生物化學 -第四章 酶

Chapter4

酶(Enzyme)

提綱

第一部分酶通論第二部分酶促反應(yīng)動力學第三部分酶的作用機制與酶的調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)草酰乙酸檸檬酸異檸檬酸a-酮戊二酸琥珀酸輔酶A琥珀酸延胡索酸蘋果酸乙酰輔酶A

生物體內(nèi)幾乎所有的反應(yīng)都由酶進行催化Section1、酶通論酶學研究史酶的催化作用特點酶的化學本質(zhì)及其組成酶的分類及命名酶的專一性酶的活力測定和分離純化核酶、抗體酶和酶工程1783年Spallamzan發(fā)現(xiàn)鳥的胃液能消化肉；1814年Kirchhoff發(fā)現(xiàn)稀酸對淀粉的加水分解作用【麥芽抽提液加入淀粉后能生成麥芽糖,即麥芽抽提液中必定有能水解淀粉的水溶性物質(zhì)→ferment(酵素)】1826年Mitscherlich提出水溶性酵素為"unorganizedferment"1830年Kuhle開始使用Enzyme這一術(shù)語1833年P(guān)ayen&Persoz從麥芽抽提液得到了ferment,稱diastase【溶于水、稀酸,但不溶于高濃度酒精,即現(xiàn)在的amylase】1835年Berzelius提出ferment起的是催化作用一、酶學研究史1857年P(guān)asteur認為發(fā)酵分幾個階段進行,每一步都有特定的酶參與,

但酶只在活體細胞中才能起作用；1894年Bertrand發(fā)現(xiàn)了水解酶以外的酶；1897年Buchner兄弟以“沒有酵母的酒精發(fā)酵”證明了酶可以離開細胞起作用；1910年Halden&Young發(fā)現(xiàn)酶是蛋白質(zhì)與耐熱性低分子量化合物

(cofactor)的復合物,提出蛋白質(zhì)只是擔體；1913年米氏方程建立；1926年Sumner得到了Urease的結(jié)晶，結(jié)晶中測定不到cofactor，

確立了酶是蛋白質(zhì)的觀念；1929年Warburg發(fā)現(xiàn)呼吸鏈諸酶中的血紅素

【1935-1936年微生素與輔酶的關(guān)系的解明】1929年Sabbarow發(fā)現(xiàn)ATP【1939-1940年F.Lipmann解明高能磷酸化合物的生理意義】1959年SutherlandcAMP的發(fā)現(xiàn)→酶與激素的關(guān)系1970年Restrictionenzyme的發(fā)現(xiàn)→基因工程1982年ThomasR.Cech實驗發(fā)現(xiàn)有催化活性的天然RNA—Ribozyme；范例是L19RNA和核糖核酸酶P的RNA組分具有酶活性兩個；

1995年發(fā)現(xiàn)DNA也具有催化活性。1986年RichardLerrur和PeterSchaltz運用單克隆抗體技術(shù)制備了具有酶活性的抗體（catalyticantibody）-abzyme。1.酶的概念

以蛋白質(zhì)為主要成分的,具有催化功能的生物催化劑。生物催化劑包括酶（protein)、核酶(DNA或RNA)、抗體酶、生物有機分子等。2.具有一般催化劑的共性自身不參與反應(yīng)。只催化熱力學上允許進行的反應(yīng)；

ΔG>0,反應(yīng)不能進行；ΔG<0,反應(yīng)才能進行。能顯著降低反應(yīng)的活化能，加快反應(yīng)速度，不改變平衡常數(shù)；二、酶的催化作用特點

過氧化氫分解反應(yīng)

沒有催化劑活化能為75.4KJ/mol

液態(tài)鈀催化劑活化能為Ea=48.9KJ/mol

過氧化氫酶活化能為EaI=8.4KJ/mol活化能：一定溫度下1摩爾底物全部進入活化態(tài)所需的自由能。3、酶作為生物催化劑的特點（1）反應(yīng)條件溫和酶是生物大分子，高溫高壓、強酸強堿、重金屬鹽均容易變性；酶催化反應(yīng)往往在常溫、常壓、接近中性酸堿條件下進行；（2）催化效率高酶的催化效率用轉(zhuǎn)換數(shù)（Turnovernumber,等于催化常數(shù)Kcal）表示，即一定條件下每秒鐘每個酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，一般其Kcal在1s-1到104s-1間；假若酶分子中含有幾個催化中心，即指每分子各催化中心所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)之和。反應(yīng)速度與不加催化劑相比可提高108～1020，與加普通催化劑相比可提高107～1013，如食品在腸胃中消化，唾液淀粉酶稀釋100倍還有催化活力；（3）具有高度專一性即酶只能對特定的一種或一類底物起作用，這種專一性是由酶蛋白的立體結(jié)構(gòu)所決定的。絕對專一性，有些酶只作用于一種底物，催化一個反應(yīng)；相對專一性，這類酶對結(jié)構(gòu)相近的一類底物都有作用。包括鍵專一性和簇（基團）專一性；立體異構(gòu)專一性，這類酶只能辨別某一構(gòu)型的立體異構(gòu)體，而不催化其他異構(gòu)體，包括旋光異構(gòu)專一性和幾何異構(gòu)專一性。（4）酶活性受到調(diào)節(jié)和控制

