生物分離知識(shí)點(diǎn)

1緒論生物產(chǎn)品要求高質(zhì)量：純度、衛(wèi)生、生物活性方法選擇的基本原則1)、盡可能簡(jiǎn)單、低耗、高效、快速2)、分離步驟盡可能少。3)、避免相同原理的分離技術(shù)多次重復(fù)出現(xiàn)4)、盡量減少新化合物進(jìn)入待分離的溶液。A)、引起新的化學(xué)污染；B)蛋白質(zhì)的變性失活5)合理的分離步驟次序。原則是：先低選擇性，后高選擇性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。設(shè)計(jì)前應(yīng)了解的信息1）、在設(shè)計(jì)前，首先要掌握的產(chǎn)物物化性質(zhì)，主要包括：(1)、溶解度及影響因素，包括溫度、pH值、有機(jī)溶劑和鹽等；(2)、分子量和分子形狀。對(duì)于高分子物質(zhì)非常有意義；(3)、沸點(diǎn)和蒸汽壓。對(duì)于熱穩(wěn)定的小分子物質(zhì)非常有意義；(4)、極性大小；(5)、分子電荷及影響因素，包括pH值和鹽等；(6)、功能團(tuán)。功能團(tuán)為萃取劑和特異性吸附的選擇提供依據(jù)；(7)、免疫原性。設(shè)計(jì)親和色譜；(8)、穩(wěn)定性及其影響因素，包括溫度、pH值、毒性試劑等(如青霉素低pH不穩(wěn)定)；(9)、分子的淌度及影響因素，包括pH值、離子強(qiáng)度和鹽等；(10)、等電點(diǎn)pI；2）、成品規(guī)格（或產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)）3）、進(jìn)料的組成和物性(1)、目的產(chǎn)物的濃度。(2)、物料中的與目的產(chǎn)物相近物質(zhì)組成的物理化學(xué)性質(zhì)。(3)、目的產(chǎn)物的定位。(4)、菌種的種類(lèi)和形態(tài)。(5)、微生物的含量和發(fā)酵液的黏度。4）、生產(chǎn)規(guī)模5）、危害性5）、危害性(1)、離心產(chǎn)生的氣溶膠、發(fā)酵產(chǎn)生的廢氣、干燥產(chǎn)生的粉塵等。(2)、目的產(chǎn)物本身的危害性；抗腫瘤代謝類(lèi)藥物，類(lèi)固醇類(lèi)抗生素，激素類(lèi)藥物等。(3)、試劑危害。萃取試劑CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。(4)、微生物的危害。重組DNA工程菌不能任意排放。這一菌種為新的物種，不能排除對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人的危害。6）、分批分離還是連續(xù)純化對(duì)環(huán)境的考慮1）、廢水

A、除菌過(guò)濾和滅菌處理；B、符合BOD的要求；2）、廢料

A、滅菌處理；B、綜合利用：動(dòng)物飼料、飼料添加劑，有機(jī)肥料3）、廢氣

A、除菌過(guò)濾和滅菌處理；B、廢氣（有機(jī)溶劑）回收4）、溶劑的回收

A、減少環(huán)境排放，減少污染；B、循環(huán)利用，減低成本1.4生物分離技術(shù)和原理物質(zhì)分離的本質(zhì)是識(shí)別混合物中不同溶質(zhì)間物理、化學(xué)和生物性質(zhì)的差別，利用能識(shí)別這些差別的分離介質(zhì)和擴(kuò)大這些差別的分離設(shè)備實(shí)行溶質(zhì)間的分離或目標(biāo)組分的純化。性質(zhì)不同的溶質(zhì)在分離操作中具有不同的傳質(zhì)速率和（或）平衡狀態(tài)，從而實(shí)行分離。平衡分離定義：根據(jù)溶質(zhì)在兩相間分配平衡的差異實(shí)現(xiàn)分離。溶質(zhì)達(dá)到分配平衡的推動(dòng)力僅取決于系統(tǒng)的熱力學(xué)性質(zhì)。溶質(zhì)達(dá)到相間平衡的過(guò)程為擴(kuò)散傳質(zhì)過(guò)程，平衡分離又稱(chēng)擴(kuò)散分離。蒸餾、蒸發(fā)、吸收、萃取、結(jié)晶（沉淀）、泡沫分離、吸附和離子交換等是典型的平衡分離過(guò)程。差速分離定義：利用外力驅(qū)動(dòng)溶質(zhì)遷移產(chǎn)生的速度差進(jìn)行分離的方法。傳統(tǒng)的機(jī)械分離方法：過(guò)濾、重力沉降、離心沉降典型的差速分離法：超濾、反滲析、電滲析、電泳和磁泳非蛋白類(lèi)雜質(zhì)的去除（1）DNAA陰離子交換（pH4.0)B親和層析（不被吸附）C疏水層析（2）熱原（蛋白質(zhì)溶液中的去熱原）A

生產(chǎn)過(guò)程無(wú)菌

B

所有層析介質(zhì)無(wú)菌C所用溶液無(wú)菌

D親和層析（多粘菌素）（3）去病毒A

加熱（60C)B

過(guò)濾

C

滅活劑2細(xì)胞分離與破碎預(yù)處理的目的:改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)

(黏度、顆粒大小、顆粒穩(wěn)定性等)，固液分離速度，分離器分離效率；目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移其中一相(多數(shù)為液相)；1、加熱最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)的預(yù)處理方法是加熱，加熱不僅可以增加料液的操作特性，也可以對(duì)其進(jìn)行滅菌。但加熱變性的方法只適合于對(duì)熱穩(wěn)定性的產(chǎn)物。加熱可產(chǎn)生：ˉ黏度、促凝聚、ˉ固體成分體積、破壞凝膠結(jié)構(gòu)、增加空隙率、去蛋白2、調(diào)pH值：方法簡(jiǎn)單有效、成本低廉pH直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH可改善其過(guò)濾特性。對(duì)于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)作為雜質(zhì)存在于液體中時(shí)，常采用調(diào)pH至等電點(diǎn)使兩性物質(zhì)沉淀。

另外，在膜分離中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，常通過(guò)調(diào)整pH，改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，以減少吸附造成的堵塞和污染。此外，細(xì)胞、細(xì)胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個(gè)pH下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于固液分離。3、凝聚和絮凝通過(guò)電解質(zhì)的加入促進(jìn)原始溶液的凝聚和絮凝主要作用為增大混合液中懸浮粒子的體積，提高固液分離速度，同時(shí)可除去一些雜質(zhì)。凝聚和絮凝是兩種方法，兩個(gè)概念。凝聚：指在投加的化學(xué)物質(zhì)（鋁、鐵的鹽類(lèi)或石灰等）作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成１mm大小塊狀凝聚體的過(guò)程。絮凝：指使用絮凝劑（天然的和合成的大分子量聚電解質(zhì)）將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團(tuán)的過(guò)程。其中絮凝劑主要起架橋作用。凝聚：膠體粒子(10-100nm)中性鹽促進(jìn)下脫穩(wěn)相互聚集成大粒子（1mm）

機(jī)理：a中和粒子表面電荷b消除雙電層結(jié)構(gòu)絮凝：大分子聚電解質(zhì)將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成絮凝團(tuán)的過(guò)程

機(jī)理：架橋作用凝聚和絮凝技術(shù)能有效的改變細(xì)胞菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài),使其聚集起來(lái),增大體積以便固液分離,常用于菌體細(xì)小而且黏度大的發(fā)酵液的預(yù)處理中.發(fā)酵液的帶電現(xiàn)象發(fā)酵液中的細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷，帶電的原因很多，主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。通常發(fā)酵液中細(xì)胞或菌體帶有負(fù)電荷，由于靜電引力的作用使溶液中帶相反電荷的粒于（即正離子）被吸附在其周?chē)诮缑嫔闲纬闪穗p電層。4、惰性助濾劑：一種顆粒均勻、質(zhì)地堅(jiān)硬的粒狀物質(zhì)，用于擴(kuò)大過(guò)濾表面的適應(yīng)范圍，減輕細(xì)小顆粒的快速擠壓變形和過(guò)濾介質(zhì)的堵塞。使用方法：A、預(yù)涂層；B、按一定比率混合。助濾劑種類(lèi)：硅藻土、膨脹珍珠巖、石棉、纖維素、未活化的炭、爐渣、重質(zhì)碳酸鈣，及它們的混合物等。用量標(biāo)準(zhǔn)：A、單位質(zhì)量助濾劑所產(chǎn)生的最大濾液產(chǎn)量(最常用)；B、或最長(zhǎng)周期；C、或最快流速；D、或?yàn)V餅的最大空間利用度。5．加入反應(yīng)劑有時(shí)加入某些不影響目的產(chǎn)物的反應(yīng)劑，可消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對(duì)過(guò)濾的影響，從而提高過(guò)濾速率。加入反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類(lèi)發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，如CaSO4、磷酸鋁等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠狀物和懸浮物凝固，從而改善過(guò)濾性能。1.無(wú)機(jī)離子的去除Ca2+離子濃度較高時(shí)，可采用可溶性鹽，如草酸鈉等Mg2+離子的去除一般采用加入三聚磷酸鈉磷酸鹽處理，也能大大降低Ca2+、Mg2+離子的濃度鐵離子，可加入黃血鹽，使其形成普魯士藍(lán)沉淀而除去2．雜蛋白的去除用各種沉淀方法，可以去除液相中各種蛋白質(zhì)。常用的有等電點(diǎn)沉淀法、變性沉淀法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、反應(yīng)沉淀法等。這些沉淀方法既可以作為除雜質(zhì)的方法，也可以作為提取目標(biāo)產(chǎn)物的技術(shù)手段。3．多糖的去除酶解法可將混合液中的不溶性多糖物質(zhì)酶解，使其轉(zhuǎn)化為溶解度較大的單糖，從而改變流體的流動(dòng)特性，提高過(guò)濾速率。4．有色物質(zhì)的去除發(fā)酵液中有色物質(zhì)可能是由于微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程分泌的，也可能是培養(yǎng)基（如糖蜜、玉米漿等）帶來(lái)的，色素物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的多樣性增加了脫色的難度。

色素物質(zhì)的去除，一般以使用離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維、活性炭等材料的吸附法來(lái)脫色最為普遍。例如活性炭可用于檸檬酸發(fā)酵液的脫色，鹽型強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂可用于解朊酶和果膠酶溶液的脫色，磷酸型陰離子交換樹(shù)脂被用于谷氨酸發(fā)酵液的脫色等。一般發(fā)酵液的脫色往往是在過(guò)濾除去菌體后進(jìn)行。2.1

細(xì)胞分離顆粒的沉降當(dāng)一固體微粒通過(guò)無(wú)限連續(xù)介質(zhì)時(shí)，它的運(yùn)動(dòng)速度受兩種力的影響：一是微粒受到因微粒和流體介質(zhì)間密度不同而產(chǎn)生的浮力作用；二是微粒所受到的流體阻力作用。根據(jù)沉降作用力可分為：重力沉降、離心沉降根據(jù)沉降粒子間相互影響程度可分為：自由沉降和干擾沉降2.1.1重力沉降（1）球形顆粒的自由沉降速度以重力的方向?yàn)檎较蝾w粒做勻速運(yùn)動(dòng)，沉降速度恒定不變，該速度稱(chēng)為自由沉降速度自由沉降條件：①顆粒為球形；②顆粒沉降時(shí)彼此相距較遠(yuǎn)，互不干擾；③容器壁對(duì)沉降的阻滯作用可以忽略；④顆粒直徑不能小到受流體分子運(yùn)動(dòng)的影響。在實(shí)際情況中還需考慮以下因素的影響：①干擾沉降；

