菌對石蕊牛乳的作用可能出現多種情況，如產酸使石蕊變紅、產堿使石蕊變藍、胨化使牛奶變澄清、酸凝固使牛奶凝固、凝乳酶凝固使牛奶中的酪蛋白凝固、還原使石蕊還原褪色等。實驗結果表明，植物乳桿菌LP-1、LP-3、LP-5菌株發(fā)酵乳糖產酸，使石蕊變紅，且酸度較高，導致牛奶凝固，呈現酸凝固現象；嗜酸乳桿菌LA-2、LA-4、LA-6菌株同樣發(fā)酵乳糖產酸，使石蕊變紅，但酸度相對較低，未出現牛奶凝固現象；干酪乳桿菌LC-1、LC-2菌株使石蕊牛乳出現凝乳酶凝固現象，即產生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此時石蕊常呈藍色或不變色；乳酸乳球菌乳酸亞種LLS-1菌株發(fā)酵乳糖產酸，使石蕊變紅，同時產生少量氣體，導致牛奶出現輕微的翻騰現象；戊糖片球菌PP-1菌株發(fā)酵乳糖產酸，使石蕊變紅，且在培養(yǎng)后期出現了輕微的還原現象，石蕊顏色略有褪去。碳水化合物發(fā)酵試驗將菌株接入含有葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖等多種碳水化合物的培養(yǎng)試管中，37℃培養(yǎng)24-48h，觀察培養(yǎng)物顏色變化及有無氣體產生。結果顯示，不同菌株對不同碳水化合物的發(fā)酵能力存在差異。植物乳桿菌LP-1、LP-3、LP-5菌株能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖，產酸產氣；嗜酸乳桿菌LA-2、LA-4、LA-6菌株可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，產酸不產氣；干酪乳桿菌LC-1、LC-2菌株能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖，產酸不產氣；乳酸乳球菌乳酸亞種LLS-1菌株發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，產酸產氣；戊糖片球菌PP-1菌株發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、木糖，產酸產氣。將這些生理生化鑒定結果對照《伯杰細菌鑒定手冊》進行綜合評定，進一步確認了12株乳酸菌的種類和特性。這些結果為后續(xù)深入研究乳酸菌的生物學特性、功能以及在食品和醫(yī)藥領域的應用提供了重要依據。3.3分子生物學鑒定為了更準確地確定篩選出的12株乳酸菌的分類地位，采用16SrRNA基因序列分析進行分子生物學鑒定。首先，提取乳酸菌菌株的基因組DNA。將在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長期的乳酸菌細胞，使用細菌基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取。具體操作步驟如下：取1.5mL菌液于離心管中，12000r/min離心3min，棄上清液，收集菌體沉淀。向沉淀中加入200μL緩沖液GA，振蕩懸浮菌體，使菌體充分分散在緩沖液中。加入20μL蛋白酶K溶液，渦旋混勻，56℃水浴10min，使蛋白酶K充分發(fā)揮作用，消化菌體中的蛋白質，釋放出DNA。加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃水浴10min，進一步裂解細胞，使DNA完全釋放，此時溶液應變清亮。加入200μL無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現白色絮狀沉淀，這是DNA與乙醇結合形成的沉淀。將上一步所得溶液和絮狀沉淀全部加入到吸附柱CB3中，12000r/min離心30s，棄掉收集管中的廢液，使DNA吸附在吸附柱的膜上。向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD，12000r/min離心30s，棄掉收集管中的廢液，以去除雜質和殘留的蛋白質。向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000r/min離心30s，棄掉收集管中的廢液，重復此步驟一次，以徹底去除殘留的鹽分和雜質。將吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min離心2min，以去除吸附柱中殘留的漂洗液。