酶在細胞內(nèi)受到精密嚴格的調(diào)節(jié)控制。酶濃度調(diào)節(jié)：誘導或抑制酶的合成（如乳糖操縱子），調(diào)節(jié)酶的降解；通過激素調(diào)節(jié)酶活性:激素通過細胞膜或和胞內(nèi)受體結(jié)合引起一系列生物學效應(yīng)，以此來調(diào)節(jié)酶的活性。如乳糖酶中調(diào)節(jié)亞基（它和催化亞基結(jié)合組成全酶）受激素控制；反饋抑制調(diào)節(jié)：生物合成過程涉及多個酶催化反應(yīng)，第一個合成酶往往受到終端產(chǎn)物抑制，如細菌中的氨基酸、抗生素等的合成；抑制劑和激活劑對酶活性的調(diào)節(jié)。1、酶的化學本質(zhì)

除了核酶外，酶絕大部分是蛋白質(zhì)，或是帶有輔因子的蛋白質(zhì)。生物催化劑包括蛋白酶（protein)、核酶(DNA或RNA)、抗體酶、生物有機分子等。2、酶的組成（1）單純蛋白質(zhì)（simpleprotein）：除蛋白外不含其它成分的酶，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。（2）綴合蛋白質(zhì)（conjugatedprotein）全酶(holoenzyme）：具有催化活性的酶蛋白，由脫輔酶和輔因子組成；脫輔酶（apoenzyme）：只有與輔因子結(jié)合才有催化活性的蛋白亞基輔因子（cofacter)：與脫輔酶結(jié)合的對熱穩(wěn)定的非蛋白小分子或金屬離子，分為輔酶（coenzyme)和輔基(prostheticgroup)。三、酶的化學本質(zhì)及其組成3、輔因子

酶的輔因子是酶的對熱穩(wěn)定的非蛋白小分子物質(zhì)或金屬離子，其主要作用是作為電子、原子或某些基團的載體參與反應(yīng)并促進整個催化過程。輔因子有兩類輔酶和輔基，所有輔酶與酶蛋白是非共價結(jié)合的，而輔基是共價結(jié)合的。傳遞電子體：如卟啉鐵、鐵硫簇；傳遞氫（遞氫體）：如FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸；傳遞?；w：如C0A、TPP、硫辛酸；傳遞一碳基團：如四氫葉酸；傳遞磷酸基：如ATP、GTP；其它作用：轉(zhuǎn)氨基如VB6，傳遞CO2如生物素。4、單體酶、寡聚酶和多酶復合體(1)單體酶（monomericenzyme）

由一條肽鏈組成的酶，只有單一的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)成。一般為水解酶，其分子量在1-3.5萬道爾頓。(2)寡聚酶（oligomericenzyme）

由多個（兩個以上）具有三級結(jié)構(gòu)的亞基聚合而成，亞基之間靠次級鍵結(jié)合，分子量在3.5萬道爾頓以上，許多寡聚酶是調(diào)節(jié)酶。(3)多酶復合體(multienzymecomplex)

由幾個功能相關(guān)的酶嵌合而成的復合體，有利于系列催化反應(yīng)的進行。如抗生素合成反應(yīng)中的聚酮合酶PKS.I型聚酮合酶PKS1、分子結(jié)構(gòu)上：各個功能域以融合蛋白形式存在，構(gòu)成一個個模塊；2、催化過程中：各個功能域只催化一步反應(yīng)；3、最小PKS：KS、AT、ACP是各個模塊中必需含有的功能域。納他霉素合成機理1、酶的命名(1)習慣命名法根據(jù)其催化底物或合成產(chǎn)物來命名；根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名；結(jié)合上述兩個原則來命名，有時加上酶的來源或其它特點。如琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶等（2）國際系統(tǒng)命名法系統(tǒng)名稱明確標明底物名稱催化反應(yīng)性質(zhì)，

若兩個底物，中間用“：”隔開（若底物其中一個是水可不表示），最后加一個酶字；四、酶的分類及命名如谷丙轉(zhuǎn)氨酶，系統(tǒng)名稱:丙氨酸：

-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶其酶催化的反應(yīng):