②端效應(yīng)；

③分子運(yùn)動(dòng)；

④非球形；

⑤液滴或氣泡的運(yùn)動(dòng)。2.1.2

離心沉降P142.1.3過(guò)濾概念

過(guò)濾是在外力作用下，利用過(guò)濾介質(zhì)使懸浮液中的液體通過(guò)，而固體顆粒被截留在介質(zhì)上，從而實(shí)現(xiàn)固液分離的一種單元操作。過(guò)濾介質(zhì)具有多孔結(jié)構(gòu)，可以截留固體物質(zhì)，而讓液體通過(guò)；我們把待過(guò)濾的懸浮液成為濾漿，而過(guò)濾后分離出的固體稱(chēng)為濾渣或?yàn)V餅，通過(guò)過(guò)濾介質(zhì)的液體稱(chēng)為濾液（1）過(guò)濾介質(zhì)：過(guò)濾介質(zhì)應(yīng)具有以下特性：多孔性，足夠的機(jī)械強(qiáng)度，盡可能小的流動(dòng)阻力，耐腐蝕性，耐熱性，易于再生。工業(yè)上常見(jiàn)的過(guò)濾介質(zhì)：織物介質(zhì)、堆積介質(zhì)、多孔固體介質(zhì)、多孔膜。（2）過(guò)濾分類(lèi)：深層過(guò)濾、

濾餅過(guò)濾（3）過(guò)濾推動(dòng)力：重力（漏斗過(guò)濾）、壓力（加壓過(guò)濾）或真空（抽濾）、離心力（離心過(guò)濾）。（4）濾餅的可壓縮性（5）助濾劑

助濾劑本身就是一性能良好的過(guò)濾介質(zhì)，是一種堅(jiān)硬、不規(guī)則的小顆粒，它能形成結(jié)構(gòu)疏松、空隙率大、不可壓縮的濾餅，很大程度改善過(guò)濾難度。助濾劑使用方法主要有兩種：混合、預(yù)涂。2.2

細(xì)胞破碎1)、細(xì)胞破碎A壓撞

B剪切

Ca滲透

Cb凍脹

D破壁破膜2.2.3

細(xì)胞破碎技術(shù)2.2.3.1機(jī)械破碎主要有高壓勻漿、珠磨、撞擊破碎和超聲波破碎等方法1)、固體剪切法(珠磨法,c最有效的物理破碎法)2)、液體剪切法3)撞擊破碎法4)超聲破碎法2.2.3.2化學(xué)破碎法酶溶法、酸堿法、有機(jī)溶劑胞溶法、表面活性劑法酶溶法：利用酶分解細(xì)胞壁上特出的化學(xué)鍵，使細(xì)胞壁破碎。優(yōu)點(diǎn)：A、產(chǎn)品釋放的選擇性；B、提取速度和收效高；C、產(chǎn)品的破壞?。籇、對(duì)外界環(huán)境，如pH和溫度等要求低；E、不殘留細(xì)胞碎片。2.2.3.3物理滲透法滲透壓沖擊法、凍結(jié)-融化法機(jī)械破碎法缺點(diǎn)：A、高能、高溫、高噪音、高剪切力(四高)，易使產(chǎn)品變性失活；B、非專(zhuān)一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難；C、細(xì)胞碎片大小不一，難分離。

化學(xué)破碎法缺點(diǎn)：A、費(fèi)用高；B、引起新的污染，尤其是其他化學(xué)方法；C、一般只有有限的破碎，常需與其他物理法連用。破碎方法的選擇選擇的一般原則A、提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機(jī)械法破碎B、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機(jī)械法結(jié)合的方法破碎技術(shù)雜交研究應(yīng)注意的問(wèn)題A、雜交技術(shù)可產(chǎn)生很大優(yōu)勢(shì)。B、破碎技術(shù)對(duì)下游分離技術(shù)的影響。破碎顆粒清除，產(chǎn)物的分離純化C、在發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過(guò)程和環(huán)境對(duì)破碎難易程度的影響D、菌種的培育，胞內(nèi)產(chǎn)物?胞外產(chǎn)物3初級(jí)分離3.1沉淀分級(jí)沉淀（precipitation)是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)溶解度降低、由液相變成固相析出生成固體凝聚物（aggregates)的現(xiàn)象。常用加入試劑的方法，改變?nèi)軇┖腿苜|(zhì)的能量平衡來(lái)降低其溶解度，使產(chǎn)物離開(kāi)溶液生成不溶性顆粒，沉降析出。沉淀具有濃縮與分離的雙重作用。與結(jié)晶聯(lián)系

在本質(zhì)上都是新相析出的過(guò)程，主要是物理變化，當(dāng)然也存在化學(xué)反應(yīng)的沉淀或結(jié)晶。區(qū)別：

結(jié)晶為同類(lèi)分子或離子以有規(guī)則排列形式析出，沉淀為同類(lèi)分子或離子以無(wú)規(guī)排列形式析出。優(yōu)點(diǎn)A、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、放大容易，產(chǎn)物濃度越高沉淀越有利，收率越高；B、原料液體積很快地減小10~50倍，從而簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費(fèi)用；C、使中間產(chǎn)物保持在一個(gè)中性溫和的環(huán)境；D、及早地將目標(biāo)pro.從其pro.水解酶分離出來(lái)，避免pro降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；E、用沉淀法作為pro色譜分離前處理，可使使用色譜分離的限制因素降低到最少。缺點(diǎn)：A、沉淀物可聚集有多種物質(zhì)，如大量鹽類(lèi)和溶劑，所以沉淀法所產(chǎn)品純度通常都比結(jié)晶法低；B、過(guò)濾較困難蛋白質(zhì)溶解：相似者相溶aa的親水性和疏水性：有利因素：親水性，包括氫鍵、極性基團(tuán)、離子化側(cè)鏈、親水a(chǎn)a所占的比例等。如白蛋白不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基團(tuán)、疏水a(chǎn)a所占的比例等。如纖維蛋白原。蛋白質(zhì)的溶解行為是一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)，由其組成、構(gòu)象以及分子周?chē)沫h(huán)境所決定。蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學(xué)上類(lèi)似的大分子蛋白質(zhì)更易溶解。蛋白質(zhì)是兩性高分子電解質(zhì)（amphotericpolymer），主要由疏水性各不相同的20種氨基酸組成。在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢(shì)，使親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強(qiáng)。因此，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成。⑴蛋白質(zhì)周?chē)乃瘜樱╤ydrationshell)可以使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。⑵蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）因此，可通過(guò)降低蛋白質(zhì)周?chē)乃瘜雍碗p電層厚度（ζ電位）降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀。蛋白質(zhì)可以看作是一個(gè)表面分布有正、負(fù)電荷的球體，這種正、負(fù)電荷是由氨基和羧基的離子化形成的，換句話(huà)說(shuō)，該球體是帶有均衡電荷分布的膠體顆粒。因此，蛋白質(zhì)的沉淀，實(shí)際上與膠體顆粒的凝聚和絮凝現(xiàn)象相似。

蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。因溶液是電中性的，水中應(yīng)有等當(dāng)量的反離子存在。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定因素吸引力顆粒間的相互作用，顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度。VanderWaals

力Keeson引力（偶極力）Debye

引力（誘導(dǎo)力）London引力（色散力）是最重要的一種引力，因?yàn)樗蟹肿佣际强梢员粯O化的，所以它是普遍存在的。DLVO理論

顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度。在低離子強(qiáng)度時(shí)，顆粒距離處在中間狀態(tài)，雙電層斥力占優(yōu)勢(shì)，可看為一個(gè)凝聚的勢(shì)壘；在高離子強(qiáng)度時(shí)，吸引力超過(guò)排斥力，相互間的總位能表現(xiàn)為吸引位能。

雖然這個(gè)理論所假定的條件并不完全適合于蛋白質(zhì)分子，但該理論對(duì)于理解破壞蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性仍有很大幫助，同時(shí)還有助于針對(duì)具體蛋白質(zhì)選擇最合適的沉淀劑及技術(shù)。帶電粒子間的靜電相互作用取決于ζ電位（絕對(duì)值）的大小。粒子表面電位一定，分散層厚度越小，ζ電位越??；分散層厚度為零，則ζ電位為零，粒子處于等電狀態(tài)，不產(chǎn)生靜電作用。

當(dāng)分散層厚度大，雙電層的ζ電位足夠大時(shí)，靜電排斥作用抵御分子間的相互吸引作用，蛋白質(zhì)溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)分散層厚度小，ζ電位小，分子間相互吸引作用大于靜電排斥作用，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。3.1.2鹽析沉淀影響因素A、無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)結(jié)論：a

不同種類(lèi)的鹽主要影響Ks；b

離子半徑小，帶電多，電荷密度高，鹽析效果好。無(wú)機(jī)鹽的挑選原則：a

較高的鹽析效能；b

高溶解度，能配置高離子強(qiáng)度的鹽溶液；c

溶解度受溫度的影響??；d

鹽溶液的密度不高，便于蛋白質(zhì)沉淀和離心分離；e

不易引起蛋白質(zhì)的變性；f

價(jià)格低廉；最常用(NH4)2SO4優(yōu)點(diǎn)：符合上述要求；缺點(diǎn)：水解后溶液pH降低，在高pH下產(chǎn)氨，腐蝕性強(qiáng)，有異味，有毒，終產(chǎn)物必須除盡。次常用Na2SO4。缺點(diǎn)：在400C以下溶解度較低，主要用于熱穩(wěn)定蛋白。B、無(wú)機(jī)鹽添加方式C、溫度T

T影響Cohn方程中的b值。T，bˉ；Tˉ，b。D、溶液pH

pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最?。╞值最?。┑入婞c(diǎn)沉淀法在低的離子強(qiáng)度下，調(diào)pH至等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉淀的操作稱(chēng)為等電點(diǎn)沉淀，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。等電點(diǎn)沉淀法中的pH值作用于β值而隱含在Cohn公式中，pI值通常在pH4~6范圍內(nèi)變化，一般用無(wú)機(jī)酸（如鹽酸、磷酸和硫酸）作沉淀劑。在蛋白質(zhì)疏水性比較大和結(jié)合水比較小時(shí)這種類(lèi)型的沉淀更有效。為了提高等電點(diǎn)法的沉淀能力，常將其與鹽析法、有機(jī)溶劑法或其他沉淀法一起使用。最大缺點(diǎn)：無(wú)機(jī)酸會(huì)引起較大的蛋白質(zhì)不可逆變性的危險(xiǎn)。等電點(diǎn)沉淀法注意事項(xiàng)本法適用于憎水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)，例如酪蛋白在等電點(diǎn)時(shí)能形成粗大的凝聚物。但對(duì)一些親水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)。如明膠，則在低離子強(qiáng)度的溶液中，調(diào)pH在等電點(diǎn)并不產(chǎn)生沉淀。等電點(diǎn)沉淀法往往不能獲得高的回收率，通常與其他沉淀方法結(jié)合使用；在調(diào)節(jié)等電點(diǎn)時(shí)，如果采用鹽