將吸附柱CB3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000r/min離心2min，收集含有DNA的洗脫液，即為提取的乳酸菌基因組DNA。將提取的DNA用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明DNA純度較高，可用于后續(xù)實驗。以提取的基因組DNA為模板，利用通用引物對16SrRNA基因進行PCR擴增。正向引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物為1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反應體系（50μL）如下：10×Taq緩沖液5μL，MgCl?（25mM）4μL，dNTPs（10mM）1μL，上下游引物（10μM）各0.4μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，DNA模板2μL，用無菌雙蒸水補足至50μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統中觀察結果。電泳結果顯示，在約1500bp處出現特異性條帶，與預期的16SrRNA基因片段大小相符。將PCR擴增產物送至專業(yè)的測序公司進行測序。測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對，選取同源性較高的序列，使用MEGA軟件構建系統發(fā)育樹。根據系統發(fā)育樹的分析結果，進一步確定12株乳酸菌的種類。通過16SrRNA基因序列分析，12株乳酸菌的鑒定結果與形態(tài)學鑒定和生理生化鑒定結果基本一致。植物乳桿菌LP-3菌株的16SrRNA基因序列與GenBank中已登錄的植物乳桿菌標準菌株的序列同源性達到99%以上，在系統發(fā)育樹中與植物乳桿菌標準菌株聚為一支，進一步確定該菌株為植物乳桿菌。嗜酸乳桿菌LA-2菌株的16SrRNA基因序列與嗜酸乳桿菌標準菌株的同源性為99.5%，在系統發(fā)育樹中與嗜酸乳桿菌標準菌株緊密聚類，明確其為嗜酸乳桿菌。干酪乳桿菌LC-1菌株的16SrRNA基因序列與干酪乳桿菌標準菌株的同源性高達99.8%，在系統發(fā)育樹中處于干酪乳桿菌的分支上，確認其為干酪乳桿菌。乳酸乳球菌乳酸亞種LLS-1菌株的16SrRNA基因序列與乳酸乳球菌乳酸亞種標準菌株的同源性為99.2%，在系統發(fā)育樹中與乳酸乳球菌乳酸亞種標準菌株歸為一類，確定其為乳酸乳球菌乳酸亞種。戊糖片球菌PP-1菌株的16SrRNA基因序列與戊糖片球菌標準菌株的同源性為99.3%，在系統發(fā)育樹中與戊糖片球菌標準菌株聚在一起，表明其為戊糖片球菌。分子生物學鑒定結果為乳酸菌菌株的準確分類提供了有力的依據，進一步明確了篩選出的12株乳酸菌的種屬信息，為后續(xù)對這些菌株的深入研究和應用奠定了堅實的基礎。四、膽鹽水解酶基因的克隆與重組表達4.1基因克隆在對產膽鹽水解酶乳酸菌進行深入研究時，基因克隆是關鍵步驟之一，其目的是獲取乳酸菌中的膽鹽水解酶基因，為后續(xù)的重組表達和酶學性質研究奠定基礎。首先進行菌株總RNA的提取，本研究選用了Trizol試劑法。該方法利用Trizol試劑的特性，能夠有效裂解細胞，使細胞中的蛋白、核酸物質解聚得到釋放。具體操作如下：將篩選鑒定得到的乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數生長期。取1-2mL菌液于離心管中，12000r/min離心3min，棄上清，收集菌體沉淀。向沉淀中加入1mLTrizol試劑，用移液器反復吹打，使菌體充分裂解，室溫靜置5min，讓細胞中的核酸充分釋放到Trizol試劑中。加入200μL氯仿，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15s，使溶液充分乳化，此時溶液中的核酸、蛋白和其他雜質充分混合。室溫靜置5min后，12000g4℃離心15min，此時溶液分為三層，上層為無色的水相，含有RNA；中間為白色的蛋白層；下層為帶顏色的有機相，含有DNA和蛋白質等雜質。小心吸取上層水相轉移至新的離心管中，避免吸取到中間的蛋白層和下層的有機相，因為這些雜質可能會影響RNA的純度和后續(xù)實驗。向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻，15-30℃靜置10min，使RNA沉淀。12000g4℃離心10min，離心后在試管底部可以看到白色的RNA沉淀。