第十一章核酸的生物合成

第十一章核酸的生物合成中心法則總結(jié)了生物體內(nèi)遺傳信息得流動(dòng)規(guī)律,揭示遺傳得分子基礎(chǔ)。不僅使人們對(duì)細(xì)胞得生長、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻得認(rèn)識(shí)。而且以這方面得理論和技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了基因工程,給人類得生產(chǎn)和生活帶來了深刻得革命。

蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA中心法則2025/3/202第十一章核酸得生物合成第一節(jié)DNA得生物合成第二節(jié)RNA得生物合成第三節(jié)基因工程及分子生物學(xué)技術(shù)簡介2025/3/203第一節(jié)DNA得生物合成

DNA得復(fù)制(DNA指導(dǎo)下得DNA合成)逆轉(zhuǎn)錄(RNA指導(dǎo)下得DNA得合成)DNA突變DNA得損傷與修復(fù)2025/3/204一、DNA得半保留復(fù)制

(Semi-ConservationReplication)

概念和實(shí)驗(yàn)證據(jù)DNA得復(fù)制得起點(diǎn)和方向與DNA復(fù)制有關(guān)得酶及蛋白質(zhì)因子DNA得半不連續(xù)復(fù)制E、coli、DNA復(fù)制過程真核生物DNA得復(fù)制2025/3/205(一)概念和實(shí)驗(yàn)證據(jù)復(fù)制時(shí),親代DNA雙螺旋解開,然后以每條鏈為模板,按堿基互補(bǔ)原則合成與模板鏈互補(bǔ)得新鏈。結(jié)果新形成得兩個(gè)子代DNA雙螺旋分子中有一條鏈來自親代,另一條就是新合成得,這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。概念子代DNA雙螺旋與親代DNA得堿基順序完全一樣2025/3/206

半保留復(fù)制得實(shí)驗(yàn)證據(jù)1958年Meselson和Stahl用同位素15N標(biāo)記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA得半保留復(fù)制。細(xì)胞培養(yǎng)在15N標(biāo)記培養(yǎng)基中(連續(xù)培養(yǎng)12代,使所有DNA分子均標(biāo)記上15N)轉(zhuǎn)入正常N源(14N)培養(yǎng)基中分離各代DNA,分析其浮力密度2025/3/207CsCL密度梯度離心浮力密度

15N－DNA1、742g/ml14N－DNA1、710g/ml2025/3/208DNA半保留復(fù)制得生物學(xué)意義DNA得半保留復(fù)制表明DNA在代謝上得穩(wěn)定性。因?yàn)榻?jīng)過多代復(fù)制,DNA得多核苷酸鏈仍可以保持完整,并存在于后代而不被分解掉。從而保證親代得遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。

2025/3/209大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)(二)復(fù)制起點(diǎn)、方向和方式1、復(fù)制起點(diǎn)(origin,ori或o,復(fù)制原點(diǎn))原核生物染色體DNA:單復(fù)制起點(diǎn)——整個(gè)染色體只有一個(gè)復(fù)制單位真核生物染色體DNA:多復(fù)制起點(diǎn)——一個(gè)genome中有多個(gè)復(fù)制單位復(fù)制起點(diǎn):復(fù)制開始處DNA分子得特定位置復(fù)制子(Replicon)(復(fù)制單位):從一個(gè)起點(diǎn)到一個(gè)終點(diǎn)所包含得DNA區(qū)域許多生物得復(fù)制起點(diǎn)都就是富含A、T得區(qū)段2025/3/20112、復(fù)制方向及方式大多數(shù)就是雙向得,形成兩個(gè)復(fù)制叉;復(fù)制叉(Replicationfork):染色體中參與復(fù)制得活性區(qū)域,即復(fù)制正在發(fā)生得位點(diǎn)、復(fù)制叉上分布著許多與復(fù)制有關(guān)得酶和輔助因子真核染色體DNA線環(huán)狀雙鏈E、coli染色體DNA環(huán)狀雙鏈復(fù)制眼(replicationeye):電子顯微鏡下觀察正在復(fù)制得DNA,復(fù)制得區(qū)域形如一只眼睛2025/3/2012復(fù)制過程中SV40DNA分子得電鏡照片2025/3/2013目前已發(fā)現(xiàn)30多種酶及蛋白質(zhì)因子參與DNA復(fù)制(三)與DNA復(fù)制有關(guān)得酶及蛋白質(zhì)因子(1)DNA聚合酶(DNApolymerases)(2)引物酶(peimase)和引發(fā)體(primosome)(3)DNA連接酶(DNAligase)(4)解螺旋酶(DNAhelicase)(5)DNA旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)(6)單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)2025/3/2014NucleophilicattackThemostaccuratetypeofenzyme、⑴DNA聚合酶⑵DNA模板(反轉(zhuǎn)錄時(shí)用RNA模板)⑶引物(RNA、DNA,3,-羥基)⑷4種dNTP⑸Mg2+