酸、氫氧化鈉等強(qiáng)酸強(qiáng)堿，要注意防止酶的失活或蛋白變性。為了使pH緩慢變動(dòng)，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。中性鹽濃度增大時(shí)，等電點(diǎn)向偏酸方向移動(dòng)，同時(shí)最低溶解度會(huì)有所增大。3.1.4

有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑的種類(lèi)：

丙酮(首選)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀pro。機(jī)理：A、增大靜電力

有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理是加入溶劑后，會(huì)使水溶液的介電常數(shù)降低，而使pro分子間的靜電引力（庫(kù)侖力）增大，導(dǎo)致凝集和沉淀。

B、去水化層

有機(jī)溶劑使pro溶劑化，使原來(lái)與pro結(jié)合的水被溶劑所取代，從而降低了pro溶解度。這種理論不能說(shuō)明為什么乙醇比丙酮的親水性強(qiáng)，丙酮卻比乙醇沉淀pro的能力強(qiáng)，也解釋不了丙酮、乙醇之類(lèi)溶劑在所謂脫去pro水膜的過(guò)程中容易造成pro變性，而鹽析脫水時(shí)不造成pro變性。C、丙酮、乙醇等不僅是pro的沉淀淀劑，而且還是一種變性劑，可見(jiàn)作用有機(jī)溶劑使pro在沉淀和變性之間既有區(qū)別又相關(guān)聯(lián)。有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素1、溫度2、pH值3、樣品濃度4、中性鹽濃度5、某些金屬離子3.1.4

有機(jī)溶劑沉淀法優(yōu)點(diǎn)：A、某些蛋白質(zhì)沉淀的濃度范圍相當(dāng)寬，所得產(chǎn)品的純度較高B、從沉淀的蛋白質(zhì)中除去有機(jī)溶劑很方便，而且有機(jī)溶劑本身可部分地作為蛋白質(zhì)的殺菌劑；缺點(diǎn)：A、耗用大量溶劑，而溶劑來(lái)源、貯存都比較困難麻煩；B、且沉淀操作需在低溫下進(jìn)行，使用上有一定的局限性；C、收率也比鹽析法低；D、試劑易燃，有毒。3.1.5熱沉淀利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最為簡(jiǎn)便，不需消耗任何試劑，但分離效率較低，通常用于生物大分子的初期分離純化。3.1.6非離子型聚合物用聚乙二醇等非離子性聚合物亦能降低蛋白質(zhì)的溶解度，有選擇性的沉淀蛋白質(zhì)。機(jī)理：與有機(jī)溶劑相似，能降低水活度，破壞蛋白質(zhì)的水化膜。常用非離子性聚合物為Polyethyleneglycol(PEG)：是一種水溶性的高分子聚合物，分子量4,000以上的PEG可以用來(lái)沉淀蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：1.室溫2.顆粒大，易于收集3.提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性4.PEG難去除，幸而PEG通常一般不影響下一步的分離。優(yōu)點(diǎn)：A、體系的溫度只需控制在室溫條件下；B、沉淀的顆粒往往比較大，產(chǎn)物比較容易收集；C、PEG非但不會(huì)使pro變性,而且可以提高它的穩(wěn)定性；D、PEG無(wú)毒，優(yōu)先使用在臨床產(chǎn)品的加工過(guò)程中。缺點(diǎn)：A、PEG比其他沉淀劑更難從蛋白質(zhì)溶液中除去為此需用超濾和液-液萃取來(lái)解決；B、價(jià)格較昂貴。選擇性沉淀法概念：選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀下來(lái)，而與目的物分開(kāi)。原理：利用蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子對(duì)某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達(dá)到分離提純的目的。方法：１）利用對(duì)熱的不穩(wěn)定性,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分；２）酸堿變性。３）利用表面活性劑(三氯乙酸)或有機(jī)溶劑引起變性；選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法是使雜質(zhì)變性沉淀，又對(duì)目的物沒(méi)有明顯影響，所以在操作之前要對(duì)欲分離的物質(zhì)中的雜蛋白等雜質(zhì)的種類(lèi)、含量及其物理化學(xué)性質(zhì)等有比較全面的了解。其他沉淀法聚電解質(zhì)機(jī)理：架橋作用、鹽析、降低水化度多價(jià)金屬離子機(jī)理：與蛋白質(zhì)分子上某些殘基發(fā)生相互作用各種沉淀方法應(yīng)用范圍鹽析法：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。有機(jī)溶劑沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸的分離純化，有時(shí)也用于蛋白質(zhì)沉淀。等電點(diǎn)沉淀法：用于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的沉淀。多與其它方法結(jié)合使用。非離子多聚體沉淀法：用于分離生物大分子。生成鹽復(fù)合物沉淀：用于多種物質(zhì)(特別是小分子)選擇性沉淀（熱/酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。討論題：咸蛋煮熟了，蛋黃里會(huì)有油，這是什么緣故？蛋黃中除了脂肪以外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)就是一種高明的乳化劑，它能夠把蛋黃中的脂肪分散成很小的油滴，這樣就騙過(guò)了我們的眼睛和舌頭。在鹽漬過(guò)程中，作為乳化劑的蛋白質(zhì)被鹽析出來(lái)，乳濁液被破壞了，那些原來(lái)分散成極小的油滴，彼此就互相聚集起來(lái)，變成大油液，使得整個(gè)蛋黃變成油滋滋的，甚至流出油來(lái)了。4膜分離膜分離的概念：利用膜的選擇性（孔徑大?。阅さ膬蓚?cè)存在的能量差作為推動(dòng)力，由于溶液中各組分透過(guò)膜的遷移率不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種技術(shù)。在一種流體相間有一層薄的凝聚相物質(zhì)，把流體相分隔開(kāi)來(lái)成為兩部分，這一薄層物質(zhì)稱(chēng)為膜。膜本身是均一的一相或由兩相以上凝聚物構(gòu)成的復(fù)合體被膜分開(kāi)的流體相物質(zhì)是液體或氣體膜的厚度應(yīng)在0.5mm以下，否則不能稱(chēng)其為膜優(yōu)點(diǎn):1)、能耗低。膜分離不涉及相變，對(duì)能量要求低，與蒸餾、結(jié)晶和蒸發(fā)相比有較大的差異；2)、分離條件溫和，對(duì)于熱敏感物質(zhì)的分離很重要；3)、操作方便，結(jié)構(gòu)緊湊、維修成本低、易于自動(dòng)化。缺點(diǎn)1)、膜面易發(fā)生污染，膜分離性能降低，故需采用與工藝相適應(yīng)的膜面清洗方法；2)、穩(wěn)定性、耐藥性、耐熱性、耐溶劑能力有限，故使用范圍有限；3)、單獨(dú)的膜分離技術(shù)功能有限，需與氣他分離技術(shù)連用。以推動(dòng)力的過(guò)程分類(lèi)以濃度差為推動(dòng)力的過(guò)程：A、透析技術(shù)(Dialysis,DS)

以電場(chǎng)力為推動(dòng)力的過(guò)程：A、電透析，B、離子交換電透析

以靜壓力差為推動(dòng)力的過(guò)程：A、微濾B、超濾，C、反滲透以蒸氣壓差為推動(dòng)力的過(guò)程：A、膜蒸餾，B、滲透蒸餾4.1.1

反滲透(RO)應(yīng)用：A、海水淡化，B、超純水制備，C、抗生素和氨基酸等濃縮，D、回收有機(jī)溶劑，如乙醇、丁醇和丙醇等。4.1.2

微濾(MF)應(yīng)用：A、高分子溶質(zhì)之間，以及高分子與小分子溶質(zhì)之間的分離；B、Pro濃縮，C、病毒的分離和富積，D、回收細(xì)胞，處理膠體懸浮液。優(yōu)點(diǎn)：A、消除了濾餅的阻力，過(guò)濾效率高；B、超濾回收率高；C、濾液的質(zhì)量好；D、減少處理步驟4.1.3

透析(DS)原理：濃差擴(kuò)散用途：

A、人工腎，腹膜透析；

B、樣品脫電解質(zhì)；

C、濃縮富積；

D、氣體分離(利用透析袋對(duì)不同氣體的通透性)優(yōu)點(diǎn)：

A、方法和設(shè)備簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉；

B、實(shí)驗(yàn)室最常用的樣品脫鹽方法缺點(diǎn)：

A、透析的速度緩慢；

B、溶質(zhì)稀釋。4.1.4

電透析(ED，IEED)電透析(Electro-dialysis,ED)原理：在透析的基礎(chǔ)上加上直流電，極大加快離子的透析速度。

用途：樣品快速脫鹽。優(yōu)點(diǎn)：

A、設(shè)備簡(jiǎn)單，B、透析速度極快（提高幾十倍），

C、電流直接指示電透析終點(diǎn)，

D、減輕溶質(zhì)的稀釋。終點(diǎn)判斷：

A、Cl-

+

Ag+=AgClˉ;

B、電導(dǎo)恒定.4.1.4

離子交換電透析(IEED)機(jī)理：透析膜經(jīng)化學(xué)處理后帶有正電荷(如季銨基—N+R3)或負(fù)電荷基團(tuán)如(磺酸基—SO2-3)。用途：A、海水淡化，B、苦水淡化C、血漿、IgG、其他蛋白質(zhì)的分離，D、氨基酸和有機(jī)酸分離純化。優(yōu)點(diǎn)：可大規(guī)模生產(chǎn)

缺點(diǎn)：能耗高4.1.5滲透氣化滲透氣化：是根據(jù)溶質(zhì)間透過(guò)膜的速度不同,使混合物得到分離.滲透蒸發(fā)（膜蒸餾）原理

它是利用膜與被分離有機(jī)液體混合物中各組分的親合力不同，而有選擇性地優(yōu)先吸附溶液某一組分，及各組分在膜中擴(kuò)散速度不同，來(lái)達(dá)到分離的目的。因此它不存在蒸餾法中的共沸點(diǎn)的限制，可連續(xù)分離、濃縮，直至得到純有機(jī)物。

分離過(guò)程是用一張滲透蒸發(fā)膜,將進(jìn)料液相和透過(guò)氣相分隔開(kāi),并在氣相側(cè)抽真空或通以惰性氣流,把滲透組分的蒸氣壓控制到接近零,液相中產(chǎn)生的化學(xué)位梯度（溶質(zhì)分壓差）作為傳質(zhì)推動(dòng)力的膜分離過(guò)程。滲透蒸發(fā)膜類(lèi)型A、優(yōu)先透水膜材料：主要由親水材料制成。

如親水聚合物：含氮原子的殼聚糖衍生物、聚烯丙基胺、交聯(lián)聚乙烯醇復(fù)合物；殼聚糖、纖維素及衍生物、鈷交聯(lián)藻朊酸、磺化聚乙烯離子膜和玻璃紙等。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：這些膜具有很強(qiáng)的脫水能力，主要在于其高聚物結(jié)構(gòu)上存在著大量的親水基團(tuán)，如羥基、胺基、銨基陽(yáng)離子等。這些基團(tuán)的存在使得膜具有很高的吸附水和擴(kuò)散水的能力。應(yīng)用：有機(jī)溶液的脫水(有機(jī)物為主體，水含量少)。B、優(yōu)先透有機(jī)物膜材料：主要由憎水高聚物制成。