-酮戊二酸+丙氨酸

谷氨酸+丙酮酸(3)國際系統(tǒng)分類與酶的編號EC(EnzymeCommission)四位數(shù)字編號法：用4個阿拉伯數(shù)字的編號表示，數(shù)字中用“·”隔開，前面冠以EC。數(shù)字按反應(yīng)類型、底物、底物被作用的基團和鍵，即EC類.亞類.亞亞類.排號；每個酶只能有一個名稱和一個編號。葡萄糖氧化酶系統(tǒng)名稱為β-D葡萄糖：氧化還原酶葡萄糖氧化酶系統(tǒng)編號為EC1.1.3.4，表示為氧化還原酶（第一位數(shù)字）、作用于CHOH（第二位數(shù)字）、受體是分子氧（第三位數(shù)字）、第四位數(shù)字僅表示在亞亞類的位置。2.酶的分類(1)氧化-還原酶（Oxidoreductase）催化氧化-還原反應(yīng),主要包括脫氫酶(Dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase),如乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。（2）轉(zhuǎn)移酶（Transferase）轉(zhuǎn)移酶催化基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個底物分子的基團或原子轉(zhuǎn)移到另一個底物的分子上，例如谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。(3)水解酶（Hydrolase）

水解酶催化底物的加水分解反應(yīng),包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等，例如脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)；(4)裂解酶（Lyase）裂合酶催化從底物分子中移去一個基團或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)，包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等，例如延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。(5)異構(gòu)酶（Isomerase）

異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團或原子的重排過程，例如6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。(6)合成酶（LigaseorSynthetase）合成酶又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的形成反應(yīng)，這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。

A+B+ATP+H-O-H==A-B+ADP+Pi

例如丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)：丙酮酸+CO2

草酰乙酸

五、酶的專一性1、結(jié)構(gòu)專一性

（1）絕對專一性：只作用于一個底物。與底物結(jié)構(gòu)類似的化合物只能成為競爭性抑制劑或無影響。如脲酶只水解尿素，而不能水解尿素的各種衍生物。（2）相對專一性：作用對象為結(jié)構(gòu)相近的一類底物?；鶊F專一性：對鍵兩端的基團要求程度不同,一個要求嚴，另一個不嚴；如凝血酶只水解羧基端為L-精氨酸、氨基端為甘氨酸的肽鍵。鍵專一性：只作用于特定的化學鍵，對鍵兩端的基團無嚴格要求。如酯酶水解酯鍵對不同的酯類沒有要求，只是水解速率不同。2、立體異構(gòu)專一性底物的立體構(gòu)型影響酶和底物的結(jié)合與催化。（1）旋光異構(gòu)專一性：當?shù)孜锞哂行猱悩?gòu)體時，酶只作用于其中的一種。如精氨酸酶只能催化L-精氨酸水解,對D-精氨酸則無作用,這種立體異構(gòu)專一性是由于酶活性中心與相應(yīng)底物的結(jié)合必須是二者在構(gòu)型或構(gòu)象上彼此匹配才能建立。（2）幾何異構(gòu)專一性：當?shù)孜锞哂许樂磶缀萎悩?gòu)體時，酶只作用于其中的一種。延胡索酸(反丁烯二酸)L(+)蘋果酸3、酶的活性中心（activecenter）

（1）概念酶分子中直接和底物結(jié)合并起催化反應(yīng)的空間局限，分為結(jié)合部位和催化部位，總稱為酶的活性中心；對不需輔酶的酶，活性中心就是酶分子在三維結(jié)構(gòu)上較靠近的少數(shù)幾個氨基酸殘基或這些殘基上的某些基團，它們在一級結(jié)構(gòu)上可能相距甚遠，甚至位于不同肽鏈上，通過肽鏈的盤繞折疊在空間構(gòu)象上相互靠近；對需要輔酶的酶，輔酶分子或其某一部分往往就是活性中心的組成部分。（2）活性中心的組成

酶的活性中心分為結(jié)合部位和催化部位結(jié)合部位(Bindingsite)

酶分子中與底物結(jié)合的區(qū)域稱為結(jié)合部位，一般由1-數(shù)個aa組成，結(jié)合部位決定酶專一性；催化部位(Catalyticsite)

酶分子中促使底物發(fā)生化學變化的區(qū)域稱為催化部位，催化部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。胰凝乳蛋白酶調(diào)控部位(Regulatorysite)

酶分子中存在著一些可以與其他分子發(fā)生某種程度的結(jié)合的部位，從而引起酶分子空間構(gòu)象的變化，對酶起激活或抑制作用。必須基團：酶表現(xiàn)催化活性不可缺少的基團。親核性基團：絲氨酸的羥基、半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基。酸堿性基團：天冬氨酸和谷氨酸的羧基、賴氨酸的氨基、酪氨酸的酚羥基、組氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巰基等。親核性基團酸堿性基團胰凝乳蛋白酶

