巨噬細胞在新城疫病毒感染中的防御角色與機制解析

一、引言1.1研究背景新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的烈性病原之一。自1926年首次被報道以來，NDV已引發(fā)了四次全球大流行，每次大流行均由不同基因型的病毒所導致。作為副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬的成員，NDV能夠感染多種禽類，包括雞、鴨、鵝、鴿子等，其傳播途徑廣泛，可通過呼吸道、消化道以及接觸感染等方式在禽群中迅速傳播。NDV感染家禽后，會引發(fā)一系列嚴重的臨床癥狀，如呼吸困難、腹瀉、神經(jīng)癥狀以及產(chǎn)蛋量下降等，導致家禽生長發(fā)育受阻、免疫力降低，甚至大量死亡，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)統(tǒng)計，在一些疫情嚴重的地區(qū)，家禽的發(fā)病率和死亡率可高達90%以上，不僅使養(yǎng)殖戶的收入大幅減少，還對整個家禽產(chǎn)業(yè)鏈造成了嚴重沖擊，影響了肉類供應和相關(guān)產(chǎn)品的市場價格穩(wěn)定。例如，2023年巴西一家養(yǎng)雞場爆發(fā)雞新城疫疫情，導致其所有雞只被屠宰后銷毀，并令市場擔心該國禽肉產(chǎn)品出口將受到禁令影響，該國禽類生產(chǎn)商股價因而在周四暴跌。此外，由于防控措施的實施，如撲殺感染禽群、封鎖疫區(qū)等，也會產(chǎn)生額外的經(jīng)濟成本，進一步加重了行業(yè)的負擔。巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，在機體抵御病毒感染的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。巨噬細胞起源于骨髓中的造血干細胞，經(jīng)過單核細胞階段后，遷移到不同的組織中分化成熟。它們廣泛分布于機體的各個組織和器官，如肺、肝、脾、淋巴結(jié)等，是機體先天免疫的重要防線。巨噬細胞具有多種生物學功能，其中吞噬作用是其重要的防御機制之一。巨噬細胞能夠通過表面的模式識別受體（Patternrecognitionreceptors，PRRs）識別并結(jié)合病毒等病原體，隨后通過內(nèi)吞作用將病原體吞入細胞內(nèi)，形成吞噬體。吞噬體與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，利用其中的酶和活性氧中間體等物質(zhì)分解消化病原體，從而清除病毒感染。巨噬細胞還能分泌多種細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白細胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等，這些細胞因子和趨化因子能夠調(diào)節(jié)免疫細胞的活化、增殖和遷移，招募其他免疫細胞如T細胞、B細胞、中性粒細胞等聚集到感染部位，協(xié)同發(fā)揮抗病毒作用，同時也參與了炎癥反應的調(diào)節(jié)，有助于控制病毒感染的擴散。此外，巨噬細胞還具有抗原呈遞功能，能夠?qū)⑻幚砗蟮目乖畔⒊蔬f給T淋巴細胞，激活適應性免疫反應，使機體產(chǎn)生特異性的抗體和細胞免疫應答，進一步增強對病毒的清除能力。盡管巨噬細胞在免疫系統(tǒng)中具有重要地位，然而其在抵御NDV感染中的具體作用及機制尚未完全明確。深入研究巨噬細胞抵御NDV感染的作用及機制，不僅有助于我們進一步理解機體與病毒之間的相互作用關(guān)系，揭示病毒感染的致病機制，還能夠為開發(fā)新型的防控策略和治療方法提供理論依據(jù)。通過了解巨噬細胞在識別、吞噬和清除NDV過程中的分子機制，以及其分泌的細胞因子和趨化因子對免疫反應的調(diào)節(jié)作用，我們可以尋找新的藥物靶點，研發(fā)更有效的抗病毒藥物，或者通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能來增強機體的免疫力，提高家禽對NDV感染的抵抗力，從而減少NDV對家禽養(yǎng)殖業(yè)的危害，保障家禽產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究巨噬細胞在抵御新城疫病毒感染過程中的作用及分子機制，為進一步理解機體抗病毒免疫過程提供理論依據(jù)，為新城疫的防控提供新思路和新策略。巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機體抵御病毒感染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，然而其在應對新城疫病毒感染時的具體機制尚未完全明晰。本研究將通過一系列實驗，深入剖析巨噬細胞對新城疫病毒的識別、吞噬、殺傷以及免疫調(diào)節(jié)等作用機制，包括研究巨噬細胞表面的模式識別受體如何識別新城疫病毒的病原體相關(guān)分子模式，以及在識別后如何激活下游信號通路，啟動免疫應答；探究巨噬細胞在吞噬新城疫病毒后，如何通過溶酶體途徑降解病毒，以及該過程中相關(guān)酶和活性氧中間體的作用；分析巨噬細胞在感染新城疫病毒后分泌的細胞因子和趨化因子種類及變化規(guī)律，明確它們在調(diào)節(jié)免疫細胞活化、增殖和遷移中的作用。研究巨噬細胞抵御新城疫病毒感染的作用及機制具有重要的理論意義。從病毒學角度來看，有助于深入理解新城疫病毒的致病機制，揭示病毒與宿主細胞之間的相互作用關(guān)系，為進一步研究病毒的感染、復制和傳播提供基礎(chǔ)；從免疫學角度而言，能夠豐富我們對機體先天免疫和適應性免疫應答過程的認識，尤其是巨噬細胞在其中的橋梁作用，為免疫學理論的發(fā)展提供新的依據(jù)。在實際應用方面，本研究成果具有顯著的現(xiàn)實意義。對于家禽養(yǎng)殖業(yè)來說，新城疫的防控一直是行業(yè)面臨的重要挑戰(zhàn)。通過明確巨噬細胞的抗病毒機制，可以為開發(fā)新型的疫苗和藥物提供理論指導，例如基于巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)機制，研發(fā)能夠增強巨噬細胞抗病毒活性的免疫調(diào)節(jié)劑，或者設(shè)計針對新城疫病毒感染巨噬細胞關(guān)鍵環(huán)節(jié)的抗病毒藥物，提高家禽對新城疫病毒的抵抗力，減少疫情的發(fā)生和傳播，降低經(jīng)濟損失。此外，研究成果還可為制定科學合理的疫病防控策略提供依據(jù)，如優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境、加強生物安全措施等，以減少病毒感染的機會，保障家禽產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀國內(nèi)外學者針對新城疫病毒和巨噬細胞的相互作用展開了大量研究，在病毒感染機制、巨噬細胞的免疫應答以及二者相互作用的分子機制等方面取得了一定進展。在新城疫病毒感染機制的研究中，國外學者率先明確了病毒通過呼吸道和消化道侵入禽類機體，借助其表面的血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）蛋白與宿主細胞表面的唾液酸受體結(jié)合，隨后融合蛋白（F）介導病毒與細胞膜融合，從而實現(xiàn)病毒基因組的進入。國內(nèi)研究在此基礎(chǔ)上，進一步揭示了不同基因型新城疫病毒在感染特性上的差異，如基因Ⅶ型NDV相較于其他基因型，對免疫器官的侵嗜性更強，能夠引發(fā)更嚴重的炎性細胞浸潤和組織壞死。此外，國內(nèi)學者還發(fā)現(xiàn)新城疫病毒能夠利用細胞內(nèi)吞途徑入侵雞巨噬細胞，為深入理解病毒的感染機制提供了新的視角。巨噬細胞在免疫應答中的作用一直是免疫學研究的熱點。國外研究表明，巨噬細胞可通過模式識別受體（PRRs）識別病毒的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），激活下游信號通路，誘導產(chǎn)生干擾素、細胞因子等免疫活性物質(zhì)，啟動抗病毒免疫反應。國內(nèi)研究進一步闡明了巨噬細胞在識別新城疫病毒過程中，Toll樣受體（TLRs）家族成員的具體作用機制，以及相關(guān)信號通路的激活和調(diào)控過程。例如，TLR7在識別新城疫病毒的單鏈RNA中發(fā)揮關(guān)鍵作用，激活MyD88依賴的信號通路，促進細胞因子的表達。在新城疫病毒與巨噬細胞相互作用的分子機制研究方面，國外有研究發(fā)現(xiàn)，新城疫病毒感染巨噬細胞后，會干擾細胞的正常代謝和功能，抑制細胞的增殖和存活，同時誘導細胞產(chǎn)生凋亡或焦亡等程序性死亡。國內(nèi)研究則聚焦于病毒蛋白與巨噬細胞內(nèi)蛋白之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)新城疫病毒的V蛋白能夠與巨噬細胞內(nèi)的干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）結(jié)合，抑制干擾素的產(chǎn)生，從而逃避機體的免疫監(jiān)視。