動物防疫抽樣規(guī)范

1DB11/T677—動物防疫抽樣規(guī)范1范圍本文件規(guī)定動物防疫抽樣的一般要求，抽樣前準備，抽樣動物種類，抽樣范圍，抽樣數(shù)量，抽樣，抽樣記錄及樣品的保存運輸。本文件適用于動物疫病實驗室血清學監(jiān)測、病原學監(jiān)測和病理組織學檢查等抽樣工作。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。特定物體的內部和表面無活的微生物存在。用于防止微生物進入動物體組織或其它無菌范圍的操作技術。動物防疫抽樣samplingforanimalepidemicprevention為了預防、控制、凈化、消滅動物疫病，按照一定的規(guī)則采集動物體液、臟器等樣品的行為。以化學劑或物理方法消滅所有活的微生物，包括所有細菌的繁殖體、芽孢、真菌及病毒，從而達到無菌的過程。4一般要求2DB11/T677—4.1根據(jù)國家和北京市動物防疫的抽樣計劃，設定常規(guī)監(jiān)測、疫點、疫區(qū)、受威脅區(qū)疫病監(jiān)測抽樣種類、數(shù)量、范圍。4.2抽樣人員應是動物防疫人員，能夠正確掌握抽樣方法，熟練使用采樣器具。4.3根據(jù)不同的疫病或檢驗目的，采其相應的組織臟器、內容物、分泌物、排泄物或其他材料。在無法估計病因時，要選取有代表性的樣品，進行多點、全面的采集。4.4凡發(fā)現(xiàn)動物有急性死亡，在排除炭疽病、狂犬病等烈性人獸共患病的情況下，方可剖檢采樣。4.5防止污染環(huán)境，防止疫病傳播，做好環(huán)境消毒和病害尸體無害化的處理。4.6采集一份樣品，使用一套器械與容器，使用過的非一次性用具應先消毒后清洗，一次性用具按照醫(yī)療廢棄物處理方法處理。4.7一次性消毒用品不應超期使用。4.8采樣人員做好個人防護。5抽樣前準備5.1準備口罩、帽子、防護眼鏡、防護服、手套、膠靴等人員防護用品。5.2準備滅菌處理的解剖刀、鑷子等抽樣用器具。5.3準備消毒液及樣品的記錄、保存、運輸物品。5.4準備相機或攝像機等拍照或視頻器材。6抽樣動物種類6.1家禽（雞、鴨、鵝、鴿等）。6.2家畜（豬、牛、羊、馬屬動物等）。6.3寵物（犬、貓等）。7抽樣范圍7.1養(yǎng)殖區(qū)域包括種畜禽場、商品畜禽場、養(yǎng)殖小區(qū)、養(yǎng)殖戶等。7.2流通區(qū)域包括從事動物交易活動的場點和動物隔離場點等。7.3其它區(qū)域包括畜禽屠宰場、公園、動物園、野禽棲息地、寵物醫(yī)院或收容場所等。8抽樣數(shù)量8.1常規(guī)監(jiān)測抽樣數(shù)量常規(guī)監(jiān)測抽樣數(shù)量應符合表1的規(guī)定。表1常規(guī)監(jiān)測抽樣數(shù)量3DB11/T677—≥10只≥10只只）豬≥30頭≥5頭≥5頭或逐頭采樣（不足5頭）≥5頭/只/匹或逐頭/只/匹采犬、貓8.2疫點監(jiān)測抽樣數(shù)量疫點監(jiān)測抽樣數(shù)量應符合表2的規(guī)定。表2疫點監(jiān)測抽樣數(shù)量8.3疫區(qū)、受威脅區(qū)監(jiān)測抽樣數(shù)量疫區(qū)、受威脅區(qū)監(jiān)測抽樣數(shù)量應符合表3的規(guī)定。表3疫區(qū)、受威脅區(qū)監(jiān)測抽樣數(shù)量犬、貓9抽樣9.1.1.2豬：前腔靜脈或耳靜脈。9.1.1.3牛：頸靜脈,尾靜脈,乳靜脈和耳靜脈。9.1.1.4羊：頸靜脈或前后肢皮下靜脈。9.1.1.5馬屬動物：頸靜脈或尾靜脈。9.1.1.6犬、貓：頸靜脈，前肢臂頭靜脈，后肢外側隱靜脈或耳緣靜脈。9.1.2.1抽血部位的皮膚先剃毛、清潔，再用碘伏和75%的酒精消毒（自內向外螺旋消毒）。4DB11/T677—9.1.2.2用滅菌真空采血器、注射器或針頭穿刺抽取。