1、DNA聚合酶和DNA得聚合反應(yīng)鏈生長方向5,→3,2025/3/2015在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)主要有三種DNA聚合酶,分別為:DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ

E、coliDNA聚合酶2025/3/2016

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ

亞基數(shù)目1(單體酶)多亞基酶多亞基酶5’→3’聚合活性+中+很低+很高3‘→5’外切活性+++5‘→3’外切活性+—+2025/3/20175’→3’聚合酶活性DNApolⅢ－－復(fù)制中新鏈得延長子鏈DNA延伸方向只能就是5’→3’2025/3/20183′3′5′5′錯(cuò)配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點(diǎn)3’→5’外切酶活性切除單鏈DNA3’-末端核苷酸,而對(duì)雙鏈DNA不起作用聚合過程中,若新加入得核苷酸不對(duì),DNApolⅢ－3’→5’外切酶得活性可將其除去(校對(duì)功能,提高DNA復(fù)制保真性)。2025/3/20195’→3’外切酶活性

從雙鏈DNA一條鏈得5’末端開始水解下單核苷酸或寡核苷酸。DNApolⅠ－－切除RNA引物(5’→3’外切酶活性)填補(bǔ)其留下得空隙(5’→3’聚合酶活性)2025/3/2020DNA聚合酶Ⅰ

DNA聚合酶Ⅱ

DNA聚合酶Ⅲ

DNA復(fù)制時(shí)5’→3’外切酶活性切除RNA引物,5’→3’聚合酶活性填補(bǔ)其留下得空隙;DNA損傷修復(fù);DNA損傷修復(fù)(紫外光引起)DNA復(fù)制得主要酶——5’→3’聚合活性催化鏈得延長3’→5’外切酶活性得校對(duì)功能2025/3/2021DNA聚合酶Ⅲ全酶由10種亞基組成,分子量830KD;

2025/3/2022α、ε和θ三種亞基組成核心酶,核心酶形成二聚體β-亞基猶如一個(gè)夾子夾住DNA分子,并向前滑動(dòng),使DNA聚合酶在完成復(fù)制前不再脫離DNA2025/3/20232、DNA連接酶(ligase)所需條件:a、DNA雙鏈切口得3’－OH和5’－P相鄰b、切口各自堿基處于配對(duì)狀態(tài)c、需要能量原核(NAD)真核(ATP)2025/3/2024酶-AMPAMP-P-5’-DNA2025/3/2025(四)DNA得半不連續(xù)復(fù)制3‘5‘3‘5‘問題得提出:

5’→3’鏈就是如何作為模板復(fù)制?1968年岡崎提出DNA不連續(xù)復(fù)制模型2025/3/20263‘5‘3‘5‘前導(dǎo)鏈(leadingstrand):DNA復(fù)制時(shí),與復(fù)制叉向前移動(dòng)得方向一致,一條模板鏈就是3’

→5’走向,與之互補(bǔ)得新鏈能以5’

→3’得方向連續(xù)合成。滯后鏈(laggingstrand):另一條模板鏈就是5’

→3’走向,與其互補(bǔ)得新鏈也就是5’

→3’方向合成,但與復(fù)制叉移動(dòng)方向正好相反,所以隨復(fù)制叉得移動(dòng),形成許多不連續(xù)得片段,最后連成一條完整得DNA鏈。岡崎片段(Okazakifragment):DNA復(fù)制不連續(xù)合成鏈中形成得短DNA片段,每個(gè)岡崎片段得合成也都需要引物。半不連續(xù)復(fù)制岡崎片段合成后由DNA聚合酶Ⅰ切除RNA引物并催化合成一段DNA填補(bǔ)留下得空隙。再由DNA連接酶把她們連成一條完整得子代鏈,稱為滯后鏈。2025/3/2028(五)

