2024-2025學(xué)年高二生物人教版選擇性必修3教學(xué)課件 第3章 第2節(jié) 第1課時(shí) 目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

第1課時(shí)目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建第3章基因工程人教版高中生物選擇性必修3第2節(jié)基因工程的基本操作程序

學(xué)習(xí)目標(biāo)1.闡明PCR的原理，說出PCR反應(yīng)所需的條件和PCR反應(yīng)的過程。2.說出基因表達(dá)載體的組成。

情境導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因抗蟲棉1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定

目的基因的篩選與獲取一基因表達(dá)載體的構(gòu)建二目錄一

目的基因的篩選與獲取一1.目的基因在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因。培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的Bt抗蟲蛋白基因，簡(jiǎn)稱Bt基因。蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生Bt基因伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)表達(dá)破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)殺死棉鈴蟲導(dǎo)入抗蟲棉培育棉花細(xì)胞1概念：2實(shí)例：主要是編碼特定蛋白質(zhì)的基因，也可以是具有調(diào)控作用的因子（1）從相關(guān)已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。（2）利用序列數(shù)據(jù)庫和序列比對(duì)工具進(jìn)行篩選。蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)掌握了Bt基因的序列信息Bt蛋白分解為多肽后，與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，造成害蟲死亡。Bt蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才表現(xiàn)出毒性，人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體。一

目的基因的篩選與獲取一

2.篩選合適的目的基因方法：前提：方法：基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成DNA合成儀

蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成一

目的基因的篩選與獲取一

3.獲取目的基因的方法1人工合成目的基因2通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因3常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項(xiàng)在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。DNA半保留復(fù)制穆里斯解旋合成子鏈復(fù)旋一

目的基因的篩選與獲取一4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因1概念：2原理：耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）四種脫氧核苷三磷酸（dNTP））DNA模板引物穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）PCR儀3基本條件：4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因引物4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20-30個(gè)核苷酸。用于四種脫氧核苷三磷酸（dNTP））耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）四種脫氧核苷三磷酸（dNTP））DNA模板引物穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）PCR儀3基本條件：4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因四種脫氧核苷三磷酸（dNTP））4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因ATCGP

~

P

~

P脫氧核糖含氮堿基磷酐鍵脫氧核苷酸dNTP是脫氧核苷三磷酸的縮寫，N是指A、T、G、C四種含氮堿基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它們是由兩個(gè)磷酸分子和一個(gè)脫氧核苷酸組成的，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式如下：一定量的模板DNA引物4中脫氧核苷酸dNTP緩沖液熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）Mg2+作為DNA復(fù)制的模板使DNA聚合酶能從引物3′端開始連接脫氧核苷酸作為合成DNA子鏈的原料提供相對(duì)穩(wěn)定的pH環(huán)境催化合成DNA子鏈真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3基本條件：當(dāng)溫度超過90℃時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。變性延伸復(fù)性4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因4PCR反應(yīng)過程：由于一個(gè)循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式擴(kuò)增（約為

，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。指數(shù)2n常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。變性90℃以上延伸72℃左右復(fù)性50℃左右基本過程4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因5PCR的結(jié)果：6PCR產(chǎn)物的鑒定：PCR擴(kuò)增技術(shù)任務(wù)一圖1、圖2分別是PCR擴(kuò)增技術(shù)相關(guān)過程，請(qǐng)思考回答下列問題：1．PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？并說明理由。不是完整的模板DNA分子；PCR擴(kuò)增的僅僅是兩種引物之間所對(duì)應(yīng)的特定DNA片段。PCR擴(kuò)增技術(shù)任務(wù)一2.圖1所示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段？比例是多少？5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’第3輪；1/4。PCR擴(kuò)增技術(shù)任務(wù)一4．圖2是某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)，都不合理，請(qǐng)分別說明理由。第1組：

；第2組：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ會(huì)因局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)因出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效3．如果已知某目的基因的序列和結(jié)構(gòu)，利用PCR篩選和擴(kuò)增出該目的基因的關(guān)鍵是什么？根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。PCR擴(kuò)增技術(shù)任務(wù)一5．要保證目的基因能與載體相連接，還要對(duì)引物進(jìn)行什么操作？要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識(shí)別序列。6．如果循環(huán)n次，則共需消耗多少對(duì)引物？共需消耗2n－1對(duì)引物。5’5’3’3’5’5’3’3’第1次5’5’5’5’3’3’3’3’第2次3’3’5’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’第3次3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’5’3’3’5’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’5’5’第4次1個(gè)3個(gè)4個(gè)1個(gè)3個(gè)4個(gè)PCR擴(kuò)增技術(shù)任務(wù)一PCR擴(kuò)增技術(shù)任務(wù)一PCR擴(kuò)增技術(shù)任務(wù)一PCR中的數(shù)量關(guān)系小結(jié)復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)2482n含引物的DNA分子數(shù)2482n含其中一種引物的DNA分子數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同時(shí)含兩種引物的DNA分子數(shù)0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的對(duì)數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)0＝21－20＝22－42＝23－62n－2n跟蹤訓(xùn)練1.(2023·山西太原高二診斷)下列有關(guān)獲取目的基因的敘述，錯(cuò)誤的是