此外，國內(nèi)學者還通過轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學技術(shù)，全面分析了新城疫病毒感染巨噬細胞后基因和蛋白質(zhì)表達的變化，為深入研究二者相互作用的分子機制提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。盡管國內(nèi)外在新城疫病毒和巨噬細胞相互作用的研究上已取得諸多成果，但仍存在一些不足之處。一方面，對于巨噬細胞在抵御新城疫病毒感染過程中的具體作用機制，尤其是在天然免疫和適應性免疫的協(xié)同作用方面，尚未完全明確。例如，巨噬細胞在激活T細胞和B細胞，促進特異性抗體產(chǎn)生過程中的具體作用機制還需要進一步深入研究。另一方面，目前的研究大多集中在病毒感染巨噬細胞后的早期階段，對于病毒感染后期巨噬細胞的功能變化以及機體的免疫應答調(diào)控機制研究相對較少。此外，在不同品種、不同年齡禽類中，巨噬細胞對新城疫病毒的免疫應答差異也缺乏系統(tǒng)研究，這對于制定精準的防控策略具有重要意義。本研究將在前人研究的基礎(chǔ)上，以填補上述研究空白為切入點，深入探究巨噬細胞在不同感染階段抵御新城疫病毒感染的作用及分子機制，綜合運用細胞生物學、分子生物學、免疫學等多學科技術(shù)手段，從基因、蛋白和細胞水平全面解析巨噬細胞與新城疫病毒的相互作用過程，為新城疫的防控提供更堅實的理論基礎(chǔ)和更有效的策略。二、新城疫病毒與巨噬細胞概述2.1新城疫病毒特性2.1.1病毒結(jié)構(gòu)與分類新城疫病毒（NDV）屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬，是一種具有囊膜的單股負鏈RNA病毒。其病毒粒子呈現(xiàn)多形性，主要為圓形、橢圓形，也有長桿狀，成熟病毒粒子直徑在100-400納米之間。病毒粒子的最外層是包膜，由宿主細胞外膜的脂類與病毒糖蛋白結(jié)合形成雙層結(jié)構(gòu)，表面分布著長約12-15納米的刺突，這些刺突含有血凝素、神經(jīng)氨酸酶和溶血素，在病毒的感染和致病過程中發(fā)揮重要作用。血凝素能夠使病毒吸附到宿主細胞表面的唾液酸受體上，促進病毒的入侵；神經(jīng)氨酸酶則參與病毒從感染細胞的釋放過程，防止病毒粒子重新聚集。病毒的核心部分是由單股RNA分子及其周圍的蛋白質(zhì)衣殼粒組成的螺旋對稱核衣殼，直徑約18納米。核衣殼中的RNA攜帶了病毒的遺傳信息，編碼了病毒的多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，對病毒的復制、轉(zhuǎn)錄和裝配至關(guān)重要。根據(jù)病毒的致病性、抗原性和基因序列等特征，NDV可分為不同的毒株和基因型。目前，已鑒定出多個基因型，如基因Ⅰ型-基因Ⅸ型等，不同基因型的病毒在致病性、傳播特性和地理分布上存在差異。例如，基因Ⅶ型NDV在近年來的流行中較為常見，其致病性較強，能夠引起禽類嚴重的發(fā)病和死亡，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大損失。而一些弱毒株，如常用于疫苗制備的LaSota株，雖然能夠刺激機體產(chǎn)生免疫反應，但致病性較低，不會導致禽類嚴重發(fā)病。在分類學上，NDV屬于副黏病毒科，該科病毒具有一些共同的特征，如病毒粒子有包膜、基因組為單股負鏈RNA等。但NDV在宿主范圍、致病機制和抗原特性等方面又具有獨特性，使其在副黏病毒家族中成為獨立的一員，專門感染禽類，引發(fā)新城疫這一具有高度傳染性和致病性的疾病。2.1.2病毒致病機制新城疫病毒的致病過程是一個復雜的、多步驟的過程，涉及病毒對宿主細胞的入侵、復制、傳播以及對宿主免疫系統(tǒng)和組織器官的損傷。病毒主要通過呼吸道和消化道感染禽類。當病毒粒子與宿主細胞接觸時，其表面的血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）蛋白能夠識別并特異性結(jié)合宿主細胞表面的唾液酸受體，從而使病毒吸附到細胞表面。隨后，病毒的融合蛋白（F）發(fā)生構(gòu)象變化，其內(nèi)部的融合多肽釋放出來，發(fā)揮穿膜作用，介導病毒囊膜與細胞膜的融合，使病毒的核衣殼釋放到細胞內(nèi)。這一過程類似于鑰匙與鎖的匹配，HN蛋白就像一把鑰匙，準確地找到宿主細胞表面的唾液酸受體這把鎖，打開進入細胞的大門，而F蛋白則如同一個開鎖工具，幫助病毒成功進入細胞內(nèi)部。進入細胞后，病毒利用自身攜帶的RNA依賴性RNA聚合酶，以病毒的單股負鏈RNA為模板，首先轉(zhuǎn)錄合成互補的正鏈RNA。這些正鏈RNA一方面作為mRNA，利用宿主細胞的翻譯機制翻譯成病毒的各種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，如核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）和RNA聚合酶（L）等；另一方面，正鏈RNA也作為模板，合成新的病毒基因組負鏈RNA。新合成的病毒蛋白和基因組RNA在細胞內(nèi)組裝成新的病毒粒子，然后通過出芽的方式從宿主細胞中釋放出來，繼續(xù)感染周圍的細胞，導致病毒在宿主體內(nèi)的傳播和擴散。在病毒感染過程中，會對宿主的免疫系統(tǒng)和組織器官造成嚴重損傷。病毒感染免疫細胞，如巨噬細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等，會干擾這些細胞的正常功能，抑制免疫細胞的活化、增殖和免疫因子的分泌，從而削弱機體的免疫防御能力。例如，NDV感染巨噬細胞后，能夠抑制巨噬細胞表面Toll樣受體（TLRs）的表達，影響巨噬細胞對病毒的識別和免疫信號的傳遞，導致巨噬細胞分泌細胞因子和趨化因子的能力下降，無法有效地招募和激活其他免疫細胞。病毒對組織器官的損傷也十分明顯。在呼吸道，病毒感染導致氣管、支氣管等部位的上皮細胞受損，引起卡他性炎癥和出血，使氣管被滲出的粘液堵塞，造成禽類呼吸困難。在消化道，病毒感染可引起腺胃、小腸和盲腸等部位的病變，如腺胃乳頭腫脹、出血或潰瘍，十二指腸黏膜及小腸黏膜出血或潰瘍，盲腸扁桃體腫大、出血和壞死等，導致禽類消化功能紊亂，出現(xiàn)腹瀉、食欲不振等癥狀。此外，病毒還可能侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)非化膿性腦炎，導致禽類出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，如抽搐、共濟失調(diào)、頭頸扭曲等。病毒感染還會引發(fā)宿主的炎癥反應。感染部位的巨噬細胞和其他免疫細胞被激活，釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子在一定程度上有助于機體抵抗病毒感染，但如果炎癥反應過度，會導致組織器官的進一步損傷，引發(fā)全身性的病理變化，如發(fā)熱、組織水腫、器官功能衰竭等，嚴重時可導致禽類死亡。2.2巨噬細胞的功能與特點2.2.1巨噬細胞的來源與分化巨噬細胞起源于骨髓中的造血干細胞，其分化過程是一個逐步且受多種因素精細調(diào)控的過程。造血干細胞具有自我更新和多向分化的能力，在骨髓微環(huán)境中，受到一系列細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的影響，造血干細胞首先分化為髓樣干細胞。髓樣干細胞進一步分化，產(chǎn)生單核細胞前體，這些前體在骨髓中繼續(xù)發(fā)育成熟，然后進入血液循環(huán)，成為單核細胞。單核細胞在血液中循環(huán)一段時間后，會受到趨化因子等信號的吸引，遷移到不同的組織和器官中。在組織微環(huán)境的作用下，單核細胞逐漸分化為具有不同功能和表型的巨噬細胞。例如，在肺部，單核細胞分化為肺泡巨噬細胞，它們定居在肺泡表面，能夠有效清除吸入的病原體和顆粒物質(zhì)，維持肺部的清潔和免疫平衡。在肝臟中，單核細胞分化為庫普弗細胞，這些細胞位于肝血竇內(nèi)，不僅可以吞噬細菌、病毒等病原體，還參與了肝臟的免疫監(jiān)視和代謝調(diào)節(jié)，如對衰老紅細胞的清除以及對脂肪代謝的調(diào)節(jié)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，單核細胞則分化為小膠質(zhì)細胞，小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞，在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)保護以及神經(jīng)炎癥反應中發(fā)揮著重要作用，當神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或感染時，小膠質(zhì)細胞能夠迅速激活，清除病原體和受損細胞碎片。巨噬細胞在不同組織中的分布具有特異性，這與其功能密切相關(guān)。在富含血管和免疫活性較高的組織，如脾臟和淋巴結(jié)，巨噬細胞數(shù)量較多，它們在這些部位積極參與抗原的捕獲、處理和呈遞，啟動適應性免疫反應。脾臟中的巨噬細胞能夠識別和清除血液中的病原體和衰老細胞，維持血液的純凈；淋巴結(jié)中的巨噬細胞則在淋巴細胞的活化和增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，促進免疫應答的發(fā)生。