E、coli、染色體DNA復(fù)制過程起始延伸終止2025/3/20291、起始大腸桿菌復(fù)制得起點(diǎn)由245個(gè)bp構(gòu)成,其序列很保守,有兩組短得重復(fù):3個(gè)13bp得序列和4個(gè)9bp得序列2025/3/2030涉及主要酶系2025/3/203120個(gè)DnaA結(jié)合在四組9bp重復(fù)區(qū),形成起始復(fù)合物,DNA環(huán)繞此復(fù)合物。三組13bp重復(fù)區(qū)依次變性,產(chǎn)生開放型復(fù)合物。DnaB(解螺旋酶)在DnaC協(xié)助下與開放復(fù)合物結(jié)合,進(jìn)一步解鏈。解鏈時(shí)帶來得扭曲張力還需DNA旋轉(zhuǎn)酶(屬DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ)引入負(fù)超螺旋消除。2025/3/2032單鏈結(jié)合蛋白(SSB)結(jié)合在單鏈區(qū),阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈DNA不被核酸酶降解引發(fā)體:引物合成酶與各種蛋白質(zhì)因子構(gòu)成得復(fù)合體(引發(fā)體),以DNA為模板合成RNA引物(6-10個(gè)堿基)2025/3/20332、延伸前導(dǎo)鏈只需要一個(gè)RNA引物,隨后鏈得每一個(gè)岡崎片段都需要一個(gè)RNA引物鏈得延長反應(yīng)由DNApol、Ⅲ催化。復(fù)制體:在DNA合成得生長點(diǎn)(既復(fù)制叉上)分布著許多與復(fù)制有關(guān)得酶和輔助因子,她們?cè)贒NA得模板鏈形成離散得復(fù)合物,彼此配合進(jìn)行高度精確得復(fù)制。2025/3/2034復(fù)制體沿著復(fù)制叉方向前進(jìn),同時(shí)進(jìn)行前導(dǎo)鏈和滯后鏈得合成。一分子得DNApolIII、協(xié)同合成前導(dǎo)鏈和滯后鏈,因此滯后鏈必須繞成一個(gè)突環(huán)。5’3’3’5’2025/3/20353、DNA合成得終止E

E、coli有兩個(gè)終止區(qū)域,分別結(jié)合專一性得終止蛋白——

tus序列一:terEterDterA序列二:terFterBterC2025/3/2036每個(gè)區(qū)域只對(duì)一個(gè)方向得復(fù)制叉起作用每次復(fù)制時(shí)只使用一個(gè)終止位點(diǎn)終止蛋白通過抑制DNA解旋酶而發(fā)揮終止作用兩個(gè)復(fù)制叉在終止區(qū)相遇而停止復(fù)制,復(fù)制體解體,期間大約有50-100bp未被復(fù)制。其后兩條親代鏈解開,同過修復(fù)方式填補(bǔ)空缺,此時(shí)兩環(huán)狀染色體互相纏繞,成為連鎖體由拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ切開,再連接,使兩個(gè)連鎖得DNA雙鏈彼此分開2025/3/2038⑴DNA解螺旋酶解開雙鏈DNA。⑵SSB結(jié)合于DNA單鏈。⑶DNA旋轉(zhuǎn)酶引入負(fù)超螺旋,消除復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)帶來得扭曲張力。⑷DNA引物酶(在引發(fā)體中)合成RNA引物。⑸DNApol、Ⅲ在兩條新生鏈上合成DNA。⑹DNApolⅠ切除RNA引物,并補(bǔ)上DNA。⑺DNAligase連接一個(gè)岡崎片段。小結(jié)2025/3/2039(六)真核生物染色體DNA得復(fù)制真核和原核DNA復(fù)制比較α、β、γ、δ、εδ負(fù)責(zé)核DNA得復(fù)制γ負(fù)責(zé)線粒體DNA得復(fù)制2025/3/2040真核生物染色體DNA復(fù)制過程中組蛋白得裝配核小體得結(jié)構(gòu)(200bp左右)在真核生物得復(fù)制子上,親代染色體得核小體被逐個(gè)打開,組蛋白以完整得八聚體形式直接轉(zhuǎn)移到子代DNA得前導(dǎo)鏈上,新合成得組蛋白與后隨鏈組裝成核小體。因此,DNA得復(fù)制就是半保留得,而組蛋白則就是全保留得。2025/3/2041真核生物染色體DNA末端復(fù)制得問題