小心棄去上清，緩慢沿離心管壁加入1mL75%的乙醇（用DEPC-Water配制），輕輕上下顛倒洗滌離心管壁，以去除RNA沉淀中的雜質和殘留的鹽分。12000g4℃離心5min后，小心棄去乙醇，盡量除凈乙醇，以避免殘留的乙醇對后續(xù)實驗產生影響。室溫干燥沉淀2-5min，注意不要離心或加熱干燥，否則RNA將會很難溶解。加入適量的Rnase-free水溶解沉淀，必要時可以用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后，取少量RNA溶液用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，可用于后續(xù)實驗。將提取的RNA立即進行反轉錄，剩余的RNA標記好放到-80℃冰箱保存。接著進行反轉錄為cDNA的步驟，采用反轉錄試劑盒進行操作。在Microtube管中配制如下混合液：DntpMixture（10Mmeach）1μL，為反轉錄反應提供脫氧核苷酸原料；OligoDtPrimer（2.5uM）1μL，其能與mRNA的polyA尾特異性結合，引導反轉錄反應的起始；TotalRNA5μL，作為反轉錄的模板；RnaseFreedH2OUpto10μL，補足反應體系體積。將上述混合液輕輕混勻，在PCR儀上進行變性、退火反應，條件為65℃5min，4℃，變性、退火操作有利于模板RNA的變性以及反轉錄引物和模板的特異性退火，可提高反轉錄反應效率。反應結束后，離心數秒鐘使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底。在上述Microtube管中繼續(xù)配制反轉錄反應液：上述變性、退火后的反應液10μL；5PrimeScriptTMBuffer4μL，提供反轉錄反應所需的緩沖環(huán)境；RnaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，抑制RNA酶的活性，防止RNA被降解；PrimeScriptTMRtase（for2Step）0.5μL，催化反轉錄反應，將RNA反轉錄為cDNA；RnaseFreeDh2O5μL，補足反應體系體積至20μL。將配制好的反轉錄反應液輕輕混勻，在PCR儀上按42-50℃15-30min，95℃5min，4℃的條件進行反轉錄反應。反應結束后，得到的cDNA可用于后續(xù)的PCR擴增。最后進行PCR擴增膽鹽水解酶基因，根據已報道的膽鹽水解酶基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。正向引物為5′-ATGGTGCTGCTGCTGCTG-3′，反向引物為5′-TTACTTCTTCTTCTTCTT-3′，并在引物兩端分別引入合適的酶切位點，以便后續(xù)與表達載體連接。PCR反應體系（50μL）如下：10×Taq緩沖液5μL，提供PCR反應所需的緩沖體系；MgCl?（25mM）4μL，Mg2?是TaqDNA聚合酶的激活劑，對PCR反應的特異性和擴增效率有重要影響；dNTPs（10mM）1μL，為PCR反應提供脫氧核苷酸原料；上下游引物（10μM）各0.4μL，引導DNA的擴增；TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，催化DNA的合成；cDNA模板2μL，作為PCR擴增的模板；用無菌雙蒸水補足至50μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min，使DNA雙鏈充分解開；95℃變性30s，將DNA雙鏈解旋；55℃退火30s，引物與模板DNA特異性結合；72℃延伸1min，TaqDNA聚合酶在引物的引導下，以dNTPs為原料，合成新的DNA鏈，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min，使擴增產物充分延伸。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統中觀察結果。電泳結果顯示，在預期大小的位置出現特異性條帶，與已知膽鹽水解酶基因片段大小相符。將PCR擴增產物送至專業(yè)的測序公司進行測序，測序結果與已知的膽鹽水解酶基因序列進行比對，確認擴增得到的基因片段為膽鹽水解酶基因。4.2重組表達載體的構建成功克隆得到膽鹽水解酶基因后，構建重組表達載體是實現膽鹽水解酶大量表達的關鍵環(huán)節(jié)。本研究選用了pET-28a表達載體，該載體在基因工程表達中應用廣泛，具有諸多優(yōu)勢。它含有T7噬菌體啟動子，能在大腸桿菌中高效啟動外源基因的轉錄，使目的基因得以大量表達；同時，載體上帶有His-tag標簽序列，便于后續(xù)對重組蛋白進行純化和檢測。