TSDSCA 0001-2024 人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞制備與質(zhì)量控制

ICS07.080CCSC44

SDSCA團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/SDSCA0001—2024人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞制備與質(zhì)量控制Preparationandqualitycontrolofhumanumbilicalcordtissuederivedmesenchymalstemcells（報(bào)批稿）2024-11-29發(fā)布 2024-11-29實(shí)施山東省干細(xì)胞學(xué)會(huì)??發(fā)布T/SDSCA0001T/SDSCA0001—2024PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前言 II范圍 3規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 3基本要求 3場(chǎng)地要求 3物料、設(shè)備和儀器 4人員管理 4制備過程 4樣本采集 4樣本運(yùn)輸 5分離與培養(yǎng) 5凍存與復(fù)蘇 5關(guān)鍵質(zhì)量控制 6記錄 6附錄A（規(guī)范性）細(xì)胞存活率檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)法 8附錄B（規(guī)范性）細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)流式細(xì)胞法 10附錄C（規(guī)范性）成骨分化檢測(cè)茜素紅S染色法 11附錄D（規(guī)范性）成脂分化檢測(cè)油紅O染色法 12附錄E（規(guī)范性）成軟骨分化檢測(cè)阿爾新藍(lán)染色法 13參考文獻(xiàn) 14前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由山東博森醫(yī)學(xué)工程技術(shù)有限公司提出。本文件由山東省干細(xì)胞學(xué)會(huì)歸口。本文件主要起草人：陳義、孫明輝、滕藤、唐東起、程雷、單風(fēng)平、葛汝村、劉瑜。T/SDSCA0001T/SDSCA0001—2024PAGEPAGE10人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞制備與質(zhì)量控制范圍本文件適用于人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的生產(chǎn)和檢測(cè)。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB50591潔凈室施工及驗(yàn)收規(guī)范GB/T6682中華人民共和國(guó)藥典術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞Mesenchymalstemcellsderivedfromhumanumbilicalcordtissue（紡錘形和梭形、可在體外自我更新并具有成骨、成脂、成軟骨等分化能力的干細(xì)胞。潔凈操作區(qū)Cleanoperatingarea基本要求場(chǎng)地要求人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室或廠房應(yīng)由具有潔凈實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)資質(zhì)的工程GB50591測(cè)并出具合格證明。物料、設(shè)備和儀器物料T/CSCB0001《干細(xì)胞通用要求》的原GMP設(shè)備和儀器人員管理HBsAg和針對(duì)HAV、HCV、HIV及梅毒的抗體及必要的微生物篩查，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。制備過程樣本采集樣本采集與處理應(yīng)符合GB/T37864的要求。采集和處理程序可供樣本采集人員使用。應(yīng)具備相關(guān)的資質(zhì)和設(shè)施環(huán)境。應(yīng)符合國(guó)內(nèi)認(rèn)可的倫理和當(dāng)?shù)氐姆煞ㄒ?guī)。應(yīng)建立適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量管理體系確保符合用戶需求并持續(xù)改進(jìn)。供者要求對(duì)供者（新分娩產(chǎn)婦）的一般信息、既往病史、家族史等進(jìn)行資料采集，要求供者無家族遺傳病、（采集場(chǎng)所及人員采集場(chǎng)所應(yīng)達(dá)到II級(jí)潔凈手術(shù)室要求。采集人員應(yīng)經(jīng)過相應(yīng)的技術(shù)培訓(xùn)。采集過程臍帶標(biāo)本采集嚴(yán)格按照國(guó)家執(zhí)業(yè)醫(yī)師實(shí)踐技能規(guī)范化標(biāo)本進(jìn)行操作，采集的器具應(yīng)保證無菌。2℃～8℃冰箱保存，并聯(lián)系運(yùn)輸人員及時(shí)運(yùn)輸至細(xì)胞制備中心或細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)室。樣本運(yùn)輸2℃～8℃，在運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室前確保其處于有效運(yùn)行狀態(tài)。運(yùn)輸過程中應(yīng)防滲漏、防輻射、抗震動(dòng)、耐壓、耐熱等，樣本包裝應(yīng)貼上唯一標(biāo)識(shí)碼，且應(yīng)標(biāo)明樣本的基本信息，至少包括采集日期、采集人等信息。分離與培養(yǎng)480%～90%可進(jìn)行傳代操作。傳代操作一般采用酶消化法將貼壁細(xì)胞消化吹散，再用終止劑終止消化，離心后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再根據(jù)密度傳代。分離與培養(yǎng)過程中應(yīng)標(biāo)識(shí)細(xì)胞的名稱、代次、批次、操作日期、操作人員姓名等信息。操作過程應(yīng)嚴(yán)格控制細(xì)胞質(zhì)量，確保無外源因子污染。凍存與復(fù)蘇凍存與復(fù)蘇過程應(yīng)嚴(yán)格按照相應(yīng)的操作規(guī)程操作，嚴(yán)格控制細(xì)胞質(zhì)量，確保無外源因子污染。凍存過程宜遵循梯度或程序降溫原則。復(fù)蘇過程應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的使用目的進(jìn)行冷凍保護(hù)液的洗滌。凍存復(fù)蘇過程中應(yīng)標(biāo)識(shí)細(xì)胞的名稱、代次、批次、操作日期、操作人員姓名等信息。關(guān)鍵質(zhì)量控制細(xì)胞形態(tài)人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞形態(tài)應(yīng)呈紡錘形和梭形的成纖維細(xì)胞樣。無菌檢測(cè)按照《中華人民共和國(guó)藥典》中1101無菌檢測(cè)法執(zhí)行，細(xì)菌和真菌檢測(cè)結(jié)果都應(yīng)為陰性。支原體檢測(cè)按照《中華人民共和國(guó)藥典》3301支原體檢查法執(zhí)行，支原體檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。細(xì)胞存活率按照附錄A的方法檢測(cè)，未凍存細(xì)胞存活率應(yīng)大于或等于90%。內(nèi)外源致病因子ELISA檢測(cè)法，HBsAgHCV抗體、TP抗體、CMV-IgM抗體、HPV抗體、HHV抗體、EBV抗體檢測(cè)應(yīng)為陰性；采用核酸檢測(cè)法，HBVHIV病毒核酸檢測(cè)應(yīng)為陰性。表面標(biāo)記物按照附錄BCD73CD90陽性率均應(yīng)大于或等于95%;CD11bCD19CD31CD34、CD45、HLA-DR陽性率均應(yīng)小于或等于2%。多向分化潛能成骨分化按照附錄C的方法檢測(cè)，人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)具有成骨分化潛能。成脂分化按照附錄D的方法檢測(cè)，人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)具有成脂分化潛能。成軟骨分化按照附錄E的方法檢測(cè)，人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)具有成軟骨分化潛能。記錄原始記錄應(yīng)確保其可追溯細(xì)胞分離、處理和儲(chǔ)存操作所有環(huán)節(jié)，記錄內(nèi)容包含但不限于以下信息：供者唯一身份辨識(shí)符，如果適用；產(chǎn)品描述碼、采集類型和分類碼；產(chǎn)品名稱和組分；采集日期和時(shí)間；生產(chǎn)制備機(jī)構(gòu)的名稱和地址；制備過程中關(guān)鍵步驟的細(xì)節(jié)及結(jié)果；關(guān)鍵步驟的日期和時(shí)間，如果適用；每一步驟的操作人員姓名及復(fù)核人；在分離、處理、制備過程中使用的關(guān)鍵物料的名稱、生產(chǎn)商、批號(hào)、有效期限；使用試劑的數(shù)量；使用設(shè)備編碼。儀器和設(shè)備明視場(chǎng)顯微鏡。血球計(jì)數(shù)板。試劑