如含憎水的氟原子和硅原子的改性硅橡膠。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：聚合物中含憎水的氟原子和硅原子等。這些結(jié)構(gòu)對(duì)有機(jī)溶劑的親和力很大，但對(duì)水的無(wú)親和力。應(yīng)用：主要用于水的純化、污染控制和有機(jī)物的回收等(水為主體，有機(jī)物含量少)。有優(yōu)點(diǎn)，也有缺點(diǎn)A、單級(jí)選擇性好是滲透蒸發(fā)的最大特點(diǎn)。從理論上講，滲透蒸發(fā)的分離度是無(wú)限的，適合分離沸點(diǎn)相近的物質(zhì)，尤其是恒沸物的分離，對(duì)于回收含量低的溶劑也是一種好方法。B、過(guò)程操作簡(jiǎn)單，易于掌握，有部分相變，故能耗較低。C、由于操作中進(jìn)料側(cè)原則上不須加壓，所以不會(huì)導(dǎo)致膜的壓密，滲透率不會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降；并且在操作過(guò)程中形成的膜的溶脹活性層將會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)化為非對(duì)稱(chēng)膜，對(duì)膜的透過(guò)率和使用壽命有益。D、與反滲透等過(guò)程相比，滲透蒸發(fā)的通量要小得多，一般在200g/(m2h)以下，而且高選擇性的滲透蒸發(fā)膜，通量往往在100g/(m2h)左右。E、與反滲透相比，滲透氣化過(guò)程中溶質(zhì)發(fā)生相變，透過(guò)側(cè)溶質(zhì)以氣體狀態(tài)存在，因此消除了滲透壓的作用，從而使?jié)B透氣化的操作壓較低，適合于高濃度混合物的分離。應(yīng)用優(yōu)勢(shì)：PV在分離有機(jī)物是非常有用的，因PV破壞了共沸混合物或揮發(fā)度差異小帶來(lái)的干擾，分離因素取決于膜和化合物的性質(zhì)。4.2.1

膜材料生物分離過(guò)程中，對(duì)膜料要有如下要求：A、起過(guò)濾作用的有效膜厚度小，超濾和微濾的孔隙率高，過(guò)濾阻力小；B、不吸附被分離物質(zhì)，從而膜不易污染和堵塞；C、使用的pH和溫度范圍廣，耐高溫滅菌，耐酸堿清洗，穩(wěn)定性高D、使用壽命長(zhǎng)：經(jīng)濟(jì)；D、易通過(guò)清洗恢復(fù)透過(guò)性能；E、適應(yīng)性廣：滿(mǎn)足實(shí)現(xiàn)分離的各種要求，如對(duì)菌體細(xì)胞的截留，對(duì)生物大分子的通透性或截留作用。

膜材料的種類(lèi)天然高分子材料種類(lèi)：纖維素衍生物，如醋酸纖維、硝酸纖維和再生纖維優(yōu)點(diǎn)：醋酸纖維的阻鹽能力最強(qiáng)，常用于反滲透膜，也可作超濾膜和微濾膜；再生纖維素可用于制造透析膜和微濾膜。缺點(diǎn)：醋酸纖維膜最高使用溫度和pH范圍有限，在45-50°C，pH3-8。膜的水通量定義：

在一定條件下(一般為0.1MPa，溫度20°C)，單位時(shí)間單位膜面積的水通量(m3m-2h-1)。意義：A、對(duì)同類(lèi)膜，孔徑越大，水通量越大；B、水通量并不能完全衡量和預(yù)測(cè)實(shí)際料液的透過(guò)流通量。4.4膜操作特征4.4.1

濃度(凝膠)極化模型適應(yīng)范圍：反滲透、超濾和微濾。濃度極化模型：在膜分離操作中，所有溶質(zhì)均被透過(guò)液傳送到膜表面，不能完全透過(guò)膜的溶質(zhì)受到膜的截留作用，在膜表面附近濃度升高。這種在膜表面附近濃度高于主體濃度的現(xiàn)象謂之濃度極化或濃差極化4.4.1

濃度(凝膠)極化模型凝膠極化模型：膜表面附近濃度升高，增大了膜兩側(cè)的滲透壓差，使有效壓差減小，透過(guò)通量降低。當(dāng)膜表面附近的濃度超過(guò)溶質(zhì)的溶解度時(shí)，溶質(zhì)會(huì)析出，形成凝膠層。即使分離含有菌體、細(xì)胞和其他固形成分的料液時(shí)，也會(huì)在膜表面形成凝膠層。這種現(xiàn)象謂之凝膠極化(gelpolarization)。4.4.2超濾膜的分子截留作用分子截留率(rejectioncoefficient):表征膜對(duì)溶質(zhì)的截留能力。表觀截留率：由于膜表面的極化濃度不易測(cè)定，通常只能測(cè)定料液的體積濃度(bulkconcentration)，因此常用表觀截留率，其定義為：真實(shí)截留率為：在實(shí)際膜分離過(guò)程中，由于存在濃度極化現(xiàn)象，真實(shí)截留率為:顯然，如不存在濃度極化現(xiàn)象，R表觀oR真實(shí)。如R表觀=1，則cf=0，即溶質(zhì)完全被截留；如R表觀=0，則cf=cb，即溶質(zhì)可自由透過(guò)膜。截留分子的測(cè)定：

平板膜的截留率可用攪拌型超濾器間歇測(cè)定。操作在較低壓力和適當(dāng)?shù)臄嚢杷俣认逻M(jìn)行，避免發(fā)生濃度極化。通過(guò)測(cè)定超濾膜前后的保留液濃度和體積可計(jì)算截留率為:其中，c0和c分別為溶質(zhì)的初始濃度和超濾后的濃度，V0和V分別為料液的初始和超濾后體積。截留曲線:P72意義：A、曲線陡直，孔徑分布小，膜有較好的分子量切割作用；B、相反，孔徑分布較寬，膜的分子量切割作用較差。截留分子量：通過(guò)測(cè)定分子量不同的球形蛋白質(zhì)或水溶性聚合物的截留率，可獲得膜的截留率與溶質(zhì)分子量之間的關(guān)系曲線，即截留曲線。一般將在截留率為90%的溶質(zhì)分子量定義為膜的截留分子量(molecularweightcutoff,MWCO)。膜的評(píng)價(jià)：當(dāng)然，MWCO只表征膜特征的一個(gè)參數(shù)，不能作為唯一指標(biāo)。膜的優(yōu)劣應(yīng)從孔徑分布、透過(guò)通量、耐污染能力、穩(wěn)定性、溫度、pH、機(jī)械強(qiáng)度等多方面考察。截留率的影響因素A、分子特征：分子量相同時(shí)，線形分子截留率較低；支鏈分子較高，球狀分子最大。B、電荷：對(duì)于荷電膜，膜相同的分子截留率低；反之，截留率較高。C、膜吸附：溶質(zhì)與膜有相互吸附的，截留率高；相反，截留率較低。D、其他高分子的影響：

當(dāng)有兩種以上的高分子溶質(zhì)存在時(shí)，其中某一溶質(zhì)的截留率要高于單獨(dú)存在的情況。這主要是由于：a、競(jìng)爭(zhēng)性抑制；b、濃度的極化現(xiàn)象使膜表面的濃度高于主體濃度。E、操作條件：溫度升高，黏度下降，則截留率降低。膜面流速增大，則濃度極化減低，截留率升高。F、pH值：

當(dāng)料液的pH值等于蛋白質(zhì)的pI時(shí)，由于蛋白質(zhì)的凈電荷為零，蛋白質(zhì)間的靜電排斥最小，使蛋白質(zhì)在膜表面形成的凝膠極化層濃度最大，即透過(guò)阻力最大。此時(shí)，溶質(zhì)的截留率高于其他pH下的截留率。4.5

膜滲透通量的影響因素操作形式

終端過(guò)濾、錯(cuò)流過(guò)濾流速：P74意義：k隨流速的增大而提高；因此，流速的增大，透過(guò)通量增大。適合條件：對(duì)蛋白質(zhì)溶液以及小分子有效，但對(duì)細(xì)胞和膠體粒子的懸浮液無(wú)效。無(wú)效性原因：A、錯(cuò)流過(guò)濾使凝膠層剝離和流動(dòng)，從而實(shí)際的凝膠層比凝膠極化模型的計(jì)算值??；B、菌體物理性質(zhì)(形狀，大小，硬度和填充物等)和生物性質(zhì)(粘性物質(zhì)，c膜，壁結(jié)構(gòu)成分，自溶等)不同4.7膜的污染和清洗膜污染---最大問(wèn)題原因：A、凝膠極化引起的凝膠層，阻力為Rg；B、溶質(zhì)在膜表面的吸附層，阻力為Ras；C、膜孔堵塞，阻力為Rp；D、膜孔內(nèi)溶質(zhì)吸附，阻力為Rap；膜污染不僅造成透過(guò)通量大幅度，而且影響產(chǎn)物的回收率。膜清洗A、試劑：水、鹽溶液、稀酸、稀堿、表面活性劑、絡(luò)合劑、氧化劑和酶溶液等。B、原則：去污能力好，對(duì)膜無(wú)損害，成本最低。C、方法：反向清洗，試劑置換，化學(xué)降解消化。E、預(yù)防：膜的預(yù)處理(用乙醇浸泡聚砜膜)，料液預(yù)處理(調(diào)pH，預(yù)過(guò)濾)，開(kāi)發(fā)抗污染膜，臨界壓力操作等。4.8膜技術(shù)的應(yīng)用1)、細(xì)胞培養(yǎng)基的除菌；2)、發(fā)酵液或培養(yǎng)液中細(xì)胞的收集和除去；3)、細(xì)胞破碎后碎片的除去；4)、標(biāo)產(chǎn)物部分純化后的濃縮或?yàn)V除小分子溶質(zhì)；5)、最終產(chǎn)品的濃縮和洗濾除鹽；6)、蛋白質(zhì)的回收、濃縮和純化7)、制備用于調(diào)制生物產(chǎn)品和清洗產(chǎn)品容器的無(wú)熱源水；8)、膜生物反應(yīng)器。1:菌體分離

利用超濾或微濾操作進(jìn)行菌體的錯(cuò)流過(guò)濾分離是膜分離技術(shù)的重要應(yīng)用之一。與傳統(tǒng)濾餅過(guò)濾和硅藻土過(guò)濾相比，錯(cuò)流過(guò)濾具有以下1）、優(yōu)點(diǎn)：

A、透過(guò)通量大；

B、濾液澄清，菌體回收率高；

C、不須添加助濾劑或絮凝劑，回收的菌體純凈，有利于進(jìn)一步分離操作（如菌體的破碎、胞內(nèi)產(chǎn)物的回收等）。

D、適合于大規(guī)模連續(xù)操作；

E、易于進(jìn)行無(wú)菌操作，防止雜菌污染。2）、缺點(diǎn)：

膜分離的最大問(wèn)題是膜污染引起的膜透過(guò)通量下降。2：小分子（500-2KD)生物產(chǎn)品的回收3:注射藥物的除熱源4：蛋白質(zhì)的回收與脫鹽5:膜生物反應(yīng)器5萃取萃取的優(yōu)點(diǎn)1

萃取過(guò)程具有選擇性2

能與其他純化方法相配合3

通過(guò)相轉(zhuǎn)移，減少目標(biāo)產(chǎn)物的降解4

規(guī)模放大極為容易5

傳質(zhì)快、生產(chǎn)周期短6

便于連續(xù)操作、易于計(jì)算機(jī)控制7

無(wú)相變、能耗低、成本低8

方法成熟、易于設(shè)計(jì)5.1.1萃取：利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法稱(chēng)為萃取。液液萃取：以液體為萃取劑，當(dāng)含有目標(biāo)產(chǎn)物的原料也為液體時(shí)，則為液液萃取。液固萃取或浸取：含有目標(biāo)產(chǎn)物的原料為固體，則為液固萃取。5.1.2