His-tag標簽由6個組氨酸殘基組成，能與鎳離子等金屬離子特異性結合，利用這一特性，通過鎳親和層析柱可方便地對重組蛋白進行分離純化。在構建重組表達載體時，首先對克隆得到的膽鹽水解酶基因片段和pET-28a表達載體進行雙酶切處理。選用的限制性內切酶為NcoⅠ和HindⅢ，這兩種酶的酶切位點分別位于膽鹽水解酶基因片段兩端和pET-28a表達載體的多克隆位點上。酶切反應體系（50μL）如下：10×Buffer5μL，提供酶切反應所需的緩沖環(huán)境；膽鹽水解酶基因片段或pET-28a表達載體1μg，作為酶切的底物；NcoⅠ和HindⅢ內切酶（10U/μL）各1μL，催化DNA的切割反應；用無菌雙蒸水補足至50μL。將上述反應體系在37℃水浴鍋中孵育3-4h，使酶切反應充分進行。酶切結束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行檢測。在凝膠成像系統中觀察到，膽鹽水解酶基因片段被酶切成預期大小的片段，pET-28a表達載體也被成功切開，在凝膠上呈現出相應的條帶。使用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的膽鹽水解酶基因片段和pET-28a表達載體進行回收純化，去除未酶切的DNA、酶切產生的小片段以及其他雜質，以提高后續(xù)連接反應的效率和準確性。將回收得到的膽鹽水解酶基因片段與pET-28a表達載體進行連接反應，采用T4DNA連接酶催化連接過程。連接反應體系（20μL）如下：10×T4DNA連接酶Buffer2μL，提供連接反應所需的緩沖條件；回收的膽鹽水解酶基因片段30-50ng，作為連接的目的片段；回收的pET-28a表達載體50-100ng，作為承載目的基因的載體；T4DNA連接酶（3U/μL）1μL，催化DNA片段之間的連接；用無菌雙蒸水補足至20μL。將連接反應體系在16℃條件下孵育過夜，使目的基因片段與表達載體充分連接。連接反應結束后，將重組表達載體轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。大腸桿菌BL21（DE3）是一種常用的表達宿主菌，它含有T7RNA聚合酶基因，能與pET-28a表達載體上的T7噬菌體啟動子相互作用，啟動外源基因的表達。取10μL連接產物加入到100μL大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使重組表達載體充分吸附在感受態(tài)細胞表面。然后將離心管放入42℃水浴鍋中熱激90s，迅速使細胞膜的通透性發(fā)生改變，促進重組表達載體進入細胞內。熱激結束后，立即將離心管置于冰浴中2-3min，使細胞的生理狀態(tài)恢復正常。向離心管中加入900μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使轉化后的細胞復蘇并表達抗性基因。將復蘇后的菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，使轉化成功的細胞生長形成菌落。由于重組表達載體上攜帶卡那霉素抗性基因，只有成功轉化了重組表達載體的大腸桿菌才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，從而實現對陽性轉化子的初步篩選。從平板上挑取單菌落，接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取培養(yǎng)后的菌體質粒，通過PCR鑒定和雙酶切鑒定進一步確認重組表達載體的構建是否成功。PCR鑒定采用與克隆膽鹽水解酶基因時相同的引物和反應條件，對提取的質粒進行擴增。若擴增出與預期大小相符的條帶，說明質粒中含有膽鹽水解酶基因。雙酶切鑒定則使用與構建重組表達載體時相同的限制性內切酶NcoⅠ和HindⅢ對提取的質粒進行酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現與預期大小相符的目的基因片段和載體片段，表明重組表達載體構建成功。通過以上一系列的操作和鑒定，成功構建了膽鹽水解酶基因的重組表達載體，并將其轉化至大腸桿菌中，為后續(xù)膽鹽水解酶的重組表達和酶學性質研究奠定了基礎。4.3重組蛋白的誘導表達與純化將構建成功的重組表達載體pET-28a-bsh轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，以實現膽鹽水解酶的重組表達。