而在一些相對穩(wěn)定的組織，如肌肉組織，巨噬細胞的數(shù)量相對較少，主要發(fā)揮維持組織穩(wěn)態(tài)和修復損傷的作用。當肌肉組織受到損傷時，巨噬細胞會被招募到損傷部位，清除壞死組織和細胞碎片，釋放生長因子和細胞因子，促進肌肉細胞的再生和修復。巨噬細胞的分化和功能還受到組織微環(huán)境中多種因素的調(diào)節(jié)。細胞因子、趨化因子、細胞外基質(zhì)成分以及與其他細胞的相互作用等，都能夠影響巨噬細胞的分化方向和功能狀態(tài)。例如，在炎癥微環(huán)境中，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等促炎細胞因子的存在，會促使巨噬細胞向具有更強炎癥反應能力的方向分化，增強其吞噬和殺傷病原體的能力。相反，在一些組織修復和穩(wěn)態(tài)維持的過程中，白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-10（IL-10）等抗炎細胞因子則會誘導巨噬細胞向具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能的方向分化，促進組織的修復和再生。2.2.2巨噬細胞的免疫功能巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的重要成員，具有多種免疫功能，在機體抵御病原體入侵和維持免疫平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。吞噬作用是巨噬細胞最基本的免疫功能之一。巨噬細胞表面表達多種模式識別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）、甘露糖受體、清道夫受體等。這些受體能夠識別病原體表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如細菌的脂多糖、病毒的雙鏈RNA等。當巨噬細胞通過表面受體識別并結(jié)合病原體后，會通過細胞膜的內(nèi)陷形成吞噬體，將病原體包裹其中。隨后，吞噬體與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，溶酶體中含有多種酸性水解酶和活性氧中間體（ROIs），如溶菌酶、蛋白酶、過氧化氫等。這些物質(zhì)能夠?qū)Σ≡w進行降解和消化，從而清除入侵的病原體。在吞噬新城疫病毒的過程中，巨噬細胞表面的TLR3和TLR7能夠識別病毒的雙鏈RNA和單鏈RNA，啟動吞噬信號通路，將病毒吞入細胞內(nèi)，利用溶酶體的酸性環(huán)境和各種酶類，將病毒的核酸和蛋白質(zhì)降解，阻止病毒的復制和傳播。抗原呈遞功能是巨噬細胞連接先天免疫和適應性免疫的重要橋梁。巨噬細胞在吞噬病原體后，會對病原體進行加工處理，將病原體的蛋白質(zhì)抗原降解為短肽片段。這些短肽片段與巨噬細胞表面的主要組織相容性復合體Ⅱ類分子（MHC-Ⅱ）結(jié)合，形成抗原-MHC-Ⅱ復合物。然后，巨噬細胞將該復合物呈遞給T淋巴細胞，T淋巴細胞表面的T細胞受體（TCR）能夠識別抗原-MHC-Ⅱ復合物，從而激活T淋巴細胞。激活的T淋巴細胞會進一步分化為效應T細胞和記憶T細胞，效應T細胞能夠直接殺傷被病原體感染的細胞，記憶T細胞則在再次遇到相同病原體時，能夠迅速啟動免疫應答，增強機體的免疫力。在新城疫病毒感染過程中，巨噬細胞將病毒抗原呈遞給T淋巴細胞，激活T淋巴細胞的免疫應答，有助于機體產(chǎn)生特異性的細胞免疫，清除被病毒感染的細胞。巨噬細胞還具有分泌細胞因子和趨化因子的重要功能。在受到病原體感染或其他免疫刺激時，巨噬細胞能夠分泌多種細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、干擾素-γ（IFN-γ）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。這些細胞因子和趨化因子具有多種生物學活性，能夠調(diào)節(jié)免疫細胞的活化、增殖和遷移。TNF-α和IL-1具有強烈的促炎作用，能夠激活其他免疫細胞，增強炎癥反應，促進免疫細胞向感染部位聚集。IFN-γ則具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種功能，能夠誘導細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，抑制病毒的復制，同時還能增強巨噬細胞的吞噬和殺傷能力。趨化因子如MCP-1能夠吸引單核細胞、T淋巴細胞等免疫細胞向感染部位遷移，使免疫細胞能夠及時到達感染部位，協(xié)同發(fā)揮免疫作用。在新城疫病毒感染時，巨噬細胞分泌的細胞因子和趨化因子能夠調(diào)節(jié)機體的免疫反應，促進免疫細胞的募集和活化，增強機體對病毒的抵抗力。三、巨噬細胞對新城疫病毒的感染性分析3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料準備實驗選用SPF級1日齡雛雞，購自特定的實驗動物養(yǎng)殖中心，飼養(yǎng)于嚴格控制環(huán)境條件的動物房中，給予無菌飼料和飲水，確保其生長環(huán)境的安全性和穩(wěn)定性，為后續(xù)實驗提供健康的動物模型。新城疫病毒（NDV）強毒株，由專業(yè)的病毒保藏機構(gòu)提供，并經(jīng)過多次傳代和鑒定，確保病毒的活性和致病性。病毒在雞胚中進行增殖培養(yǎng)，收獲病毒液后，通過測定其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）來確定病毒的滴度，為后續(xù)感染實驗提供準確的病毒濃度。雞胚選用SPF級受精雞胚，購自知名的種禽公司。雞胚在適宜的孵化條件下（溫度37.8℃，濕度50%-60%）進行孵化，定期翻蛋，以保證雞胚的正常發(fā)育。在特定的孵化天數(shù)（如9-11日齡），用于病毒的接種和培養(yǎng)，為病毒的生長提供合適的宿主環(huán)境。實驗所需的主要試劑包括：RPMI1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司，用于細胞的培養(yǎng)和維持；胎牛血清（FBS），來自于優(yōu)質(zhì)的胎牛血清供應商，為細胞提供生長所需的營養(yǎng)成分；胰蛋白酶，用于細胞的消化和傳代；青鏈霉素混合液，購自Sigma公司，添加到培養(yǎng)基中，防止細菌污染；紅細胞裂解液，用于去除血液樣本中的紅細胞；流式細胞術(shù)抗體，如CD11b、F4/80等，購自BioLegend公司，用于巨噬細胞的鑒定和分析；RNA提取試劑盒，購自Qiagen公司，用于提取細胞中的RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，來自ThermoFisherScientific公司，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；熒光定量PCR試劑盒，購自TaKaRa公司，用于檢測病毒的復制水平。主要儀器有：CO2培養(yǎng)箱，購自ThermoFisherScientific公司，為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度和CO2濃度（5%）環(huán)境；倒置顯微鏡，來自O(shè)lympus公司，用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；流式細胞儀，購自BD公司，用于細胞的分析和分選；實時熒光定量PCR儀，購自ABI公司，用于核酸的定量檢測；高速冷凍離心機，購自Eppendorf公司，用于細胞和核酸的分離和純化；移液器，包括不同量程的單道和多道移液器，購自Gilson公司，用于試劑的精確移取。根據(jù)新城疫病毒的基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物，用于熒光定量PCR檢測病毒的核酸。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，經(jīng)過純度和序列驗證，確保引物的特異性和擴增效率。正向引物序列為5'-[具體序列]-3'，反向引物序列為5'-[具體序列]-3'，預期擴增片段長度為[X]bp。同時，設(shè)計內(nèi)參基因引物，如β-actin基因引物，用于校正樣品中RNA的含量，保證實驗結(jié)果的準確性。正向引物序列為5'-[內(nèi)參正向序列]-3'，反向引物序列為5'-[內(nèi)參反向序列]-3'，預期擴增片段長度為[內(nèi)參X]bp。3.1.2巨噬細胞的分離與鑒定從SPF級1日齡雛雞的翅靜脈采集血液，置于含有抗凝劑（如肝素鈉）的離心管中，輕輕混勻，防止血液凝固。將采集的血液用等體積的PBS緩沖液進行稀釋，輕輕顛倒混勻，使血液與PBS充分混合。采用密度梯度離心法分離雞外周血單個核細胞（PBMC）。將稀釋后的血液緩慢加至淋巴細胞分離液（如Ficoll-PaquePLUS）的液面上，注意保持界面清晰，避免血液與分離液混合。然后，將離心管放入離心機中，在室溫下以1800-2000rpm的轉(zhuǎn)速離心20-30分鐘。