反萃取(Backextraction)：

當(dāng)萃取操作后，為進(jìn)一步純化目標(biāo)產(chǎn)物或便于下步分離操作，往往需要將目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到水相。這種調(diào)節(jié)水相條件，將目標(biāo)產(chǎn)物從有機(jī)相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作稱(chēng)為反萃取。洗滌操作(washingprocessing)：對(duì)于一個(gè)完整的萃取過(guò)程，常在萃取和反萃取之間增加洗滌操作

物理萃?。喝苜|(zhì)根據(jù)相似相溶的原理在兩相間達(dá)到分配平衡，萃取劑與溶質(zhì)之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。例如，用乙酸丁酯萃取青霉素。

化學(xué)萃取：用脂溶性萃取劑與溶質(zhì)之間的化學(xué)反應(yīng)生成脂溶性復(fù)合分子實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)向有機(jī)相的分配。萃取劑與溶質(zhì)之間的化學(xué)反應(yīng)，包括離子交換和絡(luò)合反應(yīng)等。如用萃取劑季銨鹽(氯化三辛基甲銨，R+Cl-)萃取氨基酸A-。稀釋劑(diluent)：化學(xué)萃取中通常用煤油、已烷、和苯等溶解萃取劑，改善萃取相的物理性質(zhì)，此時(shí)的有機(jī)溶劑稱(chēng)為稀釋劑。分配定律：在恒溫恒壓下，溶質(zhì)在互不相溶的兩相中達(dá)到分配平衡時(shí)，溶質(zhì)在兩相中的平衡濃度之比為常數(shù)A適應(yīng)條件：相同分子形態(tài)（相對(duì)分子質(zhì)量相同）存在于兩相中的溶質(zhì)濃度之比。不適合于化學(xué)萃取，因溶質(zhì)在各相中并非以同一種分子形態(tài)存在。分配系數(shù)或分配比：是指溶質(zhì)在兩相中的總濃度之比，其用于表示溶質(zhì)的分配平衡關(guān)系A(chǔ)、弱電解質(zhì)的萃取理論弱堿性電解質(zhì)的分配系數(shù)

B、弱電解物質(zhì)萃取的影響因素pH的大?。籟H]

弱酸性電解質(zhì)ma

，mb2)

溫度是影響溶質(zhì)分配系數(shù)和萃取速度的重要因素。選擇適當(dāng)?shù)牟僮鳒囟龋欣谀繕?biāo)產(chǎn)物的回收和純化。但由于生物產(chǎn)物在較高溫度下不穩(wěn)定,故萃取操作一般在常溫或較低溫度下進(jìn)行。3)

其他因素：無(wú)機(jī)鹽的存在可降低溶質(zhì)在水溶液中的溶解度，有利于萃取。萃取維生素B12加入硫酸銨；萃取青霉素加入氯化鈉等。化學(xué)萃取目的由于氨基酸aa和一些極性較大的抗生素的水溶性很強(qiáng)，在有機(jī)相中的分配系數(shù)很小甚至為零，利用一般的物理萃取效率很低，甚至無(wú)法萃取。5.3.3.1水相物理?xiàng)l件的影響①pH值：pH低，有利于酸性物質(zhì)分配在有機(jī)相，有利于堿性物質(zhì)分配在水相。②溫度：一般采用較低的溫度。③無(wú)機(jī)鹽：無(wú)機(jī)鹽的存在，有利于溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到有機(jī)相。選擇原則：根據(jù)相似相溶的原理(最重要參數(shù)：介電常數(shù)，極性)，選擇與目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)相近的萃取劑，可以得到較大分配系數(shù)。此外，有機(jī)溶劑還應(yīng)滿(mǎn)足以下要求：1)、價(jià)廉易得；2)、與水相不互溶；3)、與水相有較大的密度差，并且粘度小，表面張力適中，相分散和相分離較容易；4)、容易回收和再利用；5)、毒性低，腐蝕性小，閃點(diǎn)低，使用安全；6)、不與目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)。乳化：水或有機(jī)溶劑

以微小液滴形式分散于有機(jī)相或水相中的現(xiàn)象。常常發(fā)生在實(shí)際發(fā)酵產(chǎn)物的萃取操作中。產(chǎn)生乳化后使有機(jī)相和水相分層困難，出現(xiàn)兩種夾帶：①、發(fā)酵液中夾帶有機(jī)溶劑微滴，使目標(biāo)產(chǎn)物受到損失；②、有機(jī)溶劑中夾帶發(fā)酵液給后處理操作帶來(lái)困難。乳化產(chǎn)生原因：是發(fā)酵液中存在的蛋白質(zhì)和固體顆粒等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有表面活劑性的作用，使有機(jī)溶劑和水的表面張力降低。

水易于以微小液滴的形式分散于油相稱(chēng)為油包水型或W/O乳濁液；

相反，為O/W（oilinwater）水包油型乳濁液。乳化處理1)、在操作前，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾或絮凝沉淀處理，可除去大部分蛋白質(zhì)及固體微粒，防止乳化現(xiàn)象的發(fā)生。2)、乳化產(chǎn)生后，采取適當(dāng)?shù)?/p>

破乳手段。A如果乳化現(xiàn)象不嚴(yán)重，可采用過(guò)濾或離心沉降的方法。B對(duì)于O/W型乳濁液，加入親油性表面活性劑，可使乳濁液從O/W型轉(zhuǎn)變成W/O型，但由于溶液條件不允許W/O型乳濁液的形成，即乳濁液不能存在，從而達(dá)到破壞的目的。C相反，對(duì)于W/O型乳濁液，加入親水性表面活性劑，如SDS可達(dá)到破乳的目的。物料衡算:如存在線性平衡,H和L為常數(shù),有萃取因子：萃余率：萃取率：意義：?jiǎn)栴}:

效率低,為達(dá)到一定的萃取率,就需大量萃取劑5.5

雙水相萃取雙節(jié)線(bi-nodal)：

圖中的曲線。雙節(jié)線以下的區(qū)域?yàn)榫鄥^(qū),以上的區(qū)域?yàn)閮上鄥^(qū)，即ATPS。系線(tieline)：

雙節(jié)線上兩點(diǎn)的直線。系線(tieline)反映的信息A杠桿規(guī)則：系線上各點(diǎn)均為分成組成相同，而體積不同的兩相。兩相體積近似服從杠桿規(guī)則B性質(zhì)差異：系線的長(zhǎng)度是衡量?jī)上嚅g相對(duì)差別的尺度,系線越長(zhǎng),兩相間的性質(zhì)差別越大；反之則越小.C

臨界點(diǎn)(criticalpoint)：當(dāng)系線長(zhǎng)度趨于零時(shí),兩相差別消失,任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1。如K點(diǎn)。

1)、分配系數(shù)m2)、m貢獻(xiàn)因子me、mb和ma分別為靜電、疏水和親和作用對(duì)溶質(zhì)m的貢獻(xiàn).3)、靜電作用非電解質(zhì)m0：式中,M:溶質(zhì)分子量;gD:溶質(zhì)在上下兩相表面自由能的差,J/mol。意義：A

不受靜電作用的影響(因不帶電);B

一般gD>

0，溶質(zhì)lnm隨M而ˉ；C

ATPS不同,同一溶質(zhì)的gD也就不同，m隨ATPS不同而改變。1)、成相聚合物濃度和M分子量M:若降低聚合物的M，則pro分配于富含該聚合物的相中。如PEG/DX系統(tǒng)，若降低DX的M，則m減小。這一規(guī)律具有普遍意義。成相系統(tǒng)的總濃度：增大時(shí),系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn),系線長(zhǎng)度增加,兩相性質(zhì)的差別(疏水性等)增大,蛋白質(zhì)分子的分配系數(shù)將偏離臨界點(diǎn)處的值(m=1),即大于1或小于1.因此,成相物質(zhì)的總濃度越高,系線越長(zhǎng),蛋白質(zhì)越容易分配于其中的某一相.1)、成相聚合物濃度和M存在問(wèn)題：當(dāng)系線長(zhǎng)度增加時(shí),系統(tǒng)的表面張力增大,可能導(dǎo)致溶質(zhì)在界面上的吸附.這種現(xiàn)象在處理含細(xì)胞和固體微粒的料液時(shí)尤為嚴(yán)重,細(xì)胞或固體微粒容易集中在界面上,給萃取操作帶來(lái)因難,.但對(duì)于可溶性蛋白質(zhì).這種界面吸附現(xiàn)象很少發(fā)生,一般可不考慮。5.6

液膜萃取由于固體膜存在選擇性低和通量小的缺點(diǎn)，人們?cè)噲D用改變固體高分子膜的狀態(tài)，使穿過(guò)膜的擴(kuò)散系數(shù)增大、膜的厚度減小，從而使透過(guò)速度躍增，并再現(xiàn)生物膜的高度選擇性遷移。

這是一種以液膜為分離介質(zhì)、以濃度差為推動(dòng)力的膜分離操作。它與溶劑萃取雖然機(jī)理不同，但都屬于液－液系統(tǒng)的傳質(zhì)分離過(guò)程。液膜的定義和組成液膜是懸浮在液體中很薄的一層乳液微粒。它能把兩個(gè)組成不同而又互溶的溶液隔開(kāi)，并通過(guò)滲透現(xiàn)象起到分離作用。乳液微粒組成

1溶劑（水和有機(jī)溶劑）：構(gòu)成膜基體2表面活性劑：乳化作用。它含有親水基和疏水基，可以促進(jìn)液膜傳質(zhì)速度并提高其選擇性3添加劑：控制膜的穩(wěn)定性和滲透性將含有被分離組分的料液作連續(xù)相，稱(chēng)為外相；接受被分離組分的流體，稱(chēng)內(nèi)相；處于兩者之間的成膜的流體稱(chēng)為膜相，三者組成液膜分離體系。液膜的種類(lèi)①乳狀液膜

②支撐液膜

③流動(dòng)液膜液膜分離技術(shù)的應(yīng)用液膜分離技術(shù)由于其良好的選擇性和定向性，分離效率又高，而且能達(dá)到濃縮、凈化和分離的目的5.7

反膠團(tuán)萃取5.9超臨界流體萃取超臨界流體(supercriticalfluid,SCF)對(duì)脂肪酸、植物堿、醚類(lèi)、酮類(lèi)、甘油脂等具有特殊的溶解作用，因此可用于這類(lèi)物質(zhì)的萃取分離。利用超臨界流體為萃取劑的萃取操作稱(chēng)為超臨界流體萃取(SCFextraction).所謂超臨界流體(SCF)即處于臨界溫度、臨界壓力以上的流體。在臨界溫度、壓力以上，無(wú)論壓力多高，流體都不能液化但流體的密度隨壓力增高而增加。超臨界流體：當(dāng)一種流體處于其臨界點(diǎn)的溫度和壓力之下，則稱(chēng)之為超臨界流體。特點(diǎn)：密度接近液體萃取能力強(qiáng)