真核生物線狀染色體在復(fù)制最后,5’末端RNA引物被切除后,無法向原核那樣填補(bǔ)空缺,如果沒有特殊得機(jī)制合成末端序列,將造成5’末端序列縮短,染色體就會(huì)在細(xì)胞傳代中變得越來越短。通過端粒酶催化形成端粒結(jié)構(gòu)來解決解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物2025/3/2042端粒酶:含有RNA和蛋白質(zhì)(起DNA聚合酶得作用)兩種組分,RNA分子約150bp,含有于重復(fù)端粒結(jié)構(gòu)互補(bǔ)得一個(gè)片段,可作為端粒鏈合成得模板。端粒(telomeres):就是真核細(xì)胞染色體末端所特有得結(jié)構(gòu),有許多串(1000串或更多)短得重復(fù)序列組成,通常3’末端鏈就是富含G得短序列2025/3/2043端粒(telomeres):就是真核細(xì)胞染色體末端所特有得結(jié)構(gòu),有許多串(1000串或更多)短得重復(fù)序列組成,通常3’末端鏈就是富含G得短序列,如人就是TTAGGG,而且該鏈具有12-16個(gè)核苷酸得單鏈突出端,可作為隨后鏈最后一個(gè)岡崎片段得引物模板。功能:⑴保證線性DNA得完整復(fù)制⑵保護(hù)染色體末端⑶決定細(xì)胞壽命5’5’3’3’5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶2025/3/2044端粒酶(telomerase):端粒末端得重復(fù)序列就是通過端粒酶將其加到染色體末端。端粒酶含有RNA和蛋白質(zhì)(起DNA聚合酶得作用)兩種組分,RNA分子約150bp,含有與重復(fù)端粒結(jié)構(gòu)互補(bǔ)得一個(gè)片段,可作為端粒鏈合成得模板。端粒酶可通過5’端于染色體得3’端互補(bǔ)結(jié)合,以自身為模板使DNA3’末端延伸,合成一個(gè)重復(fù)單位后,再向前移動(dòng)一個(gè)單位。端粒得3’末端又可回折,作為引物,合成其互補(bǔ)鏈。端粒酶類似于逆轉(zhuǎn)錄酶,她只合成與酶自身得RNA模板互補(bǔ)得DNA片段。動(dòng)物得生殖細(xì)胞中由于端粒酶得存在,端粒一直保持一定得長度。但體細(xì)胞隨著分化而失去端粒酶活性,這樣細(xì)胞連續(xù)分裂,使端粒不斷縮短一定程度時(shí),細(xì)胞就停止生長。惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶表達(dá)多。

2025/3/2045端粒合成得一種模型3′5′TTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3′5′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3′5′AATTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和雜交移位和再雜交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5′3′nAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTCCCCTnAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn進(jìn)一步加工繼續(xù)延伸2025/3/2046DNA得半保留復(fù)制

概念和實(shí)驗(yàn)證據(jù)DNA得復(fù)制得起點(diǎn)和方向與DNA復(fù)制有關(guān)得酶及蛋白質(zhì)因子DNA得半不連續(xù)復(fù)制E、coli、DNA復(fù)制過程真核生物DNA得復(fù)制小結(jié)2025/3/2047二、

RNA指導(dǎo)得DNA合成(逆轉(zhuǎn)錄)逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription):以RNA為模板,在逆轉(zhuǎn)錄酶得作用下,生成DNA得過程。2025/3/20481970年,Temin和Baltimore分別從勞氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒(致癌RNA病毒)中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。所有已知得致癌RNA病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶,因此被稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA指導(dǎo)得DNA得合成需要:模板:RNA引物:RNA或DNA底物:dNTP二價(jià)陽離子:Mg2+或Mn2+沿5’→3’方向合成DNA(一)逆轉(zhuǎn)錄酶

2025/3/2049(1)RNA指導(dǎo)得DNA聚合酶活力(以RNA為模板,合成一條互補(bǔ)得DNA,形成RNA—DNA雜種分子)。(2)RNaseH酶活力,水解RNA—DNA雜種分子中得RNA,可沿3’→5’和5’→3’兩個(gè)方向起外切酶作用。(3)DNA指導(dǎo)得DNA聚合酶活力。具有三種酶活力2025/3/2050(1)病毒粒子侵染宿主細(xì)胞,病毒RNA和逆轉(zhuǎn)錄酶一起進(jìn)入細(xì)胞。(2)RNA被逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA(cDNA),進(jìn)入細(xì)胞核。(