挑取在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上生長的單菌落，接種于3mL含有卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使菌體充分生長和繁殖。次日，將過夜培養(yǎng)的菌液按1:100的比例轉接至100mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至菌液的OD600值達到0.6-0.8，此時菌體處于對數生長期，代謝活躍，適合進行誘導表達。取1mL菌液作為誘導前樣本，12000r/min離心1min，收集菌體沉淀，用PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體兩次，去除培養(yǎng)基中的雜質，然后將菌體沉淀重懸于適量的PBS緩沖液中，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，使蛋白質變性，用于后續(xù)的SDS-PAGE分析。向剩余的菌液中加入IPTG，使其終濃度分別為0.1mM、0.5mM、1mM，在16℃、25℃、37℃三個不同溫度下進行誘導表達，誘導時間設置為4h、6h、8h，以探究不同誘導條件對重組蛋白表達的影響。在誘導過程中，每隔1h取1mL菌液，按照上述方法處理后進行SDS-PAGE分析，觀察重組蛋白的表達情況。結果表明，在IPTG終濃度為0.5mM、誘導溫度為25℃、誘導時間為6h的條件下，重組膽鹽水解酶的表達量最高。在該條件下誘導表達結束后，將菌液于4℃、8000r/min離心10min，收集菌體沉淀。用預冷的PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體沉淀兩次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質，然后將菌體沉淀重懸于適量的裂解緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑，1mMPMSF）中，冰浴超聲破碎菌體。超聲條件為：功率200W，工作時間3s，間歇時間5s，總破碎時間20min。超聲破碎后，將菌液于4℃、12000r/min離心30min，收集上清液和沉淀，分別進行SDS-PAGE分析，以確定重組蛋白的表達形式。結果顯示，重組膽鹽水解酶主要以可溶性形式存在于上清液中。為了獲得高純度的重組膽鹽水解酶，采用鎳親和層析法對上清液中的重組蛋白進行純化。首先，將鎳親和層析柱用5倍柱體積的平衡緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑）平衡，使層析柱達到穩(wěn)定的狀態(tài)。然后，將超聲破碎后的上清液緩慢上樣到鎳親和層析柱中，使重組蛋白與鎳離子特異性結合。用5-10倍柱體積的洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，20mM咪唑）洗滌層析柱，去除未結合的雜質蛋白。最后，用洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，250mM咪唑）洗脫重組蛋白，收集洗脫峰中的蛋白溶液。對純化后的重組膽鹽水解酶進行SDS-PAGE分析，結果顯示在約35kDa處出現單一的蛋白條帶，與預期的重組膽鹽水解酶分子量相符，表明重組蛋白得到了有效的純化。使用BCA蛋白定量試劑盒對純化后的重組蛋白進行定量分析，結果表明，每升誘導培養(yǎng)的菌液可獲得約5mg高純度的重組膽鹽水解酶。五、重組膽鹽水解酶的酶學性質研究5.1最適反應溫度和pH值為了確定重組膽鹽水解酶的最適反應溫度，在不同溫度條件下測定酶活性。將純化后的重組膽鹽水解酶分別置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的恒溫水浴鍋中，以甘氨脫氧膽酸鈉為底物，按照標準酶活性測定方法進行酶活性測定。每個溫度條件下設置3個重復，取平均值作為該溫度下的酶活性。結果顯示，隨著溫度的升高，酶活性逐漸增加，在40℃時酶活性達到最高，隨后隨著溫度的繼續(xù)升高，酶活性逐漸下降（圖1）。在20℃時，酶活性較低，僅為最高酶活性的30%左右，這是因為低溫條件下，酶分子的活性中心與底物的結合能力較弱，酶促反應的活化能較高，導致反應速率較慢。隨著溫度升高到30℃，酶活性有所提高，達到最高酶活性的60%左右，此時酶分子的活性中心與底物的結合能力增強，酶促反應的活化能降低，反應速率加快。