將全血注入裝有抗凝劑的試管中，輕輕搖動，充分混合?？蛇x用以下四種方法：——阿氏液（見附錄A.11mL血PCR檢測血樣應首選15%EDTA溶液，不應使用肝素溶液。9.1.3.2.1全血凝固后，在室溫下靜置至自然析出。容器內先加抗凝劑，血液與抗凝劑充分混合，然后靜置，待細胞下沉后，吸取上清液。9.2一般臟器應分別在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟、淋巴結部位進行抽樣。一般情況下，采集死亡動物的內臟樣品，應于動物死亡后2h內采集，無法完成時夏天最遲不超過死亡后6h，冬天不超過24h。按無菌操作方法采集相關臟器的部分組織或整個臟器或病變明顯的組織。采集后應立即放入4℃左右的容器中冷藏。9.2.3.1用于細菌分離的組織，單獨放在無菌容器內。9.2.3.2用于病毒分離或PCR檢測的組織，放在裝有病毒保存緩沖液的容器內,病毒保存緩沖液的配制見附錄A.2。9.2.3.3用于病理學檢查的組織，放入裝有10倍于樣品體積的10%中性福爾馬林溶液的容器內。9.3腦組織應分別在大腦、小腦、腦干部位進行抽樣。按無菌操作方法采集部分腦組織或全腦，或根據(jù)病毒靶向性采集病毒載量高的腦組織。5DB11/T677—9.3.3.1全腦用浸過消毒液的紗布包裹后，浸入含30%甘油鹽水溶液中,30%甘油鹽水溶液配制見附錄9.3.3.2將組織樣品放入-20℃~-70℃冷凍。9.3.3.3將組織樣品放入裝有10倍于樣品體積的10%中性福爾馬林溶液的容器內。9.4食道/咽部分泌物（O-P液）在食道、咽部進行抽樣。9.4.2.1被檢動物在抽樣前禁食（可飲少量水）12h，探杯用0.2%檸檬酸或2%氫氧化鈉浸泡5min，再用接近動物體溫的清水沖洗后使用，每采完一頭動物，探杯要進行消毒并充分清洗。9.4.2.2動物站立保定，將探杯隨吞咽動作送入食道上部10c倒入含有等量Earle細胞培養(yǎng)液（見附錄A.4）或PBS液（見附錄A.6：0.04mol/L,pH值7.4器中，充分搖勻后放冷藏箱及時送檢，未能及時送檢應置-30°冷凍保存。9.5呼吸道分泌物在鼻腔、咽喉、氣管部位進行抽樣。取無菌棉簽，輕輕擦拭并慢慢旋轉2-3圈，沾取鼻腔分泌物、咽喉分泌物或氣管分泌物，放入裝有2mL保存液的試管。9.5.3.1將拭子浸入pH7.2～7.4的滅菌肉湯保存液中，滅菌肉湯配制見附錄A.5。9.5.3.2將拭子浸入0.04mol/L磷酸鹽緩沖液中或50%甘油-PBS保存液，磷-PBS保存液配制見附錄A.6和A.7。9.5.3.3接種組織培養(yǎng)用的拭子浸入0.5%乳蛋白水解物的漢克氏（Hanks）營養(yǎng)液中，乳蛋白水解物的漢克氏液配制見附錄A.8。在眼結膜表面、眼病變組織部位進行抽樣。9.6.2.1眼結膜表面用拭子輕輕擦拭后，放入滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液中。9.6.2.2取病變組織碎屑，置載玻片上，制成玻璃觸片。6DB11/T677—9.7皮膚及粘膜皮膚及粘膜抽樣方法，用于一般檢測的樣品，用滅菌剪子和鑷子直接采自病變部位。加適量抗菌素于30%甘油鹽水緩沖液中，加蓋密封。用于檢測核酸的樣品，不應使用酒精、碘酒等消毒劑消毒。9.8脊髓液脊髓液抽樣方法，抽樣使用特制的專用消毒穿刺針。頸椎穿刺點為環(huán)樞孔，垂直緩慢刺入蛛網膜下腔，立即拔出針芯，腦脊髓液自動流出，取適量液體，盛入消毒容器內。腰椎穿刺部位為腰薦孔，垂直緩慢刺入蛛網膜下腔，立即拔出針芯，腦脊髓液自動流出，盛入消毒容器內。腰椎穿刺一次抽取量15mL～30mL。抽樣部位為乳房。消毒取乳者的手，用乳頭藥浴液浸泡奶牛乳頭，棄去最初所擠的頭把乳汁，采集10mL乳汁于滅菌牛奶采樣杯中。進行血清學檢驗的乳汁不應凍結、加熱或強烈震動。9.10胃內容物9.10.1抽樣部位抽樣部位為動物胃內。