干細(xì)胞中長(zhǎng)鏈非編碼RNA的研究綜述

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隨著人類基因組計(jì)劃的不斷推進(jìn)，人們發(fā)現(xiàn)90%以上的基因組DNA能轉(zhuǎn)錄成RNA,而其中不足2%編碼蛋白質(zhì)[1-2],其余不能編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被稱為非編碼RNA（non-codingRNAs,ncRNAs）[3].根據(jù)長(zhǎng)度不同，ncRNAs可以分為短鏈ncRNAs和長(zhǎng)鏈ncRNAs（longncRNAs,LncRNAs）.

LncRNAs缺乏特異完整的開放閱讀框，幾乎不具有蛋白編碼功能。近年來有研究報(bào)道LncRNA參與干細(xì)胞多種生物學(xué)特性的調(diào)控[4].現(xiàn)將對(duì)LncRNAs在干細(xì)胞中的研究進(jìn)展予以綜述，重點(diǎn)剖析LncRNAs與干細(xì)胞自我更新和多向分化之間的關(guān)聯(lián)。

1LncRNAs的概念。

LncRNAs是一類長(zhǎng)度通常大于200個(gè)核苷酸，缺少特異完整的開放閱讀框，不具有或幾乎不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA,在總ncRNAs中占有相當(dāng)大的比例。LncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”,因其數(shù)量、種類、功能狀況均不明確，且尚缺乏有效的研究手段，故又被稱作基因組中的“暗物質(zhì)”[5].盡管這些RNA不能編碼蛋白質(zhì)，卻能在基因表達(dá)的多個(gè)環(huán)節(jié)（包括表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）發(fā)揮調(diào)控作用。

2LncRNAs的結(jié)構(gòu)、分類和功能。

LncRNAs與mRNA相似，經(jīng)過剪切，具有多聚腺苷酸（polyA）尾和啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。LncRNAs具有較低的進(jìn)化保守性，其在細(xì)胞中的表達(dá)水平也明顯低于編碼蛋白的RNAs.大約2/3的LncRNAs來源于基因之間的廣大基因組區(qū)域，其余的則來源于與編碼蛋白的基因重疊、反義或基因內(nèi)區(qū)域。根據(jù)與編碼蛋白基因的位置關(guān)系，LncRNAs大致分為正義（sense）、反義（anti-sense）、雙向（bidirectional）、基因內(nèi)（intronic）和基因間（intergenic）5種類型[6].通過在不同組織和細(xì)胞中進(jìn)行高通量的RNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)LncRNAs的表達(dá)還具有明顯的組織和細(xì)胞特異性[7-13].近年來大量研究表明，LncRNAs與許多細(xì)胞學(xué)功能有著密切的聯(lián)系[14-17].如LncRNA可以作為短鏈ncRNAs的前體，形成微RNA以及內(nèi)源小干擾RNA,還可以作為微RNA“分子海綿”,對(duì)有活性的微RNA產(chǎn)生長(zhǎng)效的抑制作用[15];在細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)以及蛋白復(fù)合物的形成過程中LncRNA發(fā)揮“腳手架”的作用[16],可以將兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白分子“綁和”形成復(fù)合物。簡(jiǎn)言之，LncRNAs可以通過與ncRNAs,mRNA,基因組DNA以及多種蛋白質(zhì)相互作用在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯水平以及表觀遺傳等多個(gè)層面影響細(xì)胞的生命活動(dòng)。

3LncRNAs與干細(xì)胞。

干細(xì)胞是一類能夠自我更新并具有多向分化潛能的細(xì)胞。在一定條件下，它們能夠分化成多種成熟的功能細(xì)胞。近年來關(guān)于LncRNAs在干細(xì)胞中的研究層出不窮。

3.1LncRNA與胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells,ESCs）ESCs通常是由早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（如桑葚胚，囊胚）或原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)篩選出的一類多能干細(xì)胞，在體外具有無限增殖、自我更新和多向分化的能力。最近研究已經(jīng)證實(shí)LncRNAs在維持人類ESCs自我更新能力和多能性方面具有重要作用[17].

Guttman等[14]最先對(duì)基因間的長(zhǎng)鏈ncRNAs（largeinter-genicnon-codingRNA,LincRNAs）在ESCs中的表達(dá)和功能做了一系列研究，RNA測(cè)序結(jié)果顯示有226條LincRNAs在鼠ESCs中顯著高表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的LincRNA（約93%）對(duì)ESCs中的基因表達(dá)有明顯的調(diào)控作用，有26條LincRNAs能夠顯著影響多能性調(diào)控因子Nanog的表達(dá)水平，表明LincRNAs在維持干細(xì)胞多能性以及抑制細(xì)胞分化中起到重要作用。他們還發(fā)現(xiàn)，有13條LincRNAs與ESCs內(nèi)胚層的分化有關(guān)，7條與外胚層的分化有關(guān)，5條與神經(jīng)外胚層分化相關(guān)，7條與中胚層的分化相關(guān)，2條與滋養(yǎng)外胚層的分化相關(guān)。這說明LincRNA在ESCs的種系特異性分化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。隨后他們還研究了ESCs中的LincRNA是否受到多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Oct4,Sox2,Nanog,cMyc,nMyc,KLF4,ZFX,SmadandTCF30）的調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有75%的LincRNA的啟動(dòng)子區(qū)域能與至少一條多能性轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，說明這些LincRNAs是多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的作用靶點(diǎn)。此外還發(fā)現(xiàn)有74條（30%）的LincRNAs與ESCs中重要的染色質(zhì)修飾蛋白密切相關(guān)。

Dinger等[18]在鼠ESCs中發(fā)現(xiàn)了12條LncRNAs與轉(zhuǎn)錄因子Pou5f1、Nanog、Sox2的表達(dá)譜相似，這些轉(zhuǎn)錄因子在維持ESCs多能性狀態(tài)中具有重要作用。隨后運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）以及抗-Pou5f1和抗-Nanog抗體進(jìn)一步證實(shí)了這些LncRNAs確實(shí)與Pou5f1和Nanog相結(jié)合[19].

Ng等[20]也發(fā)現(xiàn)了36條LncRNAs的表達(dá)譜與Oct4和Nanog相似，而Oct4和Nanog在ESCs中普遍高表達(dá)且在分化成熟的細(xì)胞中表達(dá)降低。LncRNAs表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，在人類ESCs和神經(jīng)前體細(xì)胞中有934條LncRNAs的表達(dá)有明顯差異，其中有36條LncRNAs在神經(jīng)前體細(xì)胞中顯著下調(diào)。

隨后他們挑選了3條LncRNAs（ES1,ES2,ES3）做進(jìn)一步的功能性研究，發(fā)現(xiàn)這3條LncRNA中任意一條被沉默以后，均會(huì)促使ESCs分化。RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞核內(nèi)ES1和ES2與多梳基因家族成員SUZ12以及多能性調(diào)控因子SOX2密切相關(guān)。

SheikMohamed等[21]通過免疫沉淀反應(yīng)，找到了一組與Oct4和Nanog結(jié)合的LncRNAs,并對(duì)這些RNAs做了后續(xù)的測(cè)序?qū)嶒?yàn)，隨后干擾了這些LncRNAs的表達(dá)并觀察了ESCs分化活動(dòng)的變化，結(jié)果提示，有部分與Oct4和Nanog結(jié)合的LncRNAs具有調(diào)控Oct4和Nanog的作用。這些研究表明，E