附 錄 A（規(guī)范性）細(xì)胞存活率檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)法除特別說明外，所用試劑均為分析純，檢測(cè)用水均為18.2MΩ·cm（電阻率單位）去離子水。磷酸鹽緩沖液：pH7.4。臺(tái)盼藍(lán)染液：使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(A.2.10.4%(質(zhì)量濃度)。檢測(cè)步驟細(xì)胞懸液制備收集待檢測(cè)細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(A.2.1)配制細(xì)胞懸液，稀釋至合適的濃度。每個(gè)血球計(jì)數(shù)板(A.1.21mm220～50200細(xì)胞染色按1:1的體積比將臺(tái)盼藍(lán)染液(A.2.2)與細(xì)胞懸液(A.3.1)混合均勻。細(xì)胞計(jì)數(shù)將蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)板(A.1.2)10μL(A.3.210μL對(duì)16×25規(guī)格的計(jì)數(shù)室，按對(duì)角線位，取左上、右上、左下、右下4個(gè)1mm2的中格(即100個(gè)小25×16580按照步驟A.3.2～A.3.3再重復(fù)測(cè)定一個(gè)樣品。細(xì)胞存活率計(jì)算X???=?×100%式中：X——細(xì)胞存活率；M——細(xì)胞總數(shù)；S——染色的細(xì)胞數(shù)。計(jì)算兩次計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率結(jié)果的平均值，記為細(xì)胞平均存活率。精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的10%。儀器和設(shè)備流式細(xì)胞儀。水平離心機(jī)。電子天平。