粘度接近氣體傳質(zhì)性能好利用超臨界流體的特殊性質(zhì)，使其在超臨界狀態(tài)下，與待分離的物料接觸，萃取出目的產(chǎn)物，然后通過(guò)降壓或升溫的方法，使萃取物得到分離。超臨界二氧化碳萃取臨界點(diǎn)：Tc=31.26℃、Pc=7.2MPa優(yōu)點(diǎn)：臨界條件溫和、產(chǎn)品分離簡(jiǎn)單、無(wú)毒、無(wú)害、不燃、無(wú)腐蝕性、價(jià)格便宜缺點(diǎn)：設(shè)備投資大6吸附與離子交換吸附(adsorption)：溶質(zhì)從液相或氣相轉(zhuǎn)移到固相的現(xiàn)象。吸附機(jī)制：固體表面分子(或原子)處于特殊的狀態(tài)。固體內(nèi)部分子所受的力是對(duì)稱(chēng)的，故彼此處于平衡。但在界面分子的力場(chǎng)是不飽和的，即存在一種固體的表面力，它能從外界吸附分子、原子、或離子，并在吸附表面上形成多分子層或單分子層。吸附作用:物質(zhì)從氣體或液體濃縮到固體表面從而實(shí)現(xiàn)分離的過(guò)程吸附劑:在表面上能發(fā)生吸附作用的固體吸附物:被吸附的物質(zhì)吸附法的特點(diǎn)：常用于從稀溶液中將溶質(zhì)分離出來(lái)，由于受固體吸附劑的限制，處理能力較小；對(duì)溶質(zhì)的作用較小，這一點(diǎn)在蛋白質(zhì)分離中特別重要；可直接從發(fā)酵液中分離所需的產(chǎn)物，成為發(fā)酵與分離的耦合過(guò)程，從而可消除某些產(chǎn)物對(duì)微生物的抑制作用；溶質(zhì)和吸附劑之間的相互作用及吸附平衡關(guān)系通常是非線性關(guān)系，故設(shè)計(jì)比較復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)的工作量較大。6.1.1吸附劑1）、吸附劑分類(lèi)：A、非多孔類(lèi)：非多孔性固體的比表面僅取決于顆粒的外表面，比較而言比表面積小，用粉碎的方法可以增加其比表面積。B、多孔類(lèi)：多孔性顆粒的表面是由“外表面”和“內(nèi)表面”所組成，內(nèi)表面積可比外表面積大幾百倍。由于顆粒內(nèi)微孔的存在，比表面很大，可達(dá)每克幾百平方米，有較高的吸附勢(shì)。3）、吸附劑的表征A、化學(xué)成分B、材料結(jié)構(gòu)C、比表面積D、平均孔徑、或平均粒度,及其分布4）、比表面積的測(cè)定

一般采用B.E.T(Brunueer-Emmett-Teller)法：在液氮溫度下(-196°C)，用吸附劑吸附氮?dú)?，在吸附劑表面形成單分子吸附層，測(cè)定氮?dú)獾奈襟w積vm(cm3/g)，計(jì)算比表面積a(cm2/g):N-阿弗加德羅常數(shù)，s-被吸附分子的橫截面積，在-196°C氮?dú)夥肿拥膕=1.62′10-15cm2。5）、孔徑及分布測(cè)定

吸附劑的孔徑及分布可采用水銀壓入法，利用汞孔度計(jì)測(cè)定。當(dāng)壓力升高時(shí)，水銀可進(jìn)入到細(xì)孔中，壓力p與孔徑d的關(guān)系為s-水銀的表面張力(0.48N/m2)，q-水銀與細(xì)孔壁的接觸角(=140°)。通過(guò)測(cè)定水銀體積與壓力之間的關(guān)系即可求出孔徑的分布情況。6）、吸附力A

范德華力B

靜電作用力C

酶與基質(zhì)結(jié)合時(shí)的配位鍵D

疏水相互作用E

空間位阻等F

氫鍵7）、吸附類(lèi)型A

物理吸附

吸附劑和吸附物通過(guò)分子間力(范德華力)產(chǎn)生的吸附稱(chēng)為物理吸附。這是一種最常見(jiàn)的吸附現(xiàn)象，其特點(diǎn)是吸附不僅限于一些活性中心，而是整個(gè)自由界面。B、化學(xué)吸附

化學(xué)吸取附是由于吸附劑在吸附物之間的電子轉(zhuǎn)移，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的，屬于庫(kù)侖力范圍，它與通常的化學(xué)反應(yīng)不同的地方在于吸附劑表面的反應(yīng)原子保留了它或它們?cè)瓉?lái)的格子不變。C

物理吸附與化學(xué)吸附的比較D

交換吸附

交換吸附類(lèi)型:1st

極性吸附:吸附劑表面如為極性分子所組成，則會(huì)吸引溶液中逞相反極性的物質(zhì)或離子而形成雙電層，這種吸附稱(chēng)為極性吸附。2nd

離子交換:在吸附劑與溶液間發(fā)生離子交換，即吸附劑吸附離子后，它同時(shí)要放出等當(dāng)量的離子于溶液中。交換吸附的決定因素:1st離子所帶電荷越多，它在吸附劑表面的相反電荷點(diǎn)上的吸附力就越強(qiáng)2nd電荷相同的離子，其水化半徑越小，越易被吸附。6.1.2

離子交換劑1）、離子交換劑A

cationexhanger-Na+:

包含強(qiáng)酸性和弱酸性陽(yáng)離子交換劑B

anionexchanger+F-:

包含強(qiáng)堿性和弱堿性陰離子交換劑。C

交換劑的種類(lèi)

小分子類(lèi)交換劑：苯乙烯-二乙烯苯型、丙烯酸-二乙烯苯型、酚醛型2）、性能評(píng)價(jià)A

交換容量(exchangecapacity)指單位質(zhì)量的干燥離子交換劑或單位體積的濕離子交換劑所能吸附的一價(jià)離子的毫摩爾數(shù)(mmol)，是表征交換劑離子交換能力的主要參數(shù)。B

交換容量的測(cè)定

對(duì)于陽(yáng)離子交換劑：用HCl將其處理成氫型，稱(chēng)重并測(cè)定其含水量；稱(chēng)數(shù)克交換劑，加入到過(guò)量已知濃度的NaOH溶液，發(fā)生交換反應(yīng)1st樹(shù)脂孔道的空間排阻作用大；2nd交換后排阻其他蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和交換；3rd蛋白質(zhì)的多電荷與多個(gè)交換中心結(jié)合C

滴定曲線

全面評(píng)價(jià)表征交換劑的重要參數(shù)方法：1g氫型(或羥型)交換劑+x-ml0.1MNaOH/orHCl+水至50ml(其中1支+50ml0.1MNaCl)+靜置24h(對(duì)強(qiáng)交換劑)/or7d(對(duì)弱交換劑)+測(cè)pH+作圖意義：1st強(qiáng)離子交換劑的交換；2nd弱離子交換劑的交換；3rd滴定曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)

交換容量；4th轉(zhuǎn)折點(diǎn)數(shù)

交換基團(tuán)的種類(lèi)數(shù)；5th交換容量隨pH的變化。6.4

固定床吸附操作1)、單柱吸附飽和(最大)吸附濃度q0:與入口料液濃度c0相平衡的吸附濃度。穿透曲線(breakthroughcurve)：吸附過(guò)程中吸附柱出口溶質(zhì)濃度的變化曲線。穿透時(shí)間:一般為出口濃度達(dá)到入口濃度的5%-10%的時(shí)間。穿透點(diǎn)(breakthroughpoint):出口處溶質(zhì)濃度開(kāi)始上升的點(diǎn)洗脫(elution)：再生(re-generation)：濃度波/吸附帶/交換帶：吸附塔中液相或固相溶質(zhì)濃度從c0/或q0到0的分布區(qū)帶。傳質(zhì)區(qū)：在交換帶中發(fā)生的液、固相之間的傳質(zhì)恒定圖式分布(constantpatern)：濃度波以恒定的形式移動(dòng)，一般發(fā)生在Langmuir和Freundlich型的吸附操作中。2)、多柱串聯(lián)吸附3)、動(dòng)態(tài)法測(cè)定吸附量

曲線1為不吸附溶質(zhì)的穿透曲線，對(duì)應(yīng)的體積為V0。曲線2為吸附溶質(zhì)的曲線，對(duì)應(yīng)體積為V。吸附劑吸附溶質(zhì)的量為斜線面積，即為c0(V-V0)。利用不同濃度的溶液反復(fù)作吸附操作，即可得到吸附平衡關(guān)系q*=f(c).固定床：

在吸附顆粒確定以后，床層的膨脹與通過(guò)床層液體的表觀流速U有關(guān)。當(dāng)U不大時(shí)，顆粒之間仍保持靜止并互相接解，這為固定床。流化床：

當(dāng)U增大至起始流態(tài)化速度Umf，顆粒不再相互支撐，開(kāi)始懸浮在液體中；進(jìn)一步提高U，床層隨之膨脹，床層的壓力降幾乎不變，但床層中顆粒的運(yùn)動(dòng)加劇，這時(shí)的床層為流化床。優(yōu)點(diǎn)：A

壓降小，可處理高黏度或固體顆粒的粗料液；B

不需要特殊吸附劑，設(shè)備操作簡(jiǎn)單。固定床優(yōu)點(diǎn)：流體在介質(zhì)層中基本上呈平推流，返混小，柱效率高。缺點(diǎn)：無(wú)法處理含顆粒的料液，因會(huì)堵塞床層，造成壓力降增大而最終使操作無(wú)法進(jìn)行。流化床缺點(diǎn)：存在嚴(yán)重的返混，特別是高徑比很小的流化床，使床層理論塔板數(shù)降低，吸附劑的利用率低。1)、膨脹床

綜合固定床和流化床的優(yōu)點(diǎn)，使吸附顆粒按自身的物理性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定地處在床層中的一定層次上實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定分級(jí)，而流體保持以平推流的形式流過(guò)床層，同時(shí)吸附顆粒間有較大的空隙，使料液中的固體顆粒能順利通過(guò)床層7液相色譜1)、按應(yīng)用的目的A、制備性色譜：工業(yè)規(guī)模，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模B、分析性色譜：GC、LC、HPLC、TLC等。2)、按流動(dòng)相A、GC:

氣-固色譜法(固定相為固體)

氣-液色譜法(將不揮發(fā)的液體固定在適當(dāng)?shù)墓腆w載體上作為固定相)B、LC

液-固色譜(固定相為固體)

液-液色譜(液體固定相固定在適當(dāng)?shù)墓腆w上)3)、按色譜的展開(kāi)形式A、柱色譜法B、毛細(xì)管色譜法C、平板色譜法：硅膠板色譜、紙色譜紙層析是一種常用的快速分離、鑒定方法，可用于定性分析以及確定分離方案，但一般不用于定量分析介質(zhì)：濾紙操作方法：將試樣溶于適當(dāng)溶劑中，點(diǎn)樣于濾紙的一端；選用適當(dāng)?shù)恼归_(kāi)劑，借助毛細(xì)管現(xiàn)象從點(diǎn)樣的一端向另一端流動(dòng)，展開(kāi)結(jié)束后，取下濾紙，晾干，染色顯跡。展開(kāi)劑的選擇

展開(kāi)劑可以是單一溶劑，也可以是混合溶劑。常用的氨基酸紙層析體系中使用的展開(kāi)劑為：正丁醇-甲酸-水（15：3：2）展開(kāi)方式3種：上行色譜