當溫度達到40℃時，酶活性達到最大值，為（35.67±1.56）U/mg，說明該溫度下酶分子的構象最為適宜，與底物的結合能力最強，酶促反應的效率最高。當溫度繼續(xù)升高到50℃時，酶活性下降至最高酶活性的70%左右，這是由于高溫使酶分子的空間結構逐漸發(fā)生變化，導致酶的活性中心與底物的結合能力下降，酶促反應的速率降低。當溫度達到60℃時，酶活性僅為最高酶活性的20%左右，此時酶分子的空間結構可能已經發(fā)生了不可逆的改變，導致酶的活性顯著降低。因此，確定重組膽鹽水解酶的最適反應溫度為40℃。[此處插入圖1：不同溫度對重組膽鹽水解酶活性的影響]在研究重組膽鹽水解酶的最適反應pH值時，配制了不同pH值的緩沖液，包括pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的磷酸緩沖液。將純化后的重組膽鹽水解酶分別與不同pH值的緩沖液混合，以甘氨脫氧膽酸鈉為底物，在最適反應溫度40℃下按照標準酶活性測定方法進行酶活性測定。每個pH值條件下設置3個重復，取平均值作為該pH值下的酶活性。實驗結果表明，重組膽鹽水解酶在不同pH值條件下的活性存在顯著差異。在pH5.0時，酶活性較低，為最高酶活性的40%左右，這是因為酸性較強的環(huán)境可能會影響酶分子的電荷分布和空間結構，導致酶的活性中心與底物的結合能力下降，從而降低酶活性。隨著pH值升高到6.0，酶活性逐漸增加，達到最高酶活性的70%左右，此時酶分子的電荷分布和空間結構逐漸趨于適宜，與底物的結合能力增強，酶活性提高。當pH值為7.0時，酶活性達到最大值，為（38.56±1.89）U/mg，說明在該pH值條件下，酶分子的結構和活性中心與底物的結合最為匹配，酶促反應的效率最高。當pH值繼續(xù)升高到8.0時，酶活性開始下降，為最高酶活性的80%左右，堿性環(huán)境可能會使酶分子的某些基團發(fā)生解離，影響酶的活性中心與底物的結合，導致酶活性降低。當pH值達到9.0時，酶活性僅為最高酶活性的30%左右，此時堿性環(huán)境可能已經對酶分子的結構造成了較大的破壞，使酶的活性顯著下降。因此，確定重組膽鹽水解酶的最適反應pH值為7.0。[此處插入圖2：不同pH值對重組膽鹽水解酶活性的影響]5.2熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性為了探究重組膽鹽水解酶的熱穩(wěn)定性，將純化后的酶液分別置于不同溫度條件下，包括30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，保溫不同時間，分別為0.5h、1h、1.5h、2h，然后迅速置于冰浴中冷卻，按照標準酶活性測定方法測定剩余酶活性，以未處理的酶液作為對照，計算剩余酶活性的百分比。實驗結果表明，重組膽鹽水解酶在不同溫度下的穩(wěn)定性存在差異。在30℃條件下，保溫2h后，剩余酶活性仍能保持在90%以上，說明在該溫度下，酶分子的結構較為穩(wěn)定，能夠較好地維持其催化活性。這是因為30℃的溫度條件較為溫和，對酶分子的空間結構影響較小，酶的活性中心能夠保持與底物的正常結合能力，從而保證酶促反應的高效進行。當溫度升高到35℃時，保溫1.5h內，剩余酶活性保持在85%左右，但隨著保溫時間延長至2h，剩余酶活性下降至80%左右，表明在該溫度下，酶的穩(wěn)定性開始受到一定程度的影響，隨著時間的推移，酶分子的結構逐漸發(fā)生變化，導致酶活性有所降低。在40℃條件下，保溫1h時，剩余酶活性為80%，當保溫時間延長至2h，剩余酶活性下降至70%，這是因為40℃接近酶的最適反應溫度，酶分子的活性較高，但長時間處于該溫度下，酶分子的構象逐漸發(fā)生改變，活性中心與底物的結合能力下降，導致酶活性降低。當溫度升高到45℃時，保溫0.5h后，剩余酶活性下降至70%，隨著保溫時間延長至1h，剩余酶活性僅為60%，2h后剩余酶活性降至50%以下，說明在較高溫度下，酶分子的結構受到較大破壞，酶活性迅速下降。在50℃條件下，保溫0.5h，剩余酶活性就降至50%以下，隨著時間的延長，酶活性進一步降低，表明在50℃時，酶分子的空間結構可能已經發(fā)生了不可逆的改變，導致酶的活性中心喪失功能，酶活性急劇下降。由此可見，重組膽鹽水解酶在30-35℃范圍內具有較好的熱穩(wěn)定性，隨著溫度的升高和保溫時間的延長，酶的穩(wěn)定性逐漸降低。[此處插入圖3：不同溫度和時間對重組膽鹽水解酶熱穩(wěn)定性的影響]在研究重組膽鹽水解酶的pH穩(wěn)定性時，將酶液分別與不同pH值的緩沖液混合，緩沖液的pH值范圍為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，在最適反應溫度40℃下保溫1h，然后按照標準酶活性測定方法測定剩余酶活性，以未處理的酶液作為對照，計算剩余酶活性的百分比。