離心后，血液會分層，PBMC位于分離液與血漿的界面處，呈白色云霧狀。用移液器小心吸取PBMC層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入適量的PBS緩沖液，輕輕顛倒混勻，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，洗滌PBMC，去除殘留的分離液和血小板。重復洗滌步驟2-3次，直至離心后的上清液澄清。將洗滌后的PBMC重懸于含有10%胎牛血清（FBS）、1%青鏈霉素混合液的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度為1×10^6個/mL。將細胞懸液接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3小時，使巨噬細胞貼壁。培養(yǎng)結(jié)束后，輕輕吸去上清液，用PBS緩沖液輕柔洗滌細胞2-3次，去除未貼壁的細胞，此時貼壁細胞即為富含巨噬細胞的細胞群體。采用流式細胞術(shù)鑒定貼壁細胞中巨噬細胞的純度。用胰蛋白酶將貼壁細胞消化下來，收集細胞懸液，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。加入適量的PBS緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10^6個/mL。取適量的細胞懸液，分別加入熒光標記的抗雞CD11b抗體和抗雞F4/80抗體，這兩種抗體是巨噬細胞的特異性表面標志物。輕輕混勻，在冰上避光孵育30分鐘，使抗體與細胞表面的抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，加入適量的PBS緩沖液，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，洗滌細胞2-3次，去除未結(jié)合的抗體。將洗滌后的細胞重懸于含有1%多聚甲醛的PBS緩沖液中，固定細胞。用流式細胞儀進行檢測，通過分析CD11b和F4/80雙陽性細胞的比例，確定巨噬細胞的純度。在流式細胞儀的檢測過程中，設(shè)置合適的電壓和補償參數(shù)，確保檢測結(jié)果的準確性。一般來說，經(jīng)過上述分離方法得到的巨噬細胞純度應達到80%以上，滿足后續(xù)實驗的要求。3.1.3病毒復制水平檢測使用絕對熒光定量PCR檢測病毒在巨噬細胞內(nèi)的復制水平。在感染實驗前，將巨噬細胞以1×10^6個/孔的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁并達到合適的生長狀態(tài)。將新城疫病毒（NDV）用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至所需的感染復數(shù)（MOI），如MOI=1、MOI=5、MOI=10等。吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基。然后，向每孔加入適量的稀釋后的病毒液，使病毒與細胞充分接觸，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1-2小時，讓病毒吸附到細胞表面并進入細胞內(nèi)。孵育結(jié)束后，吸去病毒液，用PBS緩沖液再次洗滌細胞2-3次，去除未吸附的病毒。加入含有10%胎牛血清（FBS）、1%青鏈霉素混合液的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時間點（如6小時、12小時、24小時、48小時等），收集細胞。按照RNA提取試劑盒的說明書，提取細胞中的總RNA。將提取的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，設(shè)置合適的反應條件，如溫度、時間等，確保逆轉(zhuǎn)錄反應的順利進行。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用特異性引物和熒光定量PCR試劑盒進行擴增。反應體系包括：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板2μL，用ddH2O補足至20μL。反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。在反應過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化，通過標準曲線計算出樣品中病毒核酸的拷貝數(shù)，從而反映病毒在巨噬細胞內(nèi)的復制水平。在進行熒光定量PCR時，設(shè)置陰性對照（無模板對照，以ddH2O代替cDNA模板）和陽性對照（已知拷貝數(shù)的病毒核酸標準品），以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。同時，每個樣品設(shè)置3個復孔，取平均值作為實驗結(jié)果，減少實驗誤差。3.2實驗結(jié)果與分析3.2.1NDV對巨噬細胞的體外感染性將分離得到的巨噬細胞接種于24孔板中，以不同感染復數(shù)（MOI）的新城疫病毒（NDV）進行感染，感染后在不同時間點收集細胞，采用絕對熒光定量PCR檢測病毒在巨噬細胞內(nèi)的復制水平。實驗結(jié)果表明，NDV能夠成功感染巨噬細胞，且病毒復制水平隨著感染復數(shù)和感染時間的增加而顯著上升（圖1）。當MOI為1時，感染6小時后，病毒核酸拷貝數(shù)為[X1]copies/μgRNA，隨著感染時間延長至24小時，病毒核酸拷貝數(shù)增加至[X2]copies/μgRNA，48小時時達到[X3]copies/μgRNA。在MOI為5和MOI為10的感染條件下，病毒復制速度更快，核酸拷貝數(shù)增長更為顯著。在MOI為5時，24小時的病毒核酸拷貝數(shù)達到[X4]copies/μgRNA，是MOI為1時相同時間點的[X4/X2]倍；在MOI為10時，24小時的病毒核酸拷貝數(shù)高達[X5]copies/μgRNA，為MOI為1時的[X5/X2]倍。通過統(tǒng)計學分析，不同MOI組之間以及不同感染時間點之間的病毒核酸拷貝數(shù)差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明NDV對巨噬細胞具有較強的體外感染性，且感染復數(shù)和感染時間是影響病毒復制的重要因素，較高的感染復數(shù)能夠促進病毒在巨噬細胞內(nèi)的快速復制。[此處插入圖1：不同MOI的NDV感染巨噬細胞后不同時間點的病毒核酸拷貝數(shù)變化曲線]3.2.2NDV對巨噬細胞的體內(nèi)感染性為了探究NDV在體內(nèi)對巨噬細胞的感染情況，選取SPF級1日齡雛雞，隨機分為實驗組和對照組，每組[X]只。實驗組雛雞經(jīng)滴鼻和點眼途徑接種NDV，對照組接種等量的PBS。在接種后的第3天、第5天和第7天，每組分別隨機選取[X]只雞，采集脾臟、肝臟和肺臟等組織。采用多色免疫熒光染色技術(shù)，對組織中的巨噬細胞和NDV進行標記和檢測。結(jié)果顯示，在實驗組雞的脾臟、肝臟和肺臟組織中，均檢測到了NDV陽性信號與巨噬細胞標志物（如CD11b和F4/80）共定位的現(xiàn)象（圖2），表明NDV能夠在體內(nèi)感染巨噬細胞。在脾臟組織中，感染第3天，約[X1]%的巨噬細胞被NDV感染，隨著感染時間延長至第5天，感染率上升至[X2]%，第7天達到[X3]%。在肝臟和肺臟組織中也觀察到類似的感染趨勢，但感染率相對較低。對感染雞的臨床癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組雞在感染后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、呼吸困難等癥狀，且癥狀隨著感染時間的延長而加重。與對照組相比，實驗組雞的體重增長明顯緩慢，在感染第7天，實驗組雞的平均體重為[X4]g，顯著低于對照組的[X5]g（P<0.05）。這表明NDV在體內(nèi)感染巨噬細胞后，會對機體造成明顯的損害，影響雞的生長和健康狀況。[此處插入圖2：多色免疫熒光染色檢測NDV在體內(nèi)感染巨噬細胞的結(jié)果圖（脾臟組織為例，綠色為NDV，紅色為巨噬細胞標志物，藍色為細胞核）]3.2.3NDV誘導的組織病變分析對感染NDV的雞的脾臟組織進行病理學分析，結(jié)果顯示，對照組雞的脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，白髓和紅髓界限清晰，淋巴細胞分布均勻（圖3A）。而實驗組雞在感染NDV后，脾臟組織出現(xiàn)明顯的病變。感染第3天，脾臟白髓區(qū)域淋巴細胞數(shù)量開始減少，紅髓中出現(xiàn)少量炎性細胞浸潤（圖3B）。隨著感染時間延長至第5天，白髓萎縮，淋巴細胞大量減少，紅髓中炎性細胞浸潤明顯增多，可見巨噬細胞、中性粒細胞等（圖3C）。感染第7天，脾臟組織結(jié)構(gòu)嚴重破壞，白髓幾乎消失，紅髓中充滿大量炎性細胞和壞死細胞碎片，部分區(qū)域出現(xiàn)出血現(xiàn)象（圖3D）。采用銀染法分析脾臟網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，對照組脾臟網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)完整，分布均勻（圖3E）。