附 錄 B（規(guī)范性）細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)流式細(xì)胞法本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。牛血清白蛋白(BSA):純度≥98%。疊氮鈉(NaN?)?？谷薈D105CD73CD90CD11bCD19CD31CD34CD45HLA-DR抗體及同型對(duì)照抗體。按照相應(yīng)要求使用電子天平(B.1.3)配制流式檢測(cè)所需的液體：洗滌液、抗體稀釋液。樣品保存洗滌液和標(biāo)記后的樣品于2～8℃保存。相關(guān)抗體遵照說明書保存。檢測(cè)步驟樣品準(zhǔn)備收集細(xì)胞，使用水平離心機(jī)(B.1.2)300g離心4min,棄上清。然后用洗滌液清洗一遍，使用水平離心機(jī)(B.1.2)300g離心4min,棄上清?？贵w孵育按照抗體說明書進(jìn)行稀釋使用。抗體孵育結(jié)束后用洗滌液清洗兩遍，使用水平離心機(jī)(B.1.2)300g離心4min,棄上清。過濾上機(jī)用洗滌液重懸細(xì)胞，然后通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀(B.1.1)應(yīng)用手冊(cè)上機(jī)檢測(cè)。圈門設(shè)定原則首先根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1,排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，然后根據(jù)Isotype對(duì)照組熒光強(qiáng)度，在分群1的基礎(chǔ)上畫出陽性細(xì)胞群2,排除沒有被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞。抗體Isotype作為陰性對(duì)照。結(jié)果分析得到的檢測(cè)結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。儀器和設(shè)備血球計(jì)數(shù)板。明視場(chǎng)顯微鏡。水平離心機(jī)。

附 錄 C（規(guī)范性）成骨分化檢測(cè)茜素紅S染色法本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。消化酶。臺(tái)盼藍(lán)染液：使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(C.2.1)稀釋至0.4%(質(zhì)量濃度)。成骨誘導(dǎo)液。茜素紅S染色試劑盒。檢測(cè)步驟細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備細(xì)胞消化使用水平離心機(jī)(C.1.3)離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團(tuán)塊。細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)附錄A方法測(cè)定，使用血球計(jì)數(shù)板(C.1.1)及明視場(chǎng)顯微鏡(C.1.2)計(jì)算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。細(xì)胞接種并誘導(dǎo)細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成骨誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書。誘導(dǎo)14d～21d。鈣結(jié)節(jié)染色鈣結(jié)節(jié)染色根據(jù)茜素紅S染色試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果分析顯微鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。附 錄 D（規(guī)范性）成脂分化檢測(cè)油紅O染色法儀器和設(shè)備血球計(jì)數(shù)板。明視場(chǎng)顯微鏡。水平離心機(jī)。試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。磷酸鹽緩沖液：pH7.4。消化酶。臺(tái)盼藍(lán)染液：使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(D.2.1)0.4%(質(zhì)量濃度)。成脂誘導(dǎo)液。O染色試劑盒。檢測(cè)步驟細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備細(xì)胞消化使用水平離心機(jī)(D.1.3)離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團(tuán)塊。細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)附錄A方法測(cè)定，使用血球計(jì)數(shù)板(D.1.1)及明視場(chǎng)顯微鏡(D.1.2)計(jì)算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。細(xì)胞接種并誘導(dǎo)細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成脂誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14d～21d。脂滴染色脂滴染色根據(jù)油紅O染色試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果分析顯微鏡下可見橙紅色的脂滴，脂肪細(xì)胞中含大小不等的脂滴。附 錄 E（規(guī)范性）成軟骨分化檢測(cè)阿爾新藍(lán)染色法儀器和設(shè)備血球計(jì)數(shù)板。明視場(chǎng)顯微鏡。水平離心機(jī)。試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。消化酶。臺(tái)盼藍(lán)染液：使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(E.2.1)稀釋至0.4%(質(zhì)量濃度)。成軟骨誘導(dǎo)液。阿爾新藍(lán)染色試劑盒。檢測(cè)步驟細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備細(xì)胞消化使用水平離心機(jī)(E.1.3)離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團(tuán)塊。細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)附錄A方法測(cè)定，使用血球計(jì)數(shù)板(E.1.1)及明視場(chǎng)顯微鏡(E.1.2)計(jì)算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。細(xì)胞接種并誘導(dǎo)細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成軟骨誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書。誘導(dǎo)14d～21d。軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)染色軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)染色根據(jù)阿爾新藍(lán)試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果分析顯微鏡下可見深藍(lán)色的軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)。參 考 文 獻(xiàn)DB22/T3574-2023間充質(zhì)干細(xì)胞儲(chǔ)存服務(wù)規(guī)范SZTT/SSCT002-2018臨床研究用人臍帶來源間