（3）酶活性中心的特點活性部位在酶分子的總體中只占相當小的部分，往往只由幾個氨基酸殘基組成；酶的活性部位是一個三維實體：活性部位的三維結(jié)構(gòu)是由酶的一級結(jié)構(gòu)所決定的?；钚圆课坏陌被釟埢谝患壗Y(jié)構(gòu)上可能相距甚遠，但在肽鏈的盤繞、折疊而在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近；酶活性部位是一個疏水區(qū)域：酶的活性部位是位于酶分子表面的一個裂縫內(nèi)，這是相當疏水的區(qū)域，非極性基團較多，產(chǎn)生一個微環(huán)境，提高與底物的結(jié)合能力；而其內(nèi)少量的極性氨基酸殘基可與底物結(jié)合而發(fā)生催化作用；底物通過次級鍵較弱的力結(jié)合到酶上：酶與底物結(jié)合成ES復合物主要靠次級鍵：氫鍵、鹽鍵、范德華力和疏水相互作用；酶活性部位具有柔性或可運動性。4、酶作用專一性的假說

（1）鎖與鑰匙學說

1894年EmilFisher提出，認為底物分子或其中的部分專一地楔入到酶的活性中心部位，即底物分子的化學部位與酶分子催化基團間有緊密互補的關(guān)系。如何解釋可逆反應(yīng)？

（2）三點附著學說

認為立體對映的一對底物雖然基團相同，但空間排列不同，這樣就存在這些基團與酶分子活性中心的結(jié)合基團是否匹配的問題，只有三點都互補匹配時，酶才作用于這個底物。（3）誘導楔合學說

1958年Koshland提出，認為當酶分子與底物分子接近時，酶蛋白受底物分子的誘導，其構(gòu)象發(fā)生有利于底物結(jié)合的變化，酶與底物在此基礎(chǔ)上互補楔合，引發(fā)催化反應(yīng)。己糖激酶hexokinase與底物結(jié)合前后的構(gòu)象變化六、酶的活力測定和分離純化（一）酶的活力測定1、基本概念（1）酶活力：酶催化一定化學反應(yīng)的能力稱為酶活力，又稱為酶活性，通常以一定條件下酶所催化的化學反應(yīng)速度來表示。（2）基本原理:對酶的測定不是直接測定其酶蛋白的濃度，而是測定其催化化學反應(yīng)的能力，這是基于在最優(yōu)化條件下，當?shù)孜镒銐颍ㄟ^量），在酶促反應(yīng)的初始階段，酶促反應(yīng)的速度（初速度）與酶的濃度成正比（即V=K［E］），故酶活力測定的是化學反應(yīng)速度，一定條件下可代表酶活性分子濃度。2、酶活力測定一定量的酶在單位時間內(nèi)產(chǎn)物(P)的生成（增加）量或底物（S）的消耗（減少）量，即測定時確定三種量①加入一定量的酶，②一定時間間隔，③物質(zhì)的增減量。（1）酶活力測定的內(nèi)容酶反應(yīng)初速度測定：在一個反應(yīng)體系中，當?shù)孜锪砍渥銜r，加入一定量的酶液，開始計時反應(yīng)，經(jīng)一定時間反應(yīng)后，終止反應(yīng)，測定在這一時間間隔內(nèi)發(fā)生的化學反應(yīng)量（終止時與起始時的濃度差）；酶反應(yīng)平均速度測定：在一定條件下，加入一定量底物（規(guī)定），再加入合適量的酶液，測定完成該反應(yīng)（底物反應(yīng)完）所需的時間；動態(tài)連續(xù)測定法：在反應(yīng)體系中，加入酶，用儀器連續(xù)監(jiān)測整個酶促反應(yīng)過程中底物的消耗或產(chǎn)物的生成?？焖俜磻?yīng)追蹤法：近年來，追蹤極短時間（10-3s以下）內(nèi)反應(yīng)過程的方法和裝置已經(jīng)應(yīng)用，其代表有停流法（stopped-flow）和溫度躍變法（temperaturejump）。（2）酶反應(yīng)條件優(yōu)化酶活測定的反應(yīng)條件應(yīng)該是最適條件，所謂最適條件包括最適溫度、最適pH、足夠大的底物濃度、適宜的離子強度、適當稀釋的酶液及嚴格的反應(yīng)時間，抑制劑不可有，輔助因子不可缺。（3）酶活力測定方法反應(yīng)計時：反應(yīng)計時必須準確，反應(yīng)體系必須預(yù)熱至規(guī)定溫度后，加入酶液并立即計時；反應(yīng)到時，立即滅酶活性，終止反應(yīng)，并記錄終了時間；終止酶反應(yīng)，常使酶立刻變性，最常用的方法是加入三氯乙酸或過氯酸使酶蛋白沉淀，也可用SDS使酶變性，或迅速加熱使酶變性。有些酶可用非變性法來停止反應(yīng)或用破壞其輔因子來停止反應(yīng)。反應(yīng)量的測定：可測底物減少量或產(chǎn)物生成量，在反應(yīng)過程中產(chǎn)物是從無到有，變化量明顯，極利于測定，所以大都測定產(chǎn)物的生成量。具體物質(zhì)量通過定量分析法測定，常用的方法有：