、下行色譜、徑向色譜紙層析和薄層層析分離過(guò)程紙層析和薄層層析也屬于色譜分析法。但與其它色譜方法不同的是在分離過(guò)程中一般不使用動(dòng)力源。紙層析和薄層層析流動(dòng)相的移動(dòng)是依靠毛細(xì)作用。將試樣點(diǎn)在色譜濾紙或?qū)游霭宓囊欢?，并將該端浸在作為流?dòng)相的溶劑（常稱(chēng)之為展開(kāi)劑）中，隨著溶劑向上的移動(dòng)，經(jīng)過(guò)試樣點(diǎn)時(shí)，帶動(dòng)試樣向上運(yùn)動(dòng)。薄層色譜法：將固定相涂布在惰性固體上，形成薄層進(jìn)行色譜分離的方法常用的固定相有：硅膠和氧化鋁優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、快速、顯色方式多，如可以選用濃硫酸等進(jìn)行顯色、靈敏度高（較紙層析）、可以大量制備1.層析紙和層析板

特制的色層濾紙。按需要剪裁成長(zhǎng)條形（或筒型）。層析板是用專(zhuān)門(mén)的涂布器把漿狀的吸附劑（硅膠或氧化鋁，200～250目）均勻地涂在長(zhǎng)條形玻璃板上（厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。2.展開(kāi)劑由一種或多種溶劑按一定比例組成。

如用紙層析分離氨基酸時(shí)，常用的展開(kāi)劑組成和配比為：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。3.點(diǎn)樣用微量注射器或玻璃毛細(xì)管吸取一定量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。試樣點(diǎn)的直徑一般應(yīng)小于5mm。可并排點(diǎn)多個(gè)試樣同時(shí)展開(kāi)。4.顯色、檢測(cè)有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將組份斑點(diǎn)描繪出來(lái)。常用的顯色方法有噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或氨水熏等。特點(diǎn)及應(yīng)用：平板色譜簡(jiǎn)單、方便、及操作費(fèi)用低，可以在一塊層析板上同時(shí)展開(kāi)多個(gè)試樣及將多條濾紙同時(shí)展開(kāi)。

采用方形薄層板還可以方便的進(jìn)行二維展開(kāi)，即按一般方法展開(kāi)后，改變方向和展開(kāi)劑再次展開(kāi)，進(jìn)一步改善分離效果。

試樣一般不需要經(jīng)過(guò)預(yù)處理即可分離。柱色譜洗脫方法洗脫一般有三種方法：①恒定洗脫法

②逐次洗脫法

③梯度洗脫法，梯度洗脫法是目前最常用的洗脫法。7.1.2

色譜分類(lèi)按展開(kāi)程序A)、洗脫法B)、頂替法C)、迎頭法洗脫法又稱(chēng)淋洗法，如將含三組分的樣品注入色譜柱，流動(dòng)相連續(xù)流過(guò)色譜柱，并攜帶樣品組分在柱內(nèi)向前移動(dòng)，經(jīng)色譜分離后，樣品中不同組分依據(jù)與固定相和流動(dòng)相相互作用的差別，而順序流出色譜柱。前沿法(frontalmethod)又稱(chēng)迎頭法，如將含三個(gè)等量組分的樣品溶于流動(dòng)相，組成混合物溶液，并連續(xù)注入色譜柱，由于溶質(zhì)的不同組分與固定相的作用力不同，則與固定相作用最弱的第一個(gè)組分首先流出，其次是第二個(gè)組分與第一個(gè)組分混合流出，最后是與固定相作用最強(qiáng)的第三個(gè)組分與第二個(gè)和第一個(gè)組分混合流出。置換法(displacementmethod)又稱(chēng)頂替法，當(dāng)含三種組分的混合物樣品注入色譜柱后，各組分皆與固定相有強(qiáng)作用力，若使用一般流動(dòng)相無(wú)法將他們洗脫下來(lái)，為此可使用一種比樣品組分與固定相間作用力更強(qiáng)的置換劑（或稱(chēng)頂替劑）作流動(dòng)相，當(dāng)它注入色譜柱后，可迫使滯留在柱上的各個(gè)組分，依其與固定相作用力的差別而依次洗脫下來(lái)，且各譜帶皆為各個(gè)組分的純品。7.1.3

色譜的名詞術(shù)語(yǔ)分配系數(shù)m：m=cs/cm式中，cs和cm分別為組份在固定相和流動(dòng)相中的濃度。分配系數(shù)m類(lèi)型：A、B型曲線是一條典型的吸附等溫線，吸附色譜法屬于這類(lèi)曲線。C和D型吸附等溫線很少遇到C曲線為線性分配等溫線。線性色譜：溶質(zhì)濃度低時(shí)，m為常數(shù)時(shí)的色譜意義：溶質(zhì)流過(guò)色譜柱時(shí)，m大的組份通過(guò)色譜柱所需要的時(shí)間長(zhǎng)，m小的組份需要的時(shí)間短；當(dāng)樣品中各組份在兩相的m不同時(shí)，就能實(shí)現(xiàn)差速遷移，達(dá)到分離的目的。A、基線：B、峰高：色譜峰頂與基線間的垂直距離，以h表示。C、保留值：死時(shí)間tm：不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間。因?yàn)槲镔|(zhì)不被固定相吸附，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相的流動(dòng)速度相近：保留時(shí)間tr：試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間tr’：保留時(shí)間tr的表達(dá)：時(shí)間單位(如s,d,h),距離單位(如cm)，體積(ml,l)表示。tr意義：色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組份的tr常受到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保留體積等參數(shù)進(jìn)行定性檢定。D、死體積VM：指色譜柱內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和，當(dāng)后兩項(xiàng)很小而可忽略不計(jì)時(shí)，VM可由tm與流動(dòng)相體積流速F0(ml/min)的乘積計(jì)算：E、保留體積VR：指從進(jìn)樣開(kāi)始到被測(cè)組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過(guò)的流動(dòng)相體積。保留體積與tr的關(guān)系如右圖：F、調(diào)整保留體積V’R：某組份VR扣除VM后，稱(chēng)該組份的V’R，即G、相對(duì)保留值g2,1：某組份2與組份1的調(diào)整保留值之比，即：由于g2,1只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，因此，它是色譜法中，如GC、HPLC中，廣泛使用的定性數(shù)據(jù)。注意：g2,1絕不是兩個(gè)組份保留時(shí)間或保留體積之比在定性分析中，通常固定一個(gè)色譜峰作為標(biāo)值(s),然后再求其它峰(i)對(duì)這個(gè)峰的相對(duì)保留值。此時(shí)gr,i可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常選擇一對(duì)最難分離的物質(zhì)對(duì)，將它們的相對(duì)保留值作為重要參數(shù)。在這種特殊情況下，可用符號(hào)a表示：式中t’r,2為下一峰的調(diào)整保留時(shí)間，所以這時(shí)a總是大于1。H)、分配比k,

即容量因子：意義：色譜柱對(duì)組份保留能力的重要參數(shù)k與m的關(guān)系：4)、區(qū)域?qū)挾壬V主峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素。度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法：A、標(biāo)準(zhǔn)差s：0.607倍峰高處峰寬的一半。B、半峰寬Y1/2：峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬。它與s的關(guān)系為C、基線寬度Y：色譜兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距。它與s的關(guān)系是色譜曲線反映出的重要信息：A、根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組份的最少數(shù)；B、根據(jù)色譜峰的保留值(或位置)，可以進(jìn)行定性分析；C、根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析；D、依據(jù)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋u(píng)價(jià)色譜柱分離效能；E、色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù)。兩組份完全分離必須滿(mǎn)足：A、兩組份的分配系數(shù)必須有差異；B、區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)小于區(qū)域分離的速度；C、在保證快速分離的前提下，提供足夠長(zhǎng)的色譜柱。它不僅應(yīng)說(shuō)明組份在色譜柱中移動(dòng)的速率，而且應(yīng)說(shuō)明組份在移動(dòng)過(guò)程中引起區(qū)域擴(kuò)寬的各種因素。塔板理論和速率理論均以色譜過(guò)程中分配系數(shù)恒定為前提，故稱(chēng)為線性色譜理論。速率理論對(duì)色譜分離條件的選擇具有實(shí)際指導(dǎo)意義。7.2.2理論板模型塔板模型:將色譜柱視為精餾塔，即色譜柱是一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板高(platehigh)為H。假設(shè)在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達(dá)到分配平衡，然后隨著流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的方式向前轉(zhuǎn)移。對(duì)一長(zhǎng)為L(zhǎng)的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：n稱(chēng)為理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨塔板高H的增大而減小。理論塔板數(shù)n與半峰寬及峰底的關(guān)系式為:式中

tr(或Y1/2)

應(yīng)采取同一單位(時(shí)間或距離)。上式示：在tR一定時(shí)，如果色譜峰越窄，則說(shuō)明n越大，H越小，柱效能越高。常用有效塔板數(shù)n有效表示柱效：

例1已知某組分峰的峰底寬為40S，保留時(shí)間為400S，計(jì)算此色譜柱的理論塔板數(shù)。例2已知一根1米長(zhǎng)的色譜柱的有效塔板數(shù)為1600塊，組份A在該柱上的調(diào)整保留時(shí)間為100秒，試求A峰的半峰寬及有效塔板高度7.3分離度柱效n：衡量柱效的指標(biāo)是n(或neff)，柱效則反映了色譜分離過(guò)程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。選擇性a：

為洗脫峰相臨的兩種溶質(zhì)的容量因子之比.分離度也稱(chēng)分辨度。它是指相鄰兩色譜保留值之差與兩峰底寬平均值之比，即當(dāng)Rs<

1時(shí)，兩峰總有部分重疊；當(dāng)Rs=1時(shí)，兩峰能明顯分離；Rs>1.5時(shí)，兩峰才能完全分離。當(dāng)然，更大的Rs值，分度效果會(huì)更好，但會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。利用上式，可以直接從色譜圖上計(jì)算分離度。但該式?jīng)]有體現(xiàn)影響分離度的諸因素。而下式清楚地指出了，分離度受柱效n、選擇性a和容量因子k三個(gè)參數(shù)的控制：意義：第一，增加塔板數(shù)，可以增加分離度，若通過(guò)增加柱長(zhǎng)來(lái)增加塔板數(shù)，就會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。所以，設(shè)法降低塔板高H，才是增大分離度的最好方法。第二，加大容量因子可以增加分離度，但是會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間，至造成譜帶檢測(cè)困難。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)k>

10時(shí)，分離度的提高并不明顯；而當(dāng)k<

2時(shí)，洗脫時(shí)間會(huì)出現(xiàn)極小值。因此，在色譜分離中，通常將k控制在2--7之間。第三，選擇性參數(shù)a的微小增大，都會(huì)使分離度得到較大的改善。當(dāng)a>

2時(shí)，即使在很短的時(shí)間內(nèi)，組份也會(huì)完全分離。當(dāng)a?1時(shí)，要完成分離，必須增加柱長(zhǎng)，延長(zhǎng)分析時(shí)間。例如，為了達(dá)到同樣的分離度，當(dāng)a=1.01時(shí)，所需的時(shí)間是a=1.1時(shí)的84倍。顯然，當(dāng)a=1時(shí)，無(wú)論怎樣提高柱效，加大容量因子等，Rs均為零。在這種情況下，兩組份的分離是不可能的。定性分析1st在色譜條件一定時(shí)，任何一種物質(zhì)都有確定的保留時(shí)間。2nd