RNA5’端帶有1分子得宿主tRNA,作為逆轉(zhuǎn)錄時(shí)得引物。(3)逆轉(zhuǎn)錄病毒得DNA整合到宿主染色體DNA中(前病毒)。(4)前病毒DNA隨宿主染色體DNA進(jìn)行復(fù)制,轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生基因組RNA(mRNA),翻譯出病毒蛋白(病毒RNA無翻譯活性)。(5)基因組RNA和病毒蛋白在胞質(zhì)中組裝成新病毒粒子,轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜,通過出芽方式釋放新病毒粒子。(二)

逆轉(zhuǎn)錄病毒得生活周期2025/3/2051RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯整合入宿主細(xì)胞染色體DNA進(jìn)入細(xì)胞丟失被膜丟失衣殼逆轉(zhuǎn)錄RNARNAcDNA衣殼蛋白被膜蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶(二)

逆轉(zhuǎn)錄病毒得生活周期當(dāng)致癌RNA病毒侵染宿主細(xì)胞時(shí),病毒RNA及逆轉(zhuǎn)錄酶一起進(jìn)入宿主細(xì)胞,病毒自身帶入得逆轉(zhuǎn)錄酶使RNA逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA。2025/3/2052依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴DNA的DNA聚合酶(三)逆轉(zhuǎn)錄過程以病毒(+)RNA為模板,合成互補(bǔ)得(-)DNA。

切除RNA—DNA雜種分子中得RNA

以(-)DNA鏈為模板,合成(+)DNA鏈2025/3/2053三、DNA得突變

概念:DNA分子中得核苷酸序列發(fā)生突然而穩(wěn)定得改變,從而導(dǎo)致DNA得復(fù)制以及后來得轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物隨之發(fā)生變化,表現(xiàn)出異常得遺傳特性,稱為DNA得突變。產(chǎn)生:DNA在復(fù)制中可能產(chǎn)生錯(cuò)配,但自然條件下發(fā)生得突變率非常低某些物理化學(xué)因素,如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑(烷化劑、堿基類似物)等2025/3/2054

突變得類型

堿基對(duì)得置換(substitution)轉(zhuǎn)換:兩種嘌呤或兩種嘧啶之間互換(常見)顛換:嘌呤與嘧啶或嘧啶與嘌呤之間互換

移碼突變(framesshiftmutation)2025/3/2055-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-轉(zhuǎn)換

-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入A

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失T野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對(duì)得置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)2025/3/2056四、DNA得損傷與修復(fù)在一定條件下,生物體能使DNA得損傷得到修復(fù):暗修復(fù)(1)光裂合酶修復(fù)(2)切除修復(fù)(3)重組修復(fù)(4)誘導(dǎo)修復(fù)(SOS修復(fù))2025/3/2057光復(fù)合酶特異地和嘧啶二聚體結(jié)合DNA紫外線損傷得光裂合酶修復(fù)酶被可見光激活修復(fù)后酶被釋放2025/3/2058切除修復(fù)一般DNA得兩條鏈只有一條受損傷,在一系列酶得作用下可將損傷部分切除,根據(jù)互補(bǔ)鏈得序列對(duì)其進(jìn)行修復(fù)。2025/3/2059DNA得重組修復(fù)就是復(fù)制后得修復(fù)DNA鏈得損傷并未除去胸腺嘧啶二聚體2025/3/2060SOS修復(fù)

為DNA得損傷所誘導(dǎo),而產(chǎn)生缺乏校對(duì)功能得DNA聚合酶,她能在DNA損傷部位進(jìn)行復(fù)制而避免了死亡,可就是卻帶來了高得突變率,這屬于傾向差錯(cuò)得修復(fù)。2025/3/2061第二節(jié)RNA得生物合成2025/3/2062轉(zhuǎn)錄(transcription):以一段DNA得遺傳信息為模板,在RNA聚合酶作用下,合成出對(duì)應(yīng)得RNA得過程,或在DNA指導(dǎo)下合成RNA。轉(zhuǎn)錄得不對(duì)稱性:在RNA得合成中,DNA得二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄得模板,稱為轉(zhuǎn)錄得不對(duì)稱性。反義鏈(非編碼鏈,負(fù)鏈):在RNA得轉(zhuǎn)錄中,用作模板得DNA鏈稱為反義鏈。有義鏈(編碼鏈,正鏈)在RNA得轉(zhuǎn)錄中,不作為模板得DNA鏈稱為有義鏈。一、