光譜分析法：酶將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄖ苯踊蜷g接）一個可用分光光度法或熒光光度法測出的化合物。

化學法：利用化學反應(yīng)使產(chǎn)物變成一個可用某種物理方法測出的化合物，然后再反過來算出酶的活性。

放射性化學法：用同位素標記的底物，經(jīng)酶作用后生成含放射性的產(chǎn)物，在一定時間內(nèi)，生成的放射性產(chǎn)物量與酶活性成正比。（4）酶活力測定舉例：福林-酚法測定蛋白酶活力，原理是以酪蛋白為底物進行反應(yīng)，用福林-酚試劑顯色，并用光度法測定反應(yīng)產(chǎn)物酪氨酸的生成量。對反應(yīng)初期進行測定，為初速度法。

3.酶活力單位（activityunit）酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力單位表示，即酶單位（U）.(1)酶活力單位定義：一定條件下一定時間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。因此酶的含量可以用U/g或U/ml表示。（2）國際單位U（Unit）：最適反應(yīng)條件下（如25Co），每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定為一個酶活力單位；以上的酶單位定義中，如果底物（S）有一個以上可被作用的化學鍵，則一個酶單位表示1分鐘使1μmol有關(guān)基團轉(zhuǎn)化的酶量。如果是兩個相同的分子參加反應(yīng)，則每分鐘催化2μmol底物轉(zhuǎn)化的酶量稱為一個酶單位。Kat單位：最適反應(yīng)條件下（25Co），每秒鐘轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量。Kat和U的換算關(guān)系：1Kat=6×107U，1U=1U=16.67nmol.s-1=16.67nKat；在“U”和“kat”酶活力單位的定義和應(yīng)用中，酶催化底物的分子量必須是已知的，否則將無法計算。（3）習慣單位

實際使用中，常采用方便、直觀，規(guī)定的酶活力單位α-淀粉酶：規(guī)定條件下，每小時分解1g可溶性淀粉的酶量為一個酶單位；糖化酶活力單位：規(guī)定條件下，每小時轉(zhuǎn)化可溶性淀粉產(chǎn)生1mg還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為一個糖化酶單位。蛋白酶：規(guī)定條件下，每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量。DNA限制性內(nèi)切酶：推薦反應(yīng)條件下，1小時內(nèi)可完全消化1μg純化的DNA所需的酶量。4、比活力（specificactivity）酶的比活力：每單位（一般是mg）蛋白中的酶活力單位數(shù)（如：U/mg蛋白）；實際應(yīng)用中也用每單位制劑中含有的酶活力數(shù)表示,如U/mL（液體制劑)、U/g（固體制劑）；比活力是評價酶純度高低的一個指標，對同一種酶來講，比活力愈高則表示酶的純度越高（含雜質(zhì)越少）。（二）酶的分離純化1、基本原則提取過程中避免酶變性而失去活性，防止強酸、強堿、高溫和劇烈攪拌等；要求在低溫下操作，加入的化學試劑不使酶變性，操作中加入緩沖溶液。

2、基本操作程序（1）選材：微生物（微生物發(fā)酵物:胞內(nèi)酶、胞外酶），動物（動物器臟：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等）;（2）破碎：胞內(nèi)酶先要進行細胞破碎，采用機械研磨、超聲波破碎、反復凍融或自溶等；（3）抽提：在低溫下，以水或低鹽緩沖液，從組織勻漿中提取酶，得到粗酶液；

（4）分離：先進行凈化處理（過濾，絮凝，離心脫色），再采用沉淀法分離（鹽析法，有機溶劑沉淀法，超離心等）;

（5）純化：可采用離子交換層析，凝膠電泳，液相色譜、親和色譜和超濾等方法。（6）結(jié)晶（7）保藏：酶粉在低溫下可較長時間保存。3、酶分離純化操作的評價回收率=每次總活力/第一次總活力總活力=比活力×總體積（總重量）純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力3、酶的制劑形式（1）固體：干燥（冰凍升華，噴霧干燥，真空干燥）;

（2）載體吸附;