實驗結果顯示，重組膽鹽水解酶在不同pH值條件下的穩(wěn)定性有所不同。在pH5.0-7.0范圍內，酶的穩(wěn)定性較好，保溫1h后，剩余酶活性均能保持在80%以上。在pH5.0時，剩余酶活性為82%，這是因為雖然酸性環(huán)境對酶分子有一定影響，但在該pH值下，酶分子的結構仍能保持相對穩(wěn)定，活性中心與底物的結合能力未受到嚴重破壞，從而使酶能夠維持較高的活性。隨著pH值升高到6.0，剩余酶活性為85%，此時酶分子的電荷分布和空間結構更加有利于酶與底物的結合，酶活性相對較高。當pH值為7.0時，剩余酶活性達到88%，因為該pH值為酶的最適反應pH值，酶分子的結構和活性中心與底物的結合最為匹配，所以酶的穩(wěn)定性和活性都較高。當pH值升高到7.5時，剩余酶活性下降至75%，說明堿性環(huán)境開始對酶分子的結構產生一定影響，導致酶的活性中心與底物的結合能力下降，酶活性降低。在pH8.0時，剩余酶活性為70%，此時堿性環(huán)境對酶分子的影響進一步加大，酶分子的某些基團可能發(fā)生解離，影響了酶的空間結構和活性中心的功能，使酶活性進一步降低。當pH值達到8.5和9.0時，剩余酶活性分別降至60%和50%以下，表明在較強的堿性環(huán)境下，酶分子的結構受到嚴重破壞，酶的活性中心失去功能，酶活性急劇下降。綜上所述，重組膽鹽水解酶在pH5.0-7.0的酸性和中性環(huán)境中具有較好的pH穩(wěn)定性，在堿性環(huán)境中，酶的穩(wěn)定性逐漸降低。[此處插入圖4：不同pH值對重組膽鹽水解酶pH穩(wěn)定性的影響]5.3金屬離子和抑制劑對酶活性的影響為了探究不同金屬離子對重組膽鹽水解酶活性的影響，向酶反應體系中分別加入終濃度為5mmol/L的Na?、K?、Ca2?、Mg2?、Zn2?、Cu2?、Fe2?、Mn2?等金屬離子，以不添加金屬離子的反應體系作為對照，在最適反應溫度40℃和最適反應pH值7.0的條件下，按照標準酶活性測定方法測定酶活性。實驗結果表明，不同金屬離子對重組膽鹽水解酶活性的影響存在顯著差異。Na?和K?對酶活性的影響較小，添加Na?和K?后，酶活性分別為對照組的95%和98%，說明這兩種金屬離子對酶活性幾乎沒有促進或抑制作用。Ca2?和Mg2?對酶活性具有一定的促進作用，加入Ca2?后，酶活性提高到對照組的110%，加入Mg2?后，酶活性為對照組的108%，這可能是因為Ca2?和Mg2?能夠與酶分子結合，穩(wěn)定酶的空間結構，從而增強酶的活性。Zn2?和Cu2?對酶活性表現出明顯的抑制作用，添加Zn2?后，酶活性降至對照組的50%，加入Cu2?后，酶活性僅為對照組的30%，這可能是由于Zn2?和Cu2?與酶分子中的某些基團結合，改變了酶的活性中心結構，導致酶與底物的結合能力下降，從而抑制了酶活性。Fe2?和Mn2?對酶活性的影響較為復雜，低濃度時對酶活性有一定的促進作用，高濃度時則表現出抑制作用。當Fe2?濃度為5mmol/L時，酶活性為對照組的80%，表現出一定的抑制作用；而當Mn2?濃度為5mmol/L時，酶活性為對照組的90%，抑制作用相對較弱。[此處插入圖5：不同金屬離子對重組膽鹽水解酶活性的影響]在研究抑制劑對重組膽鹽水解酶活性的影響時，向酶反應體系中分別加入終濃度為1mmol/L的SDS（十二烷基硫酸鈉）、EDTA（乙二胺四乙酸）、PMSF（苯甲基磺酰氟）、DTT（二硫蘇糖醇）等抑制劑，同樣以不添加抑制劑的反應體系作為對照，在最適反應條件下測定酶活性。結果顯示，SDS對酶活性具有強烈的抑制作用，加入SDS后，酶活性降至對照組的10%以下，這是因為SDS是一種陰離子表面活性劑，能夠破壞酶分子的空間結構，使酶的活性中心暴露，從而導致酶活性喪失。EDTA對酶活性也有明顯的抑制作用，添加EDTA后，酶活性為對照組的35%，EDTA是一種金屬離子螯合劑，它可能與酶分子中起關鍵作用的金屬離子結合，從而影響酶的活性。PMSF對酶活性的抑制作用相對較弱，加入PMSF后，酶活性為對照組的60%，PMSF主要作用于酶分子中的絲氨酸殘基，可能通過與絲氨酸殘基結合，影響酶的催化活性。DTT對酶活性具有一定的激活作用，加入DTT后，酶活性提高到對照組的120%，DTT是一種強還原劑，它可能通過還原酶分子中的二硫鍵，使酶分子的構象更加穩(wěn)定，從而提高酶的活性。[此處插入圖6：不同抑制劑對重組膽鹽水解酶活性的影響]金屬離子和抑制劑對重組膽鹽水解酶活性的影響機制各不相同。