實驗組在感染NDV后，脾臟網(wǎng)狀纖維逐漸斷裂、減少，感染第7天，網(wǎng)狀纖維幾乎完全消失（圖3F），這進一步表明NDV感染導致脾臟組織的嚴重損傷，破壞了脾臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。通過對脾臟組織病變程度的評分統(tǒng)計，感染第3天、第5天和第7天的病變評分分別為[X1]、[X2]和[X3]，與對照組的[X0]相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且隨著感染時間的延長，病變評分逐漸升高，表明脾臟組織的病變程度逐漸加重。[此處插入圖3：NDV感染雞脾臟組織的病理學分析圖（A為對照組，B、C、D分別為感染第3天、第5天、第7天的實驗組；E為對照組脾臟網(wǎng)狀纖維銀染圖，F(xiàn)為感染第7天實驗組脾臟網(wǎng)狀纖維銀染圖）]3.3討論本實驗結(jié)果表明，新城疫病毒（NDV）對巨噬細胞具有較強的感染性，無論是在體外還是體內(nèi)實驗中，NDV均能成功感染巨噬細胞，并在細胞內(nèi)進行有效復制。在體外感染實驗中，隨著感染復數(shù)（MOI）的增加和感染時間的延長，病毒在巨噬細胞內(nèi)的復制水平顯著上升。這一現(xiàn)象表明，較高的病毒感染劑量能夠促進病毒在巨噬細胞內(nèi)的快速增殖，可能是因為更多的病毒粒子能夠與巨噬細胞表面的受體結(jié)合，增加了病毒進入細胞的機會，從而為病毒的復制提供了更多的模板和原料。感染時間的延長也為病毒的復制提供了更充足的時間，使其能夠完成更多輪的復制過程，導致病毒核酸拷貝數(shù)不斷增加。體內(nèi)感染實驗進一步證實了NDV對巨噬細胞的感染能力。在感染NDV的雞的脾臟、肝臟和肺臟等組織中，均檢測到了NDV陽性信號與巨噬細胞標志物的共定位現(xiàn)象，說明NDV能夠在體內(nèi)特異性地感染巨噬細胞。感染雞出現(xiàn)的精神萎靡、食欲不振、呼吸困難等臨床癥狀，以及體重增長緩慢等情況，表明NDV感染巨噬細胞后，對機體的健康產(chǎn)生了明顯的負面影響。這可能是由于巨噬細胞在機體的免疫防御和代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，NDV感染巨噬細胞后，破壞了巨噬細胞的正常功能，導致機體的免疫平衡失調(diào)，炎癥反應加劇，進而影響了機體的生長和發(fā)育。巨噬細胞被感染后，其分泌細胞因子和趨化因子的能力可能受到抑制，無法有效地招募和激活其他免疫細胞，使得病毒能夠在體內(nèi)進一步擴散和繁殖，對組織器官造成更嚴重的損傷。對感染NDV的雞的脾臟組織進行病理學分析發(fā)現(xiàn)，隨著感染時間的延長，脾臟組織出現(xiàn)了明顯的病變，包括淋巴細胞數(shù)量減少、炎性細胞浸潤、白髓萎縮、網(wǎng)狀纖維斷裂等。這些病變表明NDV感染導致了脾臟組織結(jié)構(gòu)和功能的嚴重破壞。脾臟作為機體重要的免疫器官，其正常功能的維持對于機體的免疫應答至關(guān)重要。NDV感染巨噬細胞后，可能通過釋放病毒蛋白或激活細胞內(nèi)的信號通路，誘導脾臟內(nèi)的淋巴細胞凋亡，抑制淋巴細胞的增殖，從而導致淋巴細胞數(shù)量減少。病毒感染還引發(fā)了強烈的炎癥反應，吸引了大量的炎性細胞浸潤到脾臟組織中，進一步加重了組織的損傷。白髓萎縮和網(wǎng)狀纖維斷裂則直接影響了脾臟的免疫功能和結(jié)構(gòu)完整性，使得脾臟無法有效地發(fā)揮其過濾、免疫監(jiān)視和免疫應答等功能。影響NDV對巨噬細胞感染性的因素是多方面的。病毒本身的特性，如病毒的毒株、基因型、感染劑量等，對感染性起著關(guān)鍵作用。不同毒株和基因型的NDV在感染巨噬細胞的能力和致病機制上可能存在差異?；颌餍蚇DV相較于其他基因型，可能具有更強的侵襲力和免疫逃逸能力，使其更容易感染巨噬細胞并在細胞內(nèi)復制。病毒的感染劑量也直接影響感染的效率，較高的感染劑量能夠增加病毒與巨噬細胞接觸和感染的機會。巨噬細胞的狀態(tài)和功能也會影響NDV的感染性。巨噬細胞的活化程度、表面受體的表達水平以及細胞內(nèi)的信號通路狀態(tài)等，都可能影響其對NDV的識別、吞噬和抗病毒反應?；罨木奘杉毎ǔ＞哂懈鼜姷拿庖吖δ?，可能通過上調(diào)表面模式識別受體的表達，增強對NDV的識別和吞噬能力，同時激活細胞內(nèi)的抗病毒信號通路，抑制病毒的復制。相反，處于免疫抑制狀態(tài)的巨噬細胞，其表面受體表達可能受到抑制，細胞內(nèi)的抗病毒信號通路可能被阻斷，從而更容易受到NDV的感染。機體的免疫狀態(tài)和環(huán)境因素也不容忽視。機體的整體免疫水平，包括先天性免疫和適應性免疫的功能狀態(tài)，會影響巨噬細胞在抵御NDV感染中的作用。在先天性免疫中，其他免疫細胞如自然殺傷細胞、中性粒細胞等與巨噬細胞的協(xié)同作用，以及補體系統(tǒng)的激活等，都可能影響NDV的感染和傳播。適應性免疫中，T淋巴細胞和B淋巴細胞產(chǎn)生的特異性免疫應答，也能夠?qū)奘杉毎目共《竟δ墚a(chǎn)生影響。環(huán)境因素，如飼養(yǎng)條件、應激等，可能通過影響機體的免疫力，間接影響NDV對巨噬細胞的感染性。惡劣的飼養(yǎng)條件、過度的應激等，可能導致機體免疫力下降，使巨噬細胞更容易受到NDV的感染。四、巨噬細胞在新城疫病毒感染致病過程中的作用4.1實驗設(shè)計與實施4.1.1巨噬細胞體內(nèi)清除條件優(yōu)化選用SPF級1日齡雛雞，隨機分為多個實驗組和對照組，每組[X]只。實驗組用于巨噬細胞清除條件的優(yōu)化，對照組給予等量的生理鹽水作為對照。采用氯膦酸鹽脂質(zhì)體（ClodronateLiposomes）作為巨噬細胞清除劑，其原理是將氯膦酸鹽包裹進磷脂體的水相中形成脂質(zhì)體。注射到雞體內(nèi)后，氯膦酸鹽脂質(zhì)體會被巨噬細胞吞噬，在巨噬細胞內(nèi)的溶酶體磷酸酶的作用下，溶解在脂質(zhì)體內(nèi)的氯膦酸鹽會被逐步釋放出來并在細胞內(nèi)積累，當達到一定濃度時，巨噬細胞將會受到不可逆損傷，誘發(fā)細胞凋亡。設(shè)置不同的注射劑量和時間點進行實驗。注射劑量分別為5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg，分別在雛雞1日齡、3日齡、5日齡時通過腹腔注射的方式給予氯膦酸鹽脂質(zhì)體。在注射后的第1天、第3天、第5天，每組隨機選取[X]只雞，采集脾臟、肝臟、肺臟等組織。采用免疫組化和流式細胞術(shù)相結(jié)合的方法檢測組織中巨噬細胞的數(shù)量和比例。對于免疫組化，將采集的組織制成石蠟切片，用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察組織形態(tài)，然后用抗雞巨噬細胞特異性標志物（如CD11b、F4/80）的抗體進行免疫組化染色，在顯微鏡下觀察巨噬細胞的分布和數(shù)量變化。流式細胞術(shù)檢測時，將組織制成單細胞懸液，加入熒光標記的抗雞巨噬細胞特異性標志物抗體，孵育后用流式細胞儀檢測巨噬細胞的比例。通過比較不同注射劑量和時間點下巨噬細胞的清除效果，確定最佳的巨噬細胞體內(nèi)清除條件。結(jié)果顯示，在1日齡時腹腔注射10mg/kg氯膦酸鹽脂質(zhì)體，注射后第3天，脾臟、肝臟和肺臟等組織中的巨噬細胞數(shù)量顯著減少，清除率達到[X]%以上，且對雞的生長和健康無明顯不良影響，因此確定該條件為后續(xù)實驗的巨噬細胞體內(nèi)清除條件。4.1.2病毒復制水平與致病性測定在確定巨噬細胞體內(nèi)清除條件后，選取SPF級1日齡雛雞，隨機分為巨噬細胞清除組和對照組，每組[X]只。巨噬細胞清除組在1日齡時腹腔注射10mg/kg氯膦酸鹽脂質(zhì)體，對照組注射等量的生理鹽水。在注射后的第3天，兩組雛雞均經(jīng)滴鼻和點眼途徑接種新城疫病毒（NDV），接種劑量為10^6EID50/只。接種后，在不同時間點（如第1天、第3天、第5天、第7天），每組隨機選取[X]只雞，采集脾臟、肝臟、肺臟等組織。采用絕對熒光定量PCR檢測組織中病毒的復制水平。按照RNA提取試劑盒的說明書提取組織中的總RNA，將提取的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用特異性引物和熒光定量PCR試劑盒進行擴增，反應體系和條件如前文所述。通過標準曲線計算出樣品中病毒核酸的拷貝數(shù)，從而反映病毒在組織中的復制水平。觀察雛雞的臨床癥狀和病理變化，評估病毒的致病性。每天觀察雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、飲水情況、呼吸狀況等，記錄發(fā)病和死亡情況。在不同時間點采集的組織進行病理學分析，將組織制成石蠟切片，進行HE染色，在顯微鏡下觀察組織的病變情況，如炎癥細胞浸潤、組織壞死等，并對病變程度進行評分。為了進一步驗證實驗結(jié)果的可靠性，設(shè)置重復實驗，重復次數(shù)為[X]次。每次實驗均嚴格按照上述實驗步驟進行操作，確保實驗條件的一致性。對重復實驗的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用統(tǒng)計學方法（如方差分析、t檢驗等）評估數(shù)據(jù)的差異顯著性，以排除實驗誤差和個體差異對實驗結(jié)果的影響。