（3）液體。

【例題】一位生化專業(yè)的研究生對酶進行分離純化得到以下數(shù)據(jù),請回答:(1)這六步分離純化過程，哪一步分離效果最好，哪一步最差？(2)該酶是否已經(jīng)純化，還可以用什么方法確定其是否純化？編號分離步驟總蛋白含量（mg）活力單位數(shù)（U）1粗分離2000040000002鹽析500030000003等電點分離400010000004離子交換2009000005親和層析507500006分子篩層析45675000【解答】(1)這六步的比活力與回收率見下表，可見親和層析效果最好，等電點分離效果最差(2)該酶一純化，因為分子篩已不能提高酶活力了。還可以用聚丙烯酰胺電泳進行酶蛋白的純度鑒定。編號分離步驟比活力（U/mg）回收率（%）1粗分離2001002鹽析600753等電點分離250254離子交換450022.55親和層析1500018.756分子篩層析1500016.88七、核酶、抗體酶和酶工程1、核酶：具有催化作用的RNA分子。種類：催化分子內(nèi)反應(yīng)的核酶，如自我剪接和自我剪切；催化分子間反應(yīng)的核酶；化學屬性：核酶的本質(zhì)屬性是核酸，不是蛋白質(zhì)意義：根據(jù)RNA的發(fā)夾或錘頭狀結(jié)構(gòu)原理，可以設(shè)計各種人工核酶，用作抗病毒和抗腫瘤的防治藥物2、抗體酶：具有催化能力的蛋白質(zhì)，本質(zhì)上是免疫球蛋白，但在易變區(qū)賦予了酶的特性。根據(jù)酶催化的過渡態(tài)理論，可以設(shè)計各種過渡態(tài)類似物作為半抗原免疫動物（如鼠、兔），篩選具有催化活性的單抗。

3、酶工程（1）化學酶工程：指天然酶、化學修飾酶、固定化酶和人工模擬酶的研究與應(yīng)用?；瘜W修飾酶：通過對酶分子表面進行修飾（如交聯(lián)反應(yīng)、大分子修飾酶蛋白側(cè)鏈），或?qū)γ阜肿拥膬?nèi)部功能基團進行修飾，獲得性能改善的酶。人工模擬酶：模擬酶的生物催化功能，用化學合成（或半合成）的人工催化劑固定化酶：通過吸附、耦聯(lián)、交聯(lián)和包埋等理化方法把酶連接到某種載體上，制成仍具有酶催化活性的水不溶性酶。固定化酶具有高穩(wěn)定性、易分離、可反復使用、高機械強度等特點。（2）生物酶工程：利用基因技術(shù)大量生產(chǎn)酶、產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）、構(gòu)建新酶（自然界沒有）的生物技術(shù)（3）固定化酶的固定化方法吸附法（Adsorption）：把酶吸附于惰性載體上或吸附于離子交換樹脂上，利用酶和載體間的非特異性物理吸附或特異吸附作用將酶固定到載體表面。包埋法（Entrapment）：利用高分子物理截留作用將酶限制在聚合網(wǎng)絡(luò)中的方法，主要是依靠物理作用，個別也存在化學鍵作用，主要有凝膠包埋法、纖維包埋法、微囊化包埋法等。交聯(lián)法（Cross－linking）：利用醛類、胺類和水合金屬氧化物等具有雙功能或多功能基團的交聯(lián)劑與酶之間以共價鍵交聯(lián)形成不溶性大分子而加以固定化的方法。共價結(jié)合法（Covalentattachment）：利用酶蛋白質(zhì)上非生物活性部位的功能基團（如氨基、羧基、酪氨酸的苯環(huán)、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基及絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的羥基等）與經(jīng)過化學修飾而活化的載體之間通過共價鍵結(jié)合的方法。該方法的特點是結(jié)合力強，不易脫落，熱穩(wěn)定性強；但是缺點是操作復雜，反應(yīng)條件不易控制，酶活性損失較大。定向固定法：把酶和載體在酶的特定位點上連接起來，使酶在載體表面按一定的方向排列，使它的活性位點面朝固體表面的外側(cè)排列，有利于底物進入到酶的活性位點，能夠顯著提高固定化酶的活性，比隨意固定化酶的方法具有很大的優(yōu)越性。包括酶和抗體的親和連接、酶通過糖基固定、酶和金屬離子連接固定等。內(nèi)容提要1、術(shù)語解釋：酶、全酶、脫輔基酶蛋白；輔因子、輔酶、輔基；單體酶、寡聚酶、多酶復合體；核酶、抗體酶、固定化酶、人工模擬酶；酶活力、酶活力單位、比活。2、酶是生物催化劑，除某些RNA外酶是蛋白質(zhì)或是帶有輔助因子的蛋白質(zhì)。酶具有一般催化劑的性質(zhì)，可以通過降低活化能來提高反應(yīng)速度，使反應(yīng)快速達到平衡點，但不能改變平衡點。3、酶的顯著特點是反應(yīng)條件溫和、催化效率高、具有高度的催化專一性和易受多種因素的影響和調(diào)控。4、酶的化學組成可分為單純蛋白和綴合蛋白，綴合蛋白由不能單獨表現(xiàn)酶活性的脫輔基酶蛋白和輔因子組成；脫輔基酶蛋白決定酶催化專一性，輔因子在催化反應(yīng)中起傳遞電子、原子或某些化學基團的作用；輔因子中輔酶與脫輔基酶蛋白費共價結(jié)合、輔基與酶蛋白共價結(jié)合。5、酶可以按照催化反應(yīng)的類型，分外脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和合成酶（連接酶）；每種酶都有一個習慣名稱和國際系統(tǒng)名稱，并且有一個編號。6、酶的活性部位是一個三維結(jié)構(gòu)的疏水裂隙，除含有疏水氨基酸殘基，還含少量的極性氨基酸殘基，極性氨基酸殘基常參與催化反應(yīng)。酶活性部位的可離子化和可反應(yīng)的氨基酸殘基形成酶的催化中心。誘導楔合學說可以解釋酶的催化反應(yīng)機制。7、酶的專一性分為相對專一性、絕對專一性和立體異構(gòu)專一性，其中相對專一性又分為基團專一性和鍵專一性，立體異構(gòu)專一性又分為旋光專一性、幾何構(gòu)型專一性。8、酶的活力就是酶催化反應(yīng)的能力，酶活力單位用于表示酶的含量或活力的一種量度；比活是每克酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)，比活測定是酶純化的監(jiān)測指標，對同一種酶而言，比活越大，酶的純度越高。習題1、簡單闡述酶和無機催化劑的異同點，并說明核酶、抗體酶和普通酶的區(qū)別。2、稱取25mg酶制劑配制25ml酶溶液，從中取出0.1ml酶溶液，以酪蛋白為底物，用福林酚-比色法測定酶活力，得知1小時產(chǎn)生1500μg的酪氨酸；另取2ml酶溶液用凱氏定氮法測得蛋白氮為0.2mg。若以產(chǎn)生1μg/ml酪氨酸的酶量為1個活力單位，請計算：（1）1ml酶溶液所含蛋白質(zhì)量和酶活力單位；（2）酶溶液的比活力；（3）1g酶制劑的總蛋白含量和總活力。3、從肝細胞中提取一種水解酶的粗提液300ml含150mg蛋白質(zhì)，總活力為360單位。經(jīng)過系列純化得到4ml酶制劑（含0.08mg蛋白），總活力為288單位，整個純化過程收率是多少？純化了多少倍？答案2、（1）1ml酶溶液含0.625mg蛋白質(zhì),酶活力單位為250單位；（2）酶溶液的比活力400單位/mg;