9.10.2抽樣方法9.10.2.1將多孔胃管送入單胃胃內，其外露端接在吸引器的負壓瓶上，加負壓后，胃液即可自動流入瓶內。9.10.2.2在反芻動物反芻時，在食團從食道逆入口腔時，立即開口拉住舌頭，另一只手深入口腔取出少量的瘤胃內容物。9.10.2.3對死亡的動物直接剖檢采集。9.10.3處理方法取出的胃內容物應立即放在0℃~4℃條件下保存。9.11腸內容物9.11.1抽樣部位選擇病變最明顯的部分。9.11.2抽樣方法7DB11/T677—9.11.2.1用滅菌生理鹽水將腸管外表輕輕沖洗三遍，燒烙腸壁漿膜面，用吸管扎穿腸壁，從腸腔內吸取內容物。9.11.2.2將腸管雙結扎，從兩端剪斷，單獨放在已消毒的容器內。9.11.3處理方法。將腸內容物放入盛有滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液中。9.12糞便9.12.1抽樣部位抽樣部位為肛門。9.12.2抽樣方法用拭子小心地插到直腸粘膜表面轉一圈采集。9.12.3處理方法將糞便拭子放入盛有滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液中。9.13胎兒抽樣方法：將流產后的整個胎兒，裝入不透水的塑料袋，放入有冰袋的冷藏箱。9.14動物尸體抽樣方法：將病死動物尸體裝入兩層不漏水的塑料袋內，放入有冰袋的冷藏箱。9.15精液9.15.1抽樣方法用溫水洗凈陰莖，用假陰道擠壓陰莖或人工刺激的方法采取精液。9.15.2處理方法9.15.2.1將集精杯從假陰道取下，裝入滅菌容器中。9.15.2.2樣品中不得加入防腐劑。9.16生殖道分泌物9.16.1抽樣方法9.16.1.1擴開陰道后，用纏有滅菌紗布條的長鉗子采取陰道粘液。9.16.1.2把龜頭牽引到包皮外面，用清水洗凈后以紗布纏好固定，將纏有紗布條（用滅菌生理鹽水浸濕）的尿道敷料鉗或尿道探子插入尿道輕輕轉動采取尿道黏液。9.16.1.3用宮頸或尿道拭子，蘸取陰道或包皮沖洗液。9.16.2處理方法9.16.2.1粘液、拭子放于滅菌試管中。8DB11/T677—9.16.2.2制成玻璃觸片。9.17環(huán)境病原微生物9.17.1抽樣地點對于養(yǎng)殖場，抽取墊草、飼料通道、下水道、糞道、遺棄物、通風管；對于孵化廠、屠宰場，抽取有代表性樣品。9.17.2抽樣方法9.17.2.1.1用空氣采樣器直接采集。9.17.2.1.2用平板沉降法，將瓊脂平板置于各采樣點，打開平皿蓋，暴皿于規(guī)定時間后立即蓋好蓋采集。9.17.2.2.1手工采樣，將水樣瓶用鐵架固定，塞住瓶口，待瓶沉入到一定深度時拉開瓶塞，讓水樣進入。9.17.2.2.2用自動采樣器在一定間隔時間中或連續(xù)采集樣品，分別放入樣品瓶或合并于一個樣品瓶中成為混合樣。用滅菌工具先除去地表枯枝落葉，再鏟除1cm左右表層土，以避免地面微生物與土樣混雜，用燒灼過的勺或鏟取土樣約200g～300g，裝于滅菌容器內，混合后送檢。9.17.3處理方法樣品放入專用密封容器內，送實驗室置37℃培養(yǎng)。9.18扁挑體9.18.1抽樣部位抽樣部位為扁桃體。9.18.2抽樣方法打開豬口腔，將采樣槍的采樣鉤緊靠扁桃體，扣動扳機取出扁挑體。10抽樣記錄10.1對所有樣品統(tǒng)一編號，確保統(tǒng)一編號與原始編號相對應，每份樣品上標注唯一標識，疑似人畜共患病樣品還應作特殊標記。10.2記錄應有一式二份的說明單，一份隨樣品送實驗室，另一份留存?zhèn)浒浮?0.3各類動物樣品的記錄，可按照附錄B表B.1～表B.5的格式填寫。11樣品的保存運輸9DB11/T677—11.1樣品送抵實驗室的時間為：冬季不宜超過24h，夏季不宜超過6h，采集后應立即放入4℃左右的容器中冷藏。11.2須冷凍或長期保存的樣品，應置于-20℃以下冷凍，且要盡量避免反復凍融。11.3做病毒中和試驗的血清應避免使用化學防腐劑。