木薯原生質(zhì)體再生植株技術(shù)規(guī)程

1T/GACIXXXX—XXXX木薯原生質(zhì)體再生植株技術(shù)規(guī)程本文件屬于木薯組織培養(yǎng)再生技術(shù)。本文件規(guī)定了誘導(dǎo)木薯脆性胚性愈傷組織（FEC）、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體培養(yǎng)、愈傷組織懸浮培養(yǎng)、體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)、胚胎再生植株的實(shí)驗(yàn)方法和步驟。本文件適用于木薯胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與離體培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、木薯遺傳轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞融合再生等生物技術(shù)領(lǐng)域。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1520木薯DB33/T752植物種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1植物細(xì)胞全能性指植物的每個(gè)細(xì)胞都包含著該物種的全部遺傳信息，從而具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力。在適宜條件下，任何一個(gè)細(xì)胞都可以發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體。3.2原生質(zhì)體指去掉細(xì)胞壁的裸露的有活性的細(xì)胞。4縮略詞FEC：脆性胚性愈傷組織CIM：誘導(dǎo)胚胎培養(yǎng)基，適用于芽、嫩葉等外植體MSN：誘導(dǎo)胚胎培養(yǎng)基，適用于胚性愈傷組織GD：胚性愈傷組織的維持和增殖培養(yǎng)基SH：懸浮培養(yǎng)基，胚性愈傷組織的維持和增殖TM2G：培養(yǎng)原生質(zhì)體的培養(yǎng)基CMM：胚狀體成熟培養(yǎng)基CEM：生芽伸長培養(yǎng)基MS：生根和組培苗繼代培養(yǎng)基2,4-D：2,4一二氯苯氧乙酸6-BA：6-芐基腺嘌呤NAA：萘乙酸ZT：玉米素2T/GACIXXXX—XXXX5原理木薯外植體在含特定激素的培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)胚性愈傷組織，再用胚性愈傷組織分離原生質(zhì)體，利用植物細(xì)胞的全能性，木薯原生質(zhì)體能分裂增長成胚性愈傷組織，然后分化成胚狀體長成完整植株。整個(gè)過程是：外植體→胚性愈傷組織→原生質(zhì)體→胚性愈傷組織→胚狀體→完整植株。6培養(yǎng)基配方及溶液配制見附錄A、B、C、D。7操作步驟7.1誘導(dǎo)胚性愈傷組織7.1.1誘導(dǎo)循環(huán)胚胎將組培苗外植體（嫩葉、芽等）在含12mg/LPicloram的CIM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)初生胚胎，每2w換一次培養(yǎng)基，將產(chǎn)生的初生胚胎用鑷子挑出，繼續(xù)在CIM培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～4m，誘導(dǎo)循環(huán)胚胎。7.1.2誘導(dǎo)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的循環(huán)胚胎，放在GD培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～2m，將循環(huán)胚胎表面產(chǎn)生的細(xì)小顆粒分離，再在GD培養(yǎng)基上增值培養(yǎng)，不斷循環(huán)，形成脆性胚性愈傷組織（FEC）。7.2建立懸浮系+取脆性胚性愈傷組織約1g，轉(zhuǎn)移至約30mLSH液體培養(yǎng)基中，置于搖床，于25°C，光照強(qiáng)度800～1000lx，轉(zhuǎn)速110～130r/min下震蕩懸浮培養(yǎng)。每隔2～3d繼代1次，繼代5～15d后使用。7.3分離純化原生質(zhì)體7.3.1酶解取繼代5～15d的愈傷組織懸浮系，用鑷子除去大顆粒，吸管吸除液體培養(yǎng)基，稱取1g組織，用約12mL酶液酶解。酶液由10g/L纖維素酶，0.4g/L離析酶，0.1g/L果膠酶，368mg/LCaCl2，34mg/LKH2PO4，740mg/LKNO3，492mg/LMgSO4·7H2O，19.2mg/LNa-EDTA，14mg/LFeSO4·7H2O，91g/L甘露醇，0.5g/LMES，1mg/LNAA，1mg/L2,4-D組成。在25°C、40r/min、黑暗條件下酶解18h。7.3.2純化采用梯度離心法。將酶解好的組織經(jīng)45μm不銹鋼網(wǎng)篩過濾，可能是由于液體表面張力的作用，酶液很難自動(dòng)流下，一般需要很久，這時(shí)給不銹鋼篩網(wǎng)一個(gè)外力，酶液很快就流下過濾了。濾液轉(zhuǎn)入10mL離心管，在960r/min下離心6min，棄上清液，沉淀用1～1.5mLCPW13鹽懸浮。在另一干凈的離心管加入3～4mLCPW26鹽，然后緩緩加入CPW13鹽懸浮的原生質(zhì)體，960r/min離心3min，中間界面出現(xiàn)一條清晰的帶。再用吸管將原生質(zhì)體帶吸出，用TM2G液體培養(yǎng)基懸浮，960r/min離心6min，棄上清液，沉淀再用TM2G培養(yǎng)基懸浮。7.4原生質(zhì)體培養(yǎng)將純化的原生質(zhì)體用TM2G液體培養(yǎng)基懸浮，采用液體淺層法培養(yǎng)。TM2G培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為0.30～0.36mol/L，原生質(zhì)體培養(yǎng)密度為5×105個(gè)/mL。在6cm無菌塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每皿約1.5mL培養(yǎng)基，在28°C、黑暗條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)前30d，每10d用新鮮的TM2G（葡萄糖0.30mol/L）培養(yǎng)基更換，此后每10d用新鮮的TM2G（葡萄糖0.25mol/L）培養(yǎng)基更換。7.5懸浮培養(yǎng)原生質(zhì)體在TM2G液體培養(yǎng)基培養(yǎng)45d后，把大的致密愈傷組織挑出（其它的繼續(xù)培養(yǎng)）轉(zhuǎn)移至SH液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，7～15d更換1次新鮮培養(yǎng)基，在SH培養(yǎng)基增殖2～4w。3T/GACIXXXX—XXXX7.6胚胎發(fā)生將在SH培養(yǎng)基增殖的愈傷組織轉(zhuǎn)至MSN固體培養(yǎng)基上（光照）分化胚狀體，產(chǎn)生的胚狀體分別在CMM培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～4w發(fā)育成綠色的大子葉胚，再將成熟的綠色大子葉胚轉(zhuǎn)至CEM培養(yǎng)基，1～2m后莖開始伸長。當(dāng)伸長的莖長至2～3cm時(shí)，手術(shù)刀切下，接入MS培養(yǎng)基，1w即可生根。從原生質(zhì)體到再生完整植株一般需要6～7個(gè)月。7.7移栽培養(yǎng)土先經(jīng)高溫高壓滅菌。將清洗干凈的再生苗移栽到盛滿培養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，每一個(gè)營養(yǎng)缽種植1株，種植后澆透定根水。4T/GACIXXXX—XXXXMS鹽和維生素NH4NO3KH2PO4MgSO4·7H2OH3BO3ZnSO4·7H2ONa2MoO4·2H2OMnSO4·H2OFeSO4·7H2ONa2·EDTAVB6VB125T/GACIXXXX—XXXX培養(yǎng)基組成及作用4MS鹽和維生素（附錄A）、2μMCuSO4、1mg/LNA6T/GACIXXXX—XXXXGD、SH、TM2G培養(yǎng)基組成KHPOKNONHNONHHPOHBONaVBVB1187T/GACIXXXX—XXXX18T/GACIXXXX—XXXX（規(guī)范性）CPW鹽配方