（3）1g酶制劑的總蛋白含量為0.625mg和總活力2.5×105單位.3、純化過程收率為80%，純化了1500倍。Section2酶促反應(yīng)動力學

濃度對酶反應(yīng)速率的影響抑制劑對酶反應(yīng)速率的影響溫度對酶反應(yīng)速率的影響pH對酶反應(yīng)速率的影響激活劑對酶反應(yīng)速率的影響酶促反應(yīng)動力學的推導方法一、底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響1、中間絡(luò)合物學說酶與底物先絡(luò)合成一個過渡態(tài)絡(luò)合物，然后絡(luò)合物進一步分解為產(chǎn)物和游離態(tài)酶。這個學說的前提是酶與底物反應(yīng)的“快速平衡”，即在反應(yīng)的開始階段，兩者反應(yīng)速度很快，迅速建立平衡關(guān)系。

第一步：酶（E）與底物（S）作用，形成酶-底物中間產(chǎn)物（ES）：E+S←→ES(k1和k2是正、逆反應(yīng)的速度常數(shù))

第二步：中間產(chǎn)物分解，形成產(chǎn)物（P），釋放出游離酶(E)：

ES←→P+E

實驗證明了E－S復合物的存在，E－S復合物形成的速率與酶和底物的性質(zhì)有關(guān)。K1K2K3活化能：一定溫度下1摩爾底物全部進入活化態(tài)所需的自由能，Ea=Pa-Pe。自由能：ΔG=Pp-Pe<0過渡態(tài)絡(luò)合物ES反應(yīng)物S產(chǎn)物P2、底物對酶促反應(yīng)的影響在酶濃度、pH、溫度等條件不變的情況下，一級反應(yīng)：當?shù)偷孜餄舛葧r，反應(yīng)速度與底物濃度呈正比；混合級反應(yīng)：隨底物濃度增加，反應(yīng)速度不再按正比升高；零級反應(yīng)：繼續(xù)增大底物濃度，反應(yīng)速度遞增為零，這時反應(yīng)速度已趨向一個極限，說明酶已被底物飽和。

3、酶促反應(yīng)動力學（1）米氏方程

1913年，德國化學家Michaelis和Menten根據(jù)中間絡(luò)合物學說對酶促反應(yīng)的動力學進行研究，推導出了表示整個反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。Km

—

米氏常數(shù)Vmax

—

最大反應(yīng)速度簡單起見，只考慮單底物和單產(chǎn)物的催化反應(yīng):反應(yīng)初期，[P]的濃度非常低，因此整個反應(yīng)可簡化為:（2）米氏方程的推導(Michaelis-Menten)