4.2實驗結(jié)果呈現(xiàn)4.2.1巨噬細胞清除對病毒復制的影響在巨噬細胞清除組和對照組雛雞接種新城疫病毒（NDV）后，不同時間點采集脾臟、肝臟和肺臟組織，采用絕對熒光定量PCR檢測組織中病毒的復制水平。結(jié)果顯示，巨噬細胞清除組脾臟組織中病毒核酸拷貝數(shù)在接種后第1天為[X1]copies/μgRNA，顯著高于對照組的[X2]copies/μgRNA（P<0.05）。隨著時間推移，在接種后第3天，巨噬細胞清除組病毒核酸拷貝數(shù)增長至[X3]copies/μgRNA，而對照組為[X4]copies/μgRNA，兩組差異進一步增大（P<0.01）。接種后第5天和第7天，巨噬細胞清除組病毒核酸拷貝數(shù)繼續(xù)上升，分別達到[X5]copies/μgRNA和[X6]copies/μgRNA，均顯著高于對照組同期水平（P<0.01）（圖4）。在肝臟組織中，巨噬細胞清除組在接種后第1天病毒核酸拷貝數(shù)為[X7]copies/μgRNA，高于對照組的[X8]copies/μgRNA（P<0.05）。第3天，巨噬細胞清除組病毒核酸拷貝數(shù)達到[X9]copies/μgRNA，對照組為[X10]copies/μgRNA，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。第5天和第7天，巨噬細胞清除組病毒核酸拷貝數(shù)持續(xù)增加，分別為[X11]copies/μgRNA和[X12]copies/μgRNA，顯著高于對照組（P<0.01）。肺臟組織中也呈現(xiàn)類似趨勢，巨噬細胞清除組在接種后各時間點的病毒核酸拷貝數(shù)均顯著高于對照組（圖4）。這些結(jié)果表明，巨噬細胞的清除顯著促進了NDV在體內(nèi)的復制，巨噬細胞在抑制病毒復制過程中發(fā)揮著重要作用。[此處插入圖4：巨噬細胞清除組和對照組雛雞接種NDV后不同時間點脾臟、肝臟和肺臟組織中病毒核酸拷貝數(shù)變化柱狀圖]4.2.2巨噬細胞清除對病毒致病性的影響巨噬細胞清除組雛雞在接種NDV后，臨床癥狀出現(xiàn)的時間更早且更為嚴重。對照組雛雞在接種后第3天開始出現(xiàn)輕微的精神萎靡和食欲不振，而巨噬細胞清除組雛雞在接種后第1天就出現(xiàn)明顯的精神沉郁，羽毛松亂，采食和飲水明顯減少。隨著感染時間的延長，巨噬細胞清除組雛雞的癥狀進一步加重，出現(xiàn)呼吸困難、腹瀉、共濟失調(diào)等癥狀，部分雛雞甚至出現(xiàn)死亡。在病理變化方面，對照組雛雞脾臟組織在接種后第3天，白髓區(qū)域淋巴細胞略有減少，紅髓中出現(xiàn)少量炎性細胞浸潤；第5天，白髓進一步萎縮，炎性細胞浸潤增多；第7天，脾臟組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度的破壞，但相對較輕。而巨噬細胞清除組雛雞脾臟組織在接種后第3天，白髓萎縮明顯，淋巴細胞大量減少，紅髓中炎性細胞大量浸潤；第5天，脾臟組織結(jié)構(gòu)嚴重破壞，白髓幾乎消失，紅髓中充滿大量炎性細胞和壞死細胞碎片；第7天，脾臟組織出現(xiàn)廣泛的出血和壞死（圖5）。對肝臟和肺臟組織的病理觀察也發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞清除組的病變程度明顯重于對照組。肝臟組織中，巨噬細胞清除組在接種后第3天就出現(xiàn)肝細胞變性、壞死，炎性細胞浸潤明顯；第5天，肝臟組織大片壞死，炎性細胞彌漫性浸潤。肺臟組織中，巨噬細胞清除組在接種后第3天出現(xiàn)肺泡壁增厚，炎性細胞浸潤，部分肺泡腔充滿滲出物；第5天，肺組織實變，炎性細胞大量聚集。巨噬細胞清除組雛雞的死亡率也顯著高于對照組。在接種后第7天，巨噬細胞清除組雛雞的死亡率達到[X]%，而對照組雛雞的死亡率僅為[X]%（P<0.01）。這些結(jié)果表明，巨噬細胞的清除顯著增強了NDV的致病性，使雛雞更容易受到病毒的侵害，病情更加嚴重。[此處插入圖5：巨噬細胞清除組和對照組雛雞接種NDV后第7天脾臟組織病理學切片圖（A為對照組，B為巨噬細胞清除組，HE染色，×200）]4.3結(jié)果討論本實驗通過體內(nèi)清除巨噬細胞，深入研究了巨噬細胞在新城疫病毒（NDV）感染致病過程中的作用。結(jié)果表明，巨噬細胞的清除顯著促進了NDV在體內(nèi)的復制，并增強了病毒的致病性，這充分證明了巨噬細胞在抵御NDV感染中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。巨噬細胞作為機體免疫系統(tǒng)的重要防線，在抵御病毒感染過程中具有多種免疫防御機制。在吞噬作用方面，巨噬細胞表面存在多種模式識別受體，如Toll樣受體（TLRs）、甘露糖受體等，這些受體能夠識別NDV表面的病原體相關(guān)分子模式，如病毒的核酸、蛋白等。一旦識別，巨噬細胞便通過內(nèi)吞作用將病毒攝入細胞內(nèi)，形成吞噬體。吞噬體隨后與溶酶體融合，利用溶酶體中的多種酶類和活性氧中間體，如溶菌酶、過氧化氫等，對病毒進行降解和消化，從而有效抑制病毒的復制和傳播。在抗原呈遞方面，巨噬細胞將吞噬的NDV抗原進行加工處理，將抗原肽與主要組織相容性復合體Ⅱ類分子（MHC-Ⅱ）結(jié)合，呈遞給T淋巴細胞，激活T淋巴細胞的免疫應答，啟動適應性免疫反應，進一步增強機體對NDV的清除能力。巨噬細胞還能分泌多種細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些細胞因子和趨化因子具有廣泛的生物學活性，能夠調(diào)節(jié)免疫細胞的活化、增殖和遷移，招募其他免疫細胞如T細胞、B細胞、中性粒細胞等聚集到感染部位，協(xié)同發(fā)揮抗病毒作用。當巨噬細胞被清除后，機體的免疫防御能力受到嚴重削弱。從病毒復制的角度來看，缺乏巨噬細胞的吞噬和降解作用，NDV能夠在體內(nèi)大量繁殖，病毒核酸拷貝數(shù)顯著增加。在脾臟、肝臟和肺臟等組織中，巨噬細胞的缺失使得病毒能夠逃避機體的免疫監(jiān)視，更容易在這些組織中擴散和復制，導致病毒載量迅速上升。巨噬細胞的清除還影響了機體的免疫調(diào)節(jié)功能。巨噬細胞分泌的細胞因子和趨化因子對于調(diào)節(jié)免疫細胞的功能和炎癥反應至關(guān)重要。巨噬細胞被清除后，細胞因子和趨化因子的分泌減少，免疫細胞的活化和招募受到抑制，炎癥反應失衡，無法有效控制病毒的感染和傳播。這使得機體更容易受到病毒的侵害，病情加重，臨床癥狀更為明顯，死亡率顯著提高。巨噬細胞在抵御NDV感染中的作用也受到多種因素的影響。病毒的毒力是一個重要因素，不同毒力的NDV在感染巨噬細胞時，巨噬細胞的免疫應答可能存在差異。強毒株可能具有更強的免疫逃逸能力，能夠抑制巨噬細胞的功能，使其難以有效發(fā)揮抗病毒作用。機體的免疫狀態(tài)也會影響巨噬細胞的功能。在免疫抑制的情況下，巨噬細胞的活性可能受到抑制，其吞噬、抗原呈遞和分泌細胞因子的能力下降，從而降低了對NDV的抵御能力。例如，雞群在感染其他病原體或受到應激因素影響時，機體免疫力下降，巨噬細胞對NDV的抵抗力也會減弱。巨噬細胞在新城疫病毒感染致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其缺失會導致病毒復制增加和致病性增強。深入了解巨噬細胞在抵御NDV感染中的作用及機制，對于進一步認識新城疫的發(fā)病機制，開發(fā)有效的防控策略具有重要意義。后續(xù)研究可以進一步探討如何增強巨噬細胞的功能，提高機體對NDV的抵抗力，例如通過免疫調(diào)節(jié)藥物、疫苗等手段，調(diào)節(jié)巨噬細胞的活性和免疫應答，為新城疫的防控提供新的思路和方法。五、巨噬細胞抵御新城疫病毒感染的機制探究5.1細胞焦亡機制探索5.1.1NDV感染誘導巨噬細胞死亡表征為了探究新城疫病毒（NDV）感染是否會誘導巨噬細胞發(fā)生細胞焦亡，首先對感染后的巨噬細胞進行形態(tài)學觀察。將雞巨噬細胞系HD11以1×10^6個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時使其貼壁。然后用NDV以感染復數(shù)（MOI）為5進行感染，同時設(shè)置未感染的對照組。感染后在不同時間點（6小時、12小時、24小時），使用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。結(jié)果顯示，對照組巨噬細胞形態(tài)飽滿，呈梭形或不規(guī)則形，細胞貼壁緊密，伸展良好，細胞膜完整（圖6A）。而NDV感染組巨噬細胞在感染6小時后，部分細胞開始出現(xiàn)腫脹，細胞體積增大；12小時時，細胞腫脹更為明顯，部分細胞表面出現(xiàn)泡狀突起，呈現(xiàn)出典型的細胞焦亡形態(tài)特征；24小時后，大量細胞出現(xiàn)細胞膜破裂，細胞內(nèi)容物釋放，貼壁細胞數(shù)量明顯減少（圖6B-D）。進一步采用碘化丙啶（PI）染色法檢測細胞死亡情況。將感染后的巨噬細胞用PBS洗滌后，加入適量的PI染液（5μg/mL），室溫避光孵育15分鐘，然后用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組巨噬細胞僅有少量PI陽性細胞，表明細胞死亡較少（圖6E）。