11.4運送高致病性病原微生物應按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（中華人民共和國國11.5應避免樣品泄漏。樣品密封后置于保溫箱中運送，并在保溫箱中放置填充物固定樣品，防止容器傾倒。11.6制成的涂片、觸片、玻片兩端用細條隔開，層層疊加，底層和最上一片涂面向內，在保證不被壓碎的條件下運送。11.7在樣品包裝箱上貼標簽并做“上、下”標記箭頭。DB11/T677—附錄A抽樣常用溶液配置蒸鎦水（或無離子水）加至100.0mL。溶解后，以10%檸檬酸調至pH為6.1分裝后，70KPa高壓蒸汽A.2病毒保存緩沖液（0.01mol/L、PH7.2磷酸鹽緩沖鹽水）的配制B液A.330%甘油鹽水緩沖液A.4Earle細胞培養(yǎng)液氯化鈉（NaCl）68.0gDB11/T677—氯化鉀（KCl）4.0g磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)1.4g碳酸氫鈉(NaHCO3)*22.0g葡萄糖10.0g雙蒸水加至500mL溶解后加氯仿1mL作為防腐劑，置0℃~4℃中保存?zhèn)溆谩?為便于調節(jié)pH和避免沉淀，碳酸氫鈉可單獨滅菌，使用前用以調整pH。乙液：氯化鈣（CaCl2）2.0g氯化鎂（MgCl2·6H2O）1.7g0.4%酚紅液0.5mL雙蒸水加至500mL溶解后加氯仿1mL作為防腐劑，置0℃~4℃中保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r按以下比例配成Earle細胞培養(yǎng)液雙蒸水18份以70KPa高壓蒸汽滅菌10min，0℃~4℃中保存?zhèn)溆?。用前?.6%碳酸氫鈉溶液調整pH為充分混合后，加熱溶解，校正pH為7.2～7.4，再用流通蒸氣加熱30min，用濾紙過濾，獲黃色透明液體，分裝于試管或燒瓶中，以100KPa高壓蒸汽滅菌20min。保存于4℃冰箱中備用。A.6磷酸鹽緩沖液（0.04mol/L、pH7.4）A.750%甘油-PBS保存液或4℃冰箱保存。A.8漢克氏（Hanks）液DB11/T677—氯化鉀（KCl）4.0g氯化鈉（NaCl）80.0g硫酸鎂（MgSO4·7H2O）1.0g氯化鎂（MgCl2·6H2O）1.0g混合后加入雙蒸水400mL氯化鈣（CaCl2）1.4g溶于50mL雙蒸水中將上述（1）、（2）兩種溶液混合后，加雙蒸水至500mL，再加氯仿1mL作為防腐劑，放置0℃~4℃中保存。乙液：磷酸氫二鈉（Na2HPO4·7H2O）0.52g磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.6g葡萄糖（C6H12O6·2H2O）10.0g0.4%酚紅液0.5mL將上述甲、乙二溶液混合后，加雙蒸水至500mL，加氯仿1mL，置0℃~4℃中保存。使用時按以下比例配成漢克氏液。乙液：1份雙蒸水18份以100KPa高壓蒸汽滅菌10min。此溶液保存于0℃~4℃,可使用1個月。用前以5.6%碳酸氫鈉液（70kPa高壓蒸汽滅菌10min）調DB11/T677—附錄B抽樣記錄表格表B.1禽類抽樣登記表區(qū)存欄（只）□蛋雞□肉雞□蛋鴨□肉鴨□蛋鵝□肉鵝□蛋鴿□肉鴿□烏雞□鳥□野禽□種場□規(guī)模場□小區(qū)□散養(yǎng)□市場□屠宰場□隔離場□公園□野鳥棲息地□動物園份份份份份份份份份次次次次次次次次2.規(guī)?；輬鲋傅扒荽鏅诔?000只或肉禽存欄超5000只且取得區(qū)級動物防疫部門頒發(fā)的動物防疫合格證。3.樣品序號指采樣管上所標示的號碼。4.疫苗接種類型填寫單價、多價等型。DB11/T677—表B.2豬抽樣登記表區(qū)村存欄（頭）□仔豬□育成豬□育肥豬□經產母豬□后備母豬□公豬□種場□規(guī)模場□小區(qū)□散養(yǎng)□屠宰場□市場□隔離場份份份份份份份次次