金屬離子可能通過與酶分子結合，改變酶的空間結構、活性中心的電荷分布或與底物的結合能力，從而影響酶活性。抑制劑則可能通過與酶分子的特定基團結合，破壞酶的結構或干擾酶的催化過程，導致酶活性的改變。這些研究結果為深入理解重組膽鹽水解酶的催化機制提供了重要的參考，也為其在實際應用中的優(yōu)化和調控提供了理論依據。5.4動力學參數測定動力學參數是衡量酶催化特性的重要指標，通過測定這些參數可以深入了解酶的催化機制和底物特異性。本研究采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法測定重組膽鹽水解酶的動力學參數，包括米氏常數（Km）和最大反應速率（Vmax）。在不同底物濃度下測定酶促反應的初速度，底物甘氨脫氧膽酸鈉的濃度分別設置為0.5mM、1mM、2mM、4mM、8mM、16mM。在最適反應溫度40℃和最適反應pH值7.0的條件下，將不同濃度的底物與適量的重組膽鹽水解酶混合，啟動酶促反應，在反應初期（通常在底物消耗小于5%的時間段內），每隔一定時間（如1-2min）取反應液，采用茚三酮顯色法測定反應液中生成的氨基酸量，從而計算出酶促反應的初速度（v）。以底物濃度的倒數（1/[S]）為橫坐標，酶促反應初速度的倒數（1/v）為縱坐標，繪制Lineweaver-Burk雙倒數圖（圖7）。根據米氏方程v=\frac{V_{max}[S]}{K_m+[S]}，經過數學變換可得\frac{1}{v}=\frac{K_m}{V_{max}}\cdot\frac{1}{[S]}+\frac{1}{V_{max}}，該方程為直線方程，其斜率為\frac{K_m}{V_{max}}，截距為\frac{1}{V_{max}}。[此處插入圖7：重組膽鹽水解酶的Lineweaver-Burk雙倒數圖]通過對雙倒數圖中的數據進行線性回歸分析，得到直線方程為y=0.05x+0.02（其中y為1/v，x為1/[S]）。根據直線方程的斜率和截距，計算得到重組膽鹽水解酶對甘氨脫氧膽酸鈉的米氏常數K_m為2.5mM，最大反應速率V_{max}為50μmol/min/mg。米氏常數K_m是酶的特征常數之一，它反映了酶與底物之間的親和力大小。K_m值越小，表明酶與底物的親和力越強，酶促反應越容易進行。本研究中，重組膽鹽水解酶對甘氨脫氧膽酸鈉的K_m值為2.5mM，說明該酶對甘氨脫氧膽酸鈉具有一定的親和力，能夠有效地催化其水解反應。與其他來源的膽鹽水解酶相比，該K_m值處于一定的范圍內，不同來源的膽鹽水解酶對相同底物的K_m值可能存在差異，這與酶的結構、氨基酸組成以及催化機制等因素有關。某些乳酸菌來源的膽鹽水解酶對甘氨脫氧膽酸鈉的K_m值在1-5mM之間，本研究中重組膽鹽水解酶的K_m值處于該范圍的中間位置，表明其對底物的親和力處于中等水平。最大反應速率V_{max}則反映了酶在飽和底物濃度下的催化能力，即酶分子在單位時間內能夠催化底物轉化為產物的最大量。本研究中，重組膽鹽水解酶的V_{max}為50μmol/min/mg，說明在底物濃度足夠高的情況下，該酶具有較高的催化效率，能夠快速地將底物水解為產物。與其他已報道的膽鹽水解酶的V_{max}值進行比較，也可以評估本研究中重組膽鹽水解酶的催化活性水平。某些雙歧桿菌來源的膽鹽水解酶對甘氨脫氧膽酸鈉的V_{max}值為30-80μmol/min/mg，本研究中重組膽鹽水解酶的V_{max}值處于該范圍的中間偏下位置，說明其催化活性在同類酶中處于中等水平，但仍具有一定的應用潛力。通過測定動力學參數，不僅可以深入了解重組膽鹽水解酶的催化特性，還可以為其在實際應用中的優(yōu)化和調控提供理論依據。在工業(yè)生產中，根據K_m值可以合理調整底物濃度，以提高酶的催化效率；根據V_{max}值可以評估酶的生產能力，為生產工藝的設計提供參考。動力學參數的測定也有助于進一步研究酶的催化機制，為酶的分子改造和性能優(yōu)化提供基礎數據。六、結論與展望6.1研究總結本研究通過對多種樣品進行篩選，成功從發(fā)酵食品、動物腸道內容物以及土壤等樣品中分離出了多株乳酸菌。經過瓊脂平板試驗和酶活性測定法相結合的篩選方法，從眾多乳酸菌中篩選出了12株具有較高膽鹽水解酶活性的乳酸菌菌株。通過形態(tài)學鑒定、生理生化鑒定以及16SrRNA基因序列分析，確定了這12株乳酸菌的種類，其中包括5株植物乳桿菌、3株嗜酸乳桿菌、2株干酪乳桿菌、1株乳酸乳球菌乳酸亞種和1株戊糖片球菌。對篩選鑒定得到的乳酸菌菌株的膽鹽水解酶基因進行克隆，并構建了重組表達載體pET-28a-bsh，將其轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中進行誘導表達。通過優(yōu)化誘導條件，確定