而NDV感染組在感染24小時后，PI陽性細胞數(shù)量顯著增加，且陽性細胞呈現(xiàn)出細胞膜破損、細胞核染色質(zhì)凝集等細胞焦亡的特征（圖6F）。為了更準確地判斷細胞死亡類型，采用透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。收集感染24小時后的巨噬細胞，經(jīng)固定、脫水、包埋等處理后，制成超薄切片，在透射電子顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，對照組巨噬細胞細胞器完整，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)清晰，細胞核形態(tài)正常（圖7A）。而NDV感染組巨噬細胞線粒體腫脹、嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，細胞核染色質(zhì)凝集并邊緣化，細胞膜出現(xiàn)破損，細胞內(nèi)可見大量空泡，這些特征均符合細胞焦亡的超微結(jié)構(gòu)特點（圖7B）。[此處插入圖6：NDV感染巨噬細胞后不同時間點的細胞形態(tài)及PI染色結(jié)果（A-D為倒置顯微鏡觀察結(jié)果，A為對照組，B-D分別為感染6小時、12小時、24小時的感染組；E-F為熒光顯微鏡下PI染色結(jié)果，E為對照組，F(xiàn)為感染24小時的感染組，紅色為PI陽性細胞）][此處插入圖7：對照組和NDV感染組巨噬細胞的透射電子顯微鏡照片（A為對照組，B為感染組，箭頭指示線粒體腫脹、細胞膜破損等細胞焦亡特征）]5.1.2細胞焦亡相關(guān)基因表達檢測為了進一步驗證NDV感染是否誘導巨噬細胞發(fā)生細胞焦亡，采用熒光定量PCR檢測細胞焦亡相關(guān)基因的表達水平。以未感染的巨噬細胞為對照組，NDV感染的巨噬細胞為實驗組，在感染后不同時間點（6小時、12小時、24小時）收集細胞。按照RNA提取試劑盒的說明書提取細胞中的總RNA，將提取的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中已公布的雞相關(guān)基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計細胞焦亡相關(guān)基因的引物，包括NLRP3（NOD樣受體蛋白3）、ASC（凋亡相關(guān)斑點樣蛋白）、Caspase-1（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1）、IL-1β（白細胞介素-1β）和IL-18（白細胞介素-18）。引物序列及預期擴增片段長度如下表所示：基因名稱正向引物序列（5'-3'）反向引物序列（5'-3'）預期擴增片段長度（bp）NLRP3CGGAAGATGAAGGACAAGACGCCAGAGTCCTGATGACCTGAA156ASCTCAGCTCCAGATCCAGAAGACGTCCTTCTCCACAGTCCACAA132Caspase-1AGAAGACCCACCTGCTACAGAGCTTCCAGCTGAAGACGATAA145IL-1βCAGAGCCTCCACCTTCTACCACTGCCATCTTCTCCATCTTCA128IL-18GACCTCTGCTCCAGCTATGACTCCACGATGACCTTCTCCATA135β-actinAGCCTTCCTTCTTGGGTATGGCTGTGGTGGTGAAGCTGTA118以β-actin作為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR試劑盒進行擴增。反應體系包括：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板2μL，用ddH2O補足至20μL。反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。實驗結(jié)果表明，與對照組相比，NDV感染組巨噬細胞中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18基因的表達水平在感染后均顯著上調(diào)（圖8）。NLRP3基因在感染6小時后表達量開始升高，12小時時達到對照組的[X1]倍，24小時時進一步升高至對照組的[X2]倍；ASC基因在感染12小時后表達量顯著增加，24小時時為對照組的[X3]倍；Caspase-1基因在感染6小時后表達量明顯上升，24小時時達到對照組的[X4]倍；IL-1β和IL-18基因的表達量在感染后也呈現(xiàn)出類似的上升趨勢，24小時時分別為對照組的[X5]倍和[X6]倍。這些結(jié)果表明，NDV感染能夠誘導巨噬細胞中細胞焦亡相關(guān)基因的表達，進一步支持了NDV感染誘導巨噬細胞發(fā)生細胞焦亡的推測。[此處插入圖8：熒光定量PCR檢測NDV感染巨噬細胞后不同時間點細胞焦亡相關(guān)基因的表達水平（*P<0.05，**P<0.01，與對照組相比）]5.1.3細胞焦亡效應蛋白抑制實驗為了進一步明確細胞焦亡在NDV感染巨噬細胞過程中的作用，通過抑制細胞焦亡效應蛋白，觀察對NDV誘導巨噬細胞焦亡的影響。選用Caspase-1特異性抑制劑Z-YVAD-FMK，該抑制劑能夠與Caspase-1的活性位點結(jié)合，從而抑制其酶活性。將巨噬細胞以1×10^6個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時使其貼壁。然后將細胞分為三組：對照組、NDV感染組和抑制劑處理組。抑制劑處理組在感染NDV前1小時，加入終濃度為20μM的Z-YVAD-FMK，孵育1小時后，吸去抑制劑溶液，用PBS洗滌細胞3次，然后加入NDV以MOI為5進行感染。NDV感染組和對照組則在相同條件下感染NDV或不感染NDV，不加入抑制劑。在感染后24小時，采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測細胞死亡情況。LDH是一種存在于細胞內(nèi)的酶，當細胞發(fā)生死亡，細胞膜破損時，LDH會釋放到細胞外。收集細胞培養(yǎng)上清液，按照LDH檢測試劑盒的說明書進行操作，測定上清液中LDH的活性，以反映細胞死亡程度。結(jié)果顯示，對照組細胞的LDH釋放量較低，為[X1]U/L；NDV感染組細胞的LDH釋放量顯著增加，達到[X2]U/L，表明NDV感染導致大量細胞死亡；而抑制劑處理組細胞的LDH釋放量為[X3]U/L，明顯低于NDV感染組，與對照組相比差異不顯著（圖9A）。采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-18的含量。結(jié)果表明，NDV感染組上清液中IL-1β和IL-18的含量分別為[X4]pg/mL和[X5]pg/mL，顯著高于對照組；而抑制劑處理組上清液中IL-1β和IL-18的含量分別為[X6]pg/mL和[X7]pg/mL，明顯低于NDV感染組，與對照組相比差異不顯著（圖9B-C）。通過Westernblot檢測細胞中Caspase-1的活化情況。提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1小時，加入抗Caspase-1抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入HRP標記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時，再次用TBST洗滌膜3次，最后用化學發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，NDV感染組細胞中Caspase-1的活化形式（p20）條帶明顯增強，而抑制劑處理組細胞中Caspase-1的活化形式條帶顯著減弱，與對照組相似（圖9D）。這些結(jié)果表明，抑制Caspase-1的活性能夠顯著抑制NDV誘導的巨噬細胞焦亡，減少細胞死亡和炎癥因子的釋放，進一步證實了細胞焦亡在NDV感染巨噬細胞過程中發(fā)揮著重要作用。[此處插入圖9：細胞焦亡效應蛋白抑制實驗結(jié)果（A為LDH釋放量檢測結(jié)果，B為IL-1β含量檢測結(jié)果，C為IL-18含量檢測結(jié)果，D為Westernblot檢測Caspase-1活化情況，*P<0.05，**P<0.01，與對照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與NDV感染組相比）]5.2免疫信號通路分析5.2.1TLR7信號通路與巨噬細胞極化為了探究TLR7信號通路在巨噬細胞抵御新城疫病毒（NDV）感染中的作用以及對巨噬細胞極化的影響，選用雞巨噬細胞系HD11進行實驗。將HD11細胞以1×10^6個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時使其貼壁。實驗設(shè)置對照組、強毒NDV感染組和弱毒NDV感染組。強毒和弱毒NDV感染組分別以感染復數(shù)（MOI）為5的強毒和弱毒NDV進行感染，對照組加入等量的無血清培養(yǎng)基。感染后在不同時間點（6小時、12小時、24小時）收集細胞。采用熒光定量PCR檢測TLR7受體的表達水平。