A.目的基因就是編碼蛋白質(zhì)的基因B.獲取目的基因是基因工程的第一步C.來自蘇云金桿菌的Bt抗蟲蛋白基因可作為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因D.序列比對(duì)工具的應(yīng)用為科學(xué)家找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)√目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子，A錯(cuò)誤。2.如圖表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的部分過程，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是

A.耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧

核苷酸連接到3′端B.在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條

脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段C.引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，則不能有效擴(kuò)增目的基因D.從理論上推測(cè)，第三輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段占3/4跟蹤訓(xùn)練√跟蹤訓(xùn)練由題圖可知，以原來的每條母鏈為模板經(jīng)第一輪合成的兩個(gè)DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子鏈為模板合成新DNA分子時(shí)，兩種引物都含有，故第三輪循環(huán)共產(chǎn)生8個(gè)DNA分子，其中含有引物A的DNA分子是7個(gè)，即占7/8，D錯(cuò)誤。

目的基因的篩選與獲取一基因表達(dá)載體的構(gòu)建二目錄一

基因表達(dá)載體的構(gòu)建二蘇云金桿菌中的Bt基因普通棉花細(xì)胞含Bt基因的棉花細(xì)胞能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白的棉花植株轉(zhuǎn)入植物組織培養(yǎng)技術(shù)形成使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用?；蚬こ痰暮诵墓ぷ?目的：獲取Bt基因后能不能直接將它導(dǎo)入受體細(xì)胞呢？一

基因表達(dá)載體的構(gòu)建二2組成：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)位于基因的上游；RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。位于基因的下游；終止轉(zhuǎn)錄便于重組DNA分子的篩選和鑒定。能控制表達(dá)所需要的特殊性狀分析基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的和方法任務(wù)二啟動(dòng)子下游和終止子上游。因?yàn)橹挥胁迦朐趩?dòng)子和終止子之間，目的基因才可以正常表達(dá)。2.構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)目的基因插入的位置應(yīng)該在哪里？為什么？①

用一定的限制酶切割載體，使其出現(xiàn)一個(gè)切口。②

用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③

將切下的Bt基因片段拼接到載體的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子。載體基因表達(dá)載體一

基因表達(dá)載體的構(gòu)建二3構(gòu)建過程：分析基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的和方法任務(wù)二（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因?yàn)镾maⅠ切割會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。3.請(qǐng)結(jié)合下圖，回答問題：質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進(jìn)一步篩選。分析基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的和方法任務(wù)二（2）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、

外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？3.請(qǐng)結(jié)合下圖，回答問題：①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。核心歸納1．限制酶的選擇(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。核心歸納1．限制酶的選擇(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個(gè)及以上的標(biāo)記基因，則可合理對(duì)其中一些標(biāo)記基因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比1個(gè)標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有1個(gè)標(biāo)記基因時(shí)出現(xiàn)的“假陽性”(即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表達(dá)標(biāo)記基因，造成無效篩選)。核心歸納1．限制酶的選擇(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點(diǎn)時(shí)，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點(diǎn)的兩種不同的限制酶，對(duì)目的基因所在序列和載體進(jìn)行剪切，即“雙酶切法”。其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體反向連接，即DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動(dòng)子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動(dòng)方向”)必須是相同的。否則目的基因?qū)牒鬅o法正常轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。核心歸納1．限制酶的選擇(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當(dāng)不適合選擇某種限制酶時(shí)，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。核心歸納2.區(qū)分啟動(dòng)子和終止子與起始密碼子和終止密碼子名稱啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰堿基mRNA上三個(gè)相鄰堿基位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號(hào)決定翻譯過程的結(jié)束拓展延伸啟動(dòng)子的類型根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式，可分為：①組成型啟動(dòng)子

能夠調(diào)控基因的表達(dá)，使其基本恒定在一定程度上，從而使基因在不同部位或組織中的表達(dá)水平不存在明顯差異。這類啟動(dòng)子一般來自管家基因，可連續(xù)不斷地啟動(dòng)基因的表達(dá)。②組織特異性啟動(dòng)子

其調(diào)控作用使得基因往往只在某些特定器官或組織中表達(dá)，且表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。其最大的優(yōu)勢(shì)是其啟動(dòng)的外源基因在受體中僅在需要的部位特異表達(dá)，克服了組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的外源基因在受體植物中非特異、持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)，增加了轉(zhuǎn)基因的效果。③誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。跟蹤訓(xùn)練√3.(2023·新課標(biāo)，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是

A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli

DNA

連接酶連接B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用

T4DNA連接酶連接C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用

T4DNA連接酶連接D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接4.(2023·湖北，4改編)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是

A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，

不一定含有目的基因C.若用ScaⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Tet(四環(huán)素)的培養(yǎng)基中能形成菌落D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中

能形成菌落跟蹤訓(xùn)練√課堂小結(jié)五分鐘查落實(shí)【要語必背】1.目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，如與生物抗逆性、生產(chǎn)藥物、毒物降解、工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。2.PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。3.PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖液中進(jìn)行，需提供DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。4.基因工程操作程序的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建?！鹃L(zhǎng)句表達(dá)】1.

。因此，PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段________________________________

。2.耐高溫的DNA聚合酶的作用是

。3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的是：___________________________________