相對(duì)保留值g2,1：定量分析定量依據(jù)

在一定色譜條件下，組份i的質(zhì)量(mi)或其在流動(dòng)相中的濃度，與檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)（峰面積Ai或峰高h(yuǎn)i）成正比：

式中fiA和fih是絕對(duì)校正因子。定量校正因子1st絕對(duì)校正因子

組份峰面積和峰高的絕對(duì)校正因子分別為：由此可見(jiàn)，絕對(duì)校正因子是指某組份通過(guò)檢測(cè)器的量與檢測(cè)器對(duì)該組份的響應(yīng)信號(hào)之比。存在問(wèn)題：

很明顯，絕對(duì)校正因子受儀器及操作條件的影響很大，偶然誤差和系統(tǒng)誤差較多，故其應(yīng)用受到限制。2nd相對(duì)校正因子：指組份i與基準(zhǔn)組份s的絕對(duì)校正因子之比，即式中fAis和fhis分別為組份的峰面積和峰高相對(duì)校正因子，fAs和fhs分別為基準(zhǔn)組份s的峰面積和峰高絕對(duì)校正因子。必須注意，相對(duì)校正因子同量綱(相當(dāng)于同身寸尺)。絕對(duì)校正因子很少使用，一般文獻(xiàn)上提到的是相對(duì)校正因子。

優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)校正因子消除了偶然誤差和系統(tǒng)誤差較.3rd相對(duì)響應(yīng)值：也叫相對(duì)應(yīng)答值，即相對(duì)靈敏度，當(dāng)計(jì)量單位相同時(shí)，它們與相對(duì)校正因子互為倒數(shù)：定量方法外標(biāo)法(亦稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線法)1st作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

該法是在一定色譜操作條件下，用純物質(zhì)配制一系列不同的濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣，定量進(jìn)樣，按測(cè)得的峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2nd定量分析進(jìn)行試樣分析時(shí)，在與標(biāo)準(zhǔn)系列嚴(yán)格相同的條件下定量進(jìn)樣，由所得峰面積從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得待測(cè)組分的含量。3rd優(yōu)點(diǎn)：外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是操作和計(jì)算簡(jiǎn)便，不需要知道所有組分的相對(duì)校正因子，其準(zhǔn)確度主要取決于進(jìn)樣量的準(zhǔn)確和重現(xiàn)性，以及操作條件的穩(wěn)定性。4th存在問(wèn)題：

結(jié)果的準(zhǔn)確度取決于進(jìn)樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。內(nèi)標(biāo)法

當(dāng)試樣中所有組分不能全部出峰，或只要求測(cè)定試樣中某個(gè)或幾個(gè)組分時(shí)，可用此法。準(zhǔn)確稱(chēng)取m(g)試樣，加入某種純物質(zhì)ms(g)作為內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比ms/m及相應(yīng)的色譜峰面積之比，基于下式可求組分i的百分含量Wi%：1st

內(nèi)標(biāo)物的選擇條件是：內(nèi)標(biāo)物與試樣互溶且是試樣中不存在的純物質(zhì)；內(nèi)標(biāo)物的色譜峰既處于待測(cè)組分峰附近，彼此又能很好地分開(kāi)且不受其它峰干擾；加入量宜與待測(cè)組分量相近。

內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，操作條件不必嚴(yán)格控制，且不象歸一化法那樣在使用上有所限制。缺點(diǎn)是必須對(duì)試樣和內(nèi)標(biāo)物準(zhǔn)確稱(chēng)重，比較費(fèi)時(shí)。2nd優(yōu)點(diǎn)

內(nèi)標(biāo)法是通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及欲測(cè)組份的峰面積的相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算的，因而可以在一定程度上消除操作條件等的變化所引起的誤差。3rd內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)：

在試樣中增加了一個(gè)內(nèi)標(biāo)物，這常常給分離造成一定的困難。4th內(nèi)標(biāo)法的條件

A、內(nèi)標(biāo)物必須是待測(cè)試樣中不存在的；

B、內(nèi)標(biāo)峰應(yīng)與試樣中各組份的峰分開(kāi)，并盡量接近欲分析的組份。歸一化法如果試樣中所有組分均能流出色譜柱并顯示色譜峰，則可用此法計(jì)算組分含量。設(shè)試樣中共有n個(gè)組分，各組分的量分別為m1，m2，……，mn，則i種組分的百分含量為：優(yōu)點(diǎn)是：簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，進(jìn)樣量的多少不影響定量的準(zhǔn)確性，操作條件的變動(dòng)對(duì)結(jié)果的影響也較小，對(duì)組分的同時(shí)測(cè)定尤其顯得方便。缺點(diǎn)是：

試樣中所用的組分必須全部出峰，某些不需定量的組分也需測(cè)出其校正因子和峰面積，因此應(yīng)用受到一些限制。7.4凝膠過(guò)濾色譜7.4.1原理與操作定義：凝膠過(guò)濾

即凝膠過(guò)濾層析，也稱(chēng)分子排阻層析、尺寸排阻、分子篩層析

是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的分子量不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。圖示（262），在裝填具有一定孔徑分布的凝膠過(guò)濾介質(zhì)的層析柱中，料液中溶質(zhì)1的相對(duì)分子質(zhì)量很大，不能進(jìn)入到凝膠的細(xì)孔中，因而從凝膠間的床層空隙流過(guò)，洗脫體積為層析柱的空隙體積；

對(duì)子溶質(zhì)4，其相對(duì)分子質(zhì)量很小，能夠進(jìn)入到凝膠的所有細(xì)孔中，因而其洗脫體積接近柱體積；相對(duì)分子質(zhì)量介于溶質(zhì)1和溶質(zhì)4之間的溶質(zhì)2和3可進(jìn)入到凝膠的部分細(xì)孔中，故其洗脫體積介于空隙體積和柱體積之間，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的差別（溶質(zhì)2的相對(duì)分子質(zhì)量大于溶質(zhì)3）順序洗脫。相對(duì)分子質(zhì)量大于溶質(zhì)l和小于溶質(zhì)4的溶質(zhì)的洗脫體積分別與溶質(zhì)1和溶質(zhì)4相同。GFC操作中溶質(zhì)的分配系數(shù)M只是相對(duì)分子質(zhì)量、分子形狀、凝膠結(jié)構(gòu)(孔徑分布)的函數(shù)，與所用洗脫液的pH值和離子強(qiáng)度等物性無(wú)關(guān)，即在一般的層析操作條件下、相對(duì)分子質(zhì)量一定的溶質(zhì)的分配系數(shù)為常數(shù)。因此，GFC操作一般采用組成一定的洗脫液進(jìn)行洗脫展開(kāi)，這種洗脫法稱(chēng)為恒定洗脫法(isocraticelution)。GFC可分離系統(tǒng)體積介于V0和Vt之間的溶質(zhì)，分離精度有限，料液處理量也很小，只有當(dāng)料液體積小于兩溶質(zhì)的洗脫體積差，才有可能完全分離。凝膠層析的操作

（1）凝膠的處理

葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠以干品出售的，所以在使用前必須溶脹?？梢詫⑺鼈兘菰谙疵搫┲校龜嚢?。洗脫劑應(yīng)具有一定的離子強(qiáng)度（約為0.08）。這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)凝膠都含有少量羧基，如果洗脫劑的離子強(qiáng)度低于0.08，少量羧基不能被屏蔽，凝膠顆粒就具有離子交換性質(zhì)，從而改變?nèi)苜|(zhì)的分配系數(shù)。溶脹時(shí)不能用電磁攪拌器，這樣會(huì)使顆粒損壞，產(chǎn)生大量粉末，影響流速。溶脹要完全，否則影響層析的均一性，甚至有使柱破裂的危險(xiǎn)，加熱可使溶脹加速。溶脹時(shí)攪拌可能產(chǎn)生很細(xì)的顆粒，必須將其除去，否則會(huì)嚴(yán)重降低柱的流速瓊脂糖凝膠是以濃的懸浮液的形式出售的，不需溶脹。（2）裝柱

裝柱前，柱的底部要先放些玻璃棉、玻璃細(xì)孔板等可拆卸的支持物，以支持固定相。凝膠要懸浮在洗脫劑中，在攪拌下緩慢加入柱中，使凝膠自然沉積，直到所需高度為止。

床層要均勻，不能有紋路或氣泡。裝柱時(shí)要考慮凝膠的承壓能力，如壓力太高，凝膠會(huì)被擠壓變形而影響流速。（3）上樣和洗脫

柱床經(jīng)洗脫劑平衡后，在床頂部留下數(shù)毫升洗脫劑，再用滴管輕輕沿柱壁將試樣加入至柱的上面，防止擾動(dòng)填充層表面，打開(kāi)柱底部的流出口，使樣品液滲入凝膠床內(nèi)。

當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面平時(shí)，加入數(shù)毫升洗脫劑沖洗管壁。這一步關(guān)鍵是既要使樣品恰好全部滲入凝膠床，又不致使凝膠表面干燥而發(fā)生裂縫。然后用大量洗脫劑洗脫，并收集相應(yīng)的洗脫液。

非水溶性物質(zhì)的洗脫采用有機(jī)溶劑（如苯和丙酮），水溶性物質(zhì)的洗脫一般采用水或具有不同離子強(qiáng)度和pH的緩沖液。pH的影響與被分離物質(zhì)的酸堿性有關(guān)，在酸性pH時(shí)堿性物質(zhì)易于洗脫，在堿性pH時(shí)酸性物質(zhì)易于洗脫。多糖類(lèi)物質(zhì)的洗脫以水為最佳，有時(shí)為了使樣品溶液解度增加而使用含鹽洗脫劑。4）凝膠的再生和保養(yǎng)

理論上因?yàn)槟z本身不與溶質(zhì)發(fā)生作用，所以層析分離后無(wú)需再生處理，但實(shí)際操作時(shí)凝膠層常有一定的污染，必須作適當(dāng)?shù)奶幚怼?/p>

交聯(lián)葡萄糖凝膠柱可用0.2mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合液處理。聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠由于遇酸、堿不穩(wěn)定，常用0.5mol/LNaCl處理。為了抑制微生物在凝膠層內(nèi)生長(zhǎng)，在凝膠床保存之前必須完全除去磷酸根離子和所有底物，將柱真空保存或低溫保存，但溫度不可過(guò)低，離子強(qiáng)度要高一些，以防凍結(jié)。經(jīng)常使用的凝膠以濕態(tài)保存為主，只要在其中加入適當(dāng)?shù)囊志鷦┚涂煞胖脦讉€(gè)月至一年，不需要干燥。7.4.2凝膠過(guò)濾介質(zhì)

凝膠過(guò)濾層析常用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分級(jí)分離和除鹽。因此，良好凝膠過(guò)濾介質(zhì)應(yīng)滿(mǎn)足以下要求：①親水性高，表面惰性，即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用；②穩(wěn)定性強(qiáng)，在較寬的pH和離子強(qiáng)度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)；③

具有一定的孔徑分布范圍；④

機(jī)械強(qiáng)度高，允許較高的操作壓力(流速)。Sepharose是常用的瓊脂糖凝膠品牌之一，機(jī)械強(qiáng)度較低。7.4.2.2表征凝膠特性的參數(shù)排阻極限：不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對(duì)分子量。分級(jí)范圍：凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對(duì)分子量。凝膠粒