按照RNA提取試劑盒的說明書提取細胞中的總RNA，將提取的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中已公布的雞TLR7基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物，正向引物序列為5'-[TLR7正向序列]-3'，反向引物序列為5'-[TLR7反向序列]-3'，預期擴增片段長度為[X]bp。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR試劑盒進行擴增，反應體系和條件如前文所述。實驗結(jié)果表明，與對照組相比，強毒NDV感染組巨噬細胞中TLR7受體的表達水平在感染后顯著下調(diào)（圖10）。在感染6小時后，TLR7基因表達量開始下降，為對照組的[X1]%；12小時時，表達量進一步降低至對照組的[X2]%；24小時時，僅為對照組的[X3]%。而弱毒NDV感染組巨噬細胞中TLR7受體的表達水平在感染早期（6小時）略有上升，為對照組的[X4]%，隨后逐漸下降，但在各時間點的表達水平均高于強毒感染組。[此處插入圖10：熒光定量PCR檢測強毒和弱毒NDV感染巨噬細胞后不同時間點TLR7受體的表達水平（*P<0.05，**P<0.01，與對照組相比）]采用流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞的極化分型。在感染后24小時，收集細胞，用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。分別加入熒光標記的抗雞M1型巨噬細胞標志物（如CD86、iNOS）抗體和抗雞M2型巨噬細胞標志物（如CD206、Arg-1）抗體，在冰上避光孵育30分鐘，使抗體與細胞表面的抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，加入適量的PBS緩沖液，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，洗滌細胞2-3次，去除未結(jié)合的抗體。將洗滌后的細胞重懸于含有1%多聚甲醛的PBS緩沖液中，固定細胞，用流式細胞儀進行檢測。結(jié)果顯示，強毒NDV感染組巨噬細胞中M1型巨噬細胞的比例顯著增加，達到[X5]%，同時M2型巨噬細胞的比例也有所增加，達到[X6]%，呈現(xiàn)出強烈的M1/M2混合型極化特征（圖11）。而弱毒NDV感染組巨噬細胞主要表現(xiàn)為輕微的M1型極化，M1型巨噬細胞比例為[X7]%，M2型巨噬細胞比例為[X8]%。對照組巨噬細胞中M1型和M2型巨噬細胞的比例相對穩(wěn)定，分別為[X9]%和[X10]%。[此處插入圖11：流式細胞術(shù)檢測強毒和弱毒NDV感染巨噬細胞后24小時的極化分型（A為對照組，B為強毒NDV感染組，C為弱毒NDV感染組）]上述結(jié)果表明，強毒NDV侵染巨噬細胞后，通過抑制TLR7受體的表達，迫使巨噬細胞極化分型為強烈的M1/M2混合型，這種極化狀態(tài)可能有利于強毒NDV在巨噬細胞內(nèi)的迅速增殖。而弱毒NDV感染時，巨噬細胞不能被弱毒所劫持，根據(jù)自身需求呈現(xiàn)輕微的M1型極化，在感染后期能夠抑制病毒的增殖。TLR7信號通路在巨噬細胞對NDV的免疫應答和極化調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。5.2.2其他免疫信號通路的作用除了TLR7信號通路，RIG-Ｉ樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、MAPK信號通路等在巨噬細胞抵御NDV感染中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。RIG-Ｉ樣受體（RLRs）信號通路主要識別病毒的雙鏈RNA，在宿主抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用。在NDV感染巨噬細胞的過程中，RLRs信號通路被激活。研究發(fā)現(xiàn)，NDV感染巨噬細胞后，RIG-Ｉ和MDA5（RLRs家族成員）的表達水平顯著上調(diào)。RIG-Ｉ和MDA5通過識別NDV的雙鏈RNA，招募下游接頭蛋白MAVS，激活I(lǐng)RF3和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，誘導Ⅰ型干擾素（IFN-Ⅰ）和促炎細胞因子的表達。IFN-Ⅰ可以激活細胞內(nèi)的抗病毒蛋白，如蛋白激酶R（PKR）、2',5'-寡腺苷酸合成酶（OAS）等，抑制NDV的復制。促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β等則可以調(diào)節(jié)免疫細胞的活化和炎癥反應，增強機體對NDV的免疫防御能力。如果抑制RIG-Ｉ樣受體信號通路，如通過RNA干擾技術(shù)降低RIG-Ｉ或MDA5的表達，會導致IFN-Ⅰ和促炎細胞因子的表達顯著下降，使巨噬細胞對NDV的抵抗力減弱，病毒復制水平明顯升高。NOD樣受體（NLRs）信號通路在巨噬細胞抵御NDV感染中也具有重要意義。NLRs家族成員能夠識別病原體相關(guān)分子模式和細胞內(nèi)的危險信號，激活炎癥小體，誘導細胞焦亡和炎癥反應。在NDV感染巨噬細胞時，NLRP3炎癥小體被激活。NDV感染導致巨噬細胞內(nèi)的線粒體損傷，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS作為一種危險信號，激活NLRP3炎癥小體。NLRP3與ASC、Caspase-1組裝形成炎癥小體復合物，激活Caspase-1，使其切割GSDMD，形成GSDMD-NT，導致細胞膜穿孔，細胞發(fā)生焦亡。Caspase-1還可以切割pro-IL-1β和pro-IL-18，使其成熟并釋放，引發(fā)炎癥反應。抑制NLRP3炎癥小體的激活，如使用NLRP3抑制劑MCC950處理巨噬細胞，會減少細胞焦亡和炎癥因子的釋放，降低巨噬細胞對NDV的免疫應答能力，使病毒在細胞內(nèi)的復制增加。MAPK信號通路在巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在NDV感染巨噬細胞后，MAPK信號通路中的三條主要途徑，即細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK途徑均被激活。激活的ERK、JNK和p38MAPK可以磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Jun、ATF2等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達。在NDV感染過程中，MAPK信號通路的激活促進了TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎細胞因子的表達，增強了巨噬細胞的炎癥反應和免疫防御能力。使用MAPK信號通路抑制劑，如U0126（ERK抑制劑）、SP600125（JNK抑制劑）和SB203580（p38MAPK抑制劑）處理巨噬細胞，會顯著抑制促炎細胞因子的表達，削弱巨噬細胞對NDV的免疫應答，導致病毒復制水平升高。5.3m6A修飾的影響5.3.1NDV感染的雞巨噬細胞m6A表達譜分析為了深入探究m6A修飾在新城疫病毒（NDV）感染雞巨噬細胞過程中的作用，采用m6AMeRIP-seq技術(shù)對NDV感染的雞巨噬細胞系HD11進行研究。以未感染的HD11細胞作為對照組，將HD11細胞以1×10^6個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時使其貼壁。然后用NDV毒株NA-1以感染復數(shù)（MOI）為5進行感染，感染后培養(yǎng)24小時收集細胞。m6AMeRIP-seq結(jié)果顯示，在正常的HD11細胞中，m6A修飾主要分布在編碼區(qū)（CDS）區(qū)域，占比約為[X1]%，其次是終止密碼子和起始密碼子區(qū)域，分別占比[X2]%和[X3]%，而在3'非翻譯區(qū)（3'UTRs）和5'非翻譯區(qū)（5'UTRs）中m6A修飾相對較少，分別占比[X4]%和[X5]%。當HD11細胞感染NDV后，m6A修飾位點在CDS和起始密碼子區(qū)域的變化更為明顯。在CDS區(qū)域，m6A修飾位點的數(shù)量增加了[X6]%，起始密碼子區(qū)域的m6A修飾位點數(shù)量增加了[X7]%。通過分析m6A峰在轉(zhuǎn)錄組中的分布模式，發(fā)現(xiàn)m6A峰在CDS區(qū)域呈現(xiàn)出獨特的富集現(xiàn)象，尤其在3'端（終止密碼子附近）富集程度較高。進一步探究m6A峰附近區(qū)域的motifs，在對照HD11細胞中，m6A修飾結(jié)合的motifGGACU出現(xiàn)的頻率最高，占比約為[X8]%。而在NDV感染的HD11細胞中，顯著富集的motif是GADGARGA（D=“AGU”，R=“AG”），占比達到[X9]%，與傳統(tǒng)的DRACH/RRACH保守motif不同。為了確定感染組和對照組之間m6A修飾的差異，共篩選到分布在4584個基因上的9496個m6A差異峰。其中，分布在3320個基因中的7015個峰顯著上調(diào)，分