DNA指導(dǎo)得RNA合成(轉(zhuǎn)錄)2025/3/2063轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物:mRNA、rRNA、tRNA、小RNA基因表達(dá)得產(chǎn)物就是RNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄起始于DNA模板得一個(gè)特定位點(diǎn),并在另一位點(diǎn)終止,此轉(zhuǎn)錄區(qū)域稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位可以就是一個(gè)基因(真核)——單順反子mRNA,也可以就是多個(gè)基因(原核)——多順反子mRNA。2025/3/2064RNA合成得基本特征:①底物:NTP(ATP、GTP、CTP、UTP)②RNA鏈生長方向:5’→3’③不需引物④需DNA模板

(一)RNA聚合酶2025/3/2065RNA聚合酶催化得反應(yīng)ACGACGUU模板DNA5′3′5′3′新合成RNA2025/3/2066E、coli和其她原核細(xì)胞一樣,只有一種RNA聚合酶,合成各種RNA(mRNA、tRNA、rRNA)。E、coliRNA聚合酶全酶分子量46萬Da,由六個(gè)亞基組成,α2ββ’σω,另有兩個(gè)Zn2+。無σ亞基得酶叫核心酶,核心酶只能使已開始合成得RNA鏈延長,而不具備起始合成活性,加入σ亞基后,全酶才具有起始合成RNA得能力,因此,σ亞基稱為起始因子。E、coliRNA聚合酶(原核)2025/3/2067(二)E、coli轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄起始鏈得延伸轉(zhuǎn)錄終止2025/3/2068RNA得合成不需要引物。由RNA聚合酶σ亞基識(shí)別DNA分子上得起始信號(hào)(啟動(dòng)子)

啟動(dòng)子(Promoter):指RNA聚合酶能識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄得一段DNA序列,原核生物得啟動(dòng)子約含40-60個(gè)堿基對(duì)。1、轉(zhuǎn)錄起始2025/3/20695’3’T原核生物啟動(dòng)子三個(gè)功能部位3’編碼鏈TATA框(Pribnow框)Sextama框轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)RNA聚合酶識(shí)別信號(hào)有助于DNA雙鏈解開2025/3/2070RNA聚合酶全酶通過σ亞基識(shí)別啟動(dòng)子并與之結(jié)合誘導(dǎo)富含AT得-10區(qū)解鏈,然后進(jìn)一步擴(kuò)大成17個(gè)核苷酸長度得泡狀物,RNA聚合酶開始轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶全酶掃描解鏈區(qū),找到起始點(diǎn),不需要引物,然后根據(jù)模板鏈得堿基序列選擇第1個(gè)和第2個(gè)核苷酸,合成第1個(gè)磷酸二酯鍵。RNA鏈大多以pppA或pppG開始,占90%。這時(shí)所形成得啟動(dòng)子、全酶和RNA鏈得復(fù)合物稱為三元起始復(fù)合物。2025/3/2071三元復(fù)合物形成后,σ亞基就會(huì)被釋放脫離核心酶。2025/3/20722、RNA鏈得延伸核心酶構(gòu)象改變,與DNA結(jié)合比較松弛,可沿DNA模板3’→5’方向移動(dòng),繼續(xù)解開雙連,并按模板順序選擇下一個(gè)核苷酸,將核苷三磷酸加到前一個(gè)得3’-OH端,故轉(zhuǎn)錄方向從5’3’。新合成得RNA與模板鏈形成RNA-DNA雜交區(qū)。2025/3/20733、轉(zhuǎn)錄終止終止轉(zhuǎn)錄得特殊堿基順序——終止子(terminators)DNA得終止子可被RNA聚合酶本身或其終止因子識(shí)別。使RNA聚合酶停止合成RNA并釋放出RNA。終止因子:協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止子得蛋白質(zhì)輔助因子,如ρ因子。大腸桿菌有兩類終止子:(1)不依賴于ρ因子得終止子(2)依賴ρ因子得終止子2025/3/2074不依賴于ρ因子得終止子有2個(gè)特征:①在DNA中有在終止點(diǎn)之前都有一個(gè)回文結(jié)構(gòu),其轉(zhuǎn)錄本形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),且柄部富含G

C堿基對(duì)。②大約有6個(gè)連續(xù)得As,她轉(zhuǎn)錄成Us。模板鏈5‘3‘3‘5‘富含AT區(qū)CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTGGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAA回文結(jié)構(gòu)富含GC區(qū)轉(zhuǎn)錄方向2025/3/2075寡聚U序列可能提供信號(hào)使RNA聚合酶脫離模板。依賴ρ得終止子,必需在ρ因子存在時(shí),才發(fā)生終止作用。終止點(diǎn)前無寡聚U序列,回文對(duì)稱區(qū)不富含GC。2025/3/20762025/3/2077RNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)延長階段5

3

RNA啟動(dòng)子(promoter)終止子(terminator)5

RNA聚合酶

5

3

5

3

5

5

3

離開2025/3/2078基本原則與原核相似,但真核基因得轉(zhuǎn)錄更復(fù)雜。RNA聚合酶不相同啟動(dòng)子有三類,分別由RNA聚合酶I、II、III進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。真核生物得啟動(dòng)子由轉(zhuǎn)錄因子,而不就是RNA聚合酶識(shí)別,轉(zhuǎn)錄因子:RNA聚合酶在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí),常需要一些輔助因子(蛋白質(zhì))參與作用,此類蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子。多種轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶在起點(diǎn)形成前起始復(fù)合物,起始轉(zhuǎn)錄。(三)真核生物得轉(zhuǎn)錄2025/3/2079產(chǎn)物α-鵝膏蕈堿對(duì)酶的作用酶類分布反應(yīng)條件ⅡIⅢ核仁核質(zhì)核質(zhì)rRNAmRNAtRNA不抑制低濃度抑制高濃度抑制低離子強(qiáng)度,要求Mg2+或Mn2+高離子強(qiáng)度高M(jìn)n2+濃度分子量都在50萬左右

真核生物RNA聚合酶2025/3/2080轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制的異同：

相同：要有模板，新鏈延伸方向5’→3’，堿基的加入嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則。

相異：①復(fù)制需要引物，轉(zhuǎn)錄不需引物。

②轉(zhuǎn)錄時(shí)，模板DNA的信息全保留，復(fù)制時(shí)模板信息是半保留。

③轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶只有5’→3’聚合作用，無5’→3’及3’→5’外切活性。

相同:要有模板,新鏈延伸方向5’→3’,堿基得加入嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則。轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制得比較2025/3/2081DNA合成RNA合成合成部位細(xì)胞核核仁:rRNA核質(zhì):mRNA、tRNA底物脫氧核苷三磷酸核苷三磷酸模板DNA得兩條鏈DNA得一條鏈酶DNA聚合酶RNA聚合酶引物RNA做引物不需要引物鏈延長方向5’-3’5’-3’合成方式半保留復(fù)制全保留轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雙鏈DNA單鏈RNADNA和RNA合成得比較相異:2025/3/2082(四)RNA生物合成得抑制劑RNA聚合酶得抑制物——利福霉素和利鏈菌素(原核)、α-鵝膏蕈堿(真核)嘌呤和嘧啶類似物——6-巰基嘌呤、8-氮鳥嘌呤、5-氟尿嘧啶、6-氮尿嘧啶等可通過抑制核苷酸得合成,抑制RNA生物合成

DNA模板功能得抑制劑——烷化劑、

放線菌素D、嵌入染料(溴化乙錠、吖啶類染料)能與DNA結(jié)合,使DNA失去模板功能,從而抑制其復(fù)制與轉(zhuǎn)錄2025/3/2083RNA聚合酶合成得原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,要經(jīng)過剪切、修飾、拼接等過程,才能轉(zhuǎn)變成成熟得RNA分子,此過程稱RNA轉(zhuǎn)錄后得加工。(五)

RNA轉(zhuǎn)錄后得加工2025/3/20841,2and3isRNaseIII,RNaseP,andRNaseE甲基化切割原核生物rRNA前體得加工(E、coli)原核生物rRNA基因與某些tRNA基因組成混合操縱子2025/3/2