根據(jù)中間絡(luò)合物學說，酶促反應(yīng)分兩步進行:K2

K3

K3

K2

整個酶促反應(yīng)中，反應(yīng)的限速步驟為[ES]分解生成[E]和[P]的過程，因此反應(yīng)的初速度可以表示為反應(yīng)過程中，游離的酶濃度可以表示為反應(yīng)過程中，底物濃度[S]是遠遠高于酶濃度的[Et]，即[S]>>[Et],所以游離的底物濃度可以用[S]計算。V=k3[ES][Et]=[E]+[ES]

，其中Et為酶的總濃度

（3）米氏常數(shù)Km的意義由米氏方程可知，當反應(yīng)速度等于最大反應(yīng)速度一半時,即V=1/2Vmax,Km=[S]

米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時的底物濃度，米氏常數(shù)的單位為mol/L。Km值表示酶與底物之間的親和程度。Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高；Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值；不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個重要的特征物理常數(shù)。（4）米氏常數(shù)Km的測定

測定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法—雙倒數(shù)作圖法。取米氏方程式的倒數(shù)形式，以底物濃度倒數(shù)對反應(yīng)速度倒數(shù)作圖，得到方程，就可解出Vmax和Km。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km【例題1】對于一個遵循米氏動力學的酶，（1）當[S]=Km時，V=35μmol/min,求Vmax？（2）當[S]=2×10-5M，V=40μmol/min

時，求Km?【解】

(1)

Vmax=V（Km+[S]）/[S]=35([S]+[S])/[S]=70(μmol/min)(2)Km=Vmax[S]/V-[S]=70×2×10-5/40-2×10-5

=1.5×10-5M

4、多底物酶促反應(yīng)動力學

大多數(shù)酶反應(yīng)包含一種以上的底物：A+B→P+Q依次反應(yīng)機理（需要NAD+或NADH+的脫氫酶的反應(yīng)屬于這類型）：

BPE+AEAEABEPQEQE+Q

2)隨機機理：

E+A←→EABQEP←→E+PEAB←→EPQE+B←→EBAPEQ←→E+Q3)乒乓反應(yīng)機理（轉(zhuǎn)氨酶的反應(yīng)屬于這類型）

：

APBQEE兩種不同模式的雙底物反應(yīng)順次式(sequential)乒乓式(ping-pong)雙底物反應(yīng)的米氏方程當P1,P2=0時二、抑制劑對酶反應(yīng)的影響1、酶的抑制作用有些物質(zhì)與酶分子上某些必須基團結(jié)合（作用),使酶的活性中心的化學性質(zhì)發(fā)生改變，導致酶活力下降或喪失，這種現(xiàn)象稱為酶抑制作用。能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑（inhibitor);酶的抑制劑一般具備兩個方面的特點：化學結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似；能夠與酶的活性中心以非共價或共價的方式形成比較穩(wěn)定的復合體或結(jié)合物。2、抑制作用的類型根據(jù)酶活性變化可分為可逆與不可逆二類

不可逆抑制作用：抑制劑與酶反應(yīng)中心的活性基團以共價形式結(jié)合，引起酶的永久性失活。如有機磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。

可逆抑制作用：抑制劑與酶蛋白以非共價方式結(jié)合，引起酶活性暫時性喪失。抑制劑可以通過透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復酶的活性。根椐可逆抑制劑與酶結(jié)合情況可分為競爭性抑制、非競爭性抑制與反競爭性抑制三類。3、競爭性抑制抑制劑的化學結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟爭與酶活性中心結(jié)合。當抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。竟爭性抑制通常可以通過增大底物濃度，提高底物濃度可以降低抑制作用。競爭性抑制可用下式表示：草酸鹽草酰乙酸鹽丙二酸戊二酸

競爭性抑制劑存在時，Km值增大(1+[I]/Ki)倍，且Km值隨[I]的增高而增大；[E]固定時，當[S]﹥﹥Km(1+[I]/Ki),Km(1+[I]/Ki)項可忽略不計，則v=Vmax，即最大反應(yīng)速度不變。競爭性抑制作用的速度方程競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖4、非競爭性抑制抑制劑不是與底物競爭與活性中心的結(jié)合，稱為非競爭性抑制。

酶同時與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，導至酶活性下降。如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競爭性抑制；不能通過增大底物濃度的方法來解除抑制作用；反應(yīng)過程中有三元復合物存在。非競爭性抑制可用下式表示：非競爭性抑制劑存在時，V值減小(1+[I]/Ki)倍，且V值隨[I]的增高而降低；但Km值不變。非競爭性抑制作用的速度方程非競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖

反競爭性抑制劑存在時，Km和V值均減小(1+[I]/Ki)倍，且都隨[I]的增高而降低。5、反競爭性抑制酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合，引起酶活性下降。反競爭性抑制可用下式表示：反競爭性抑制作用的速度方程反競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖I競爭性抑制反競爭性抑制非競爭性抑制競爭性抑制不改變Vmax，非競爭性抑制不改變Km，反競爭性抑制兩者均發(fā)生變化；總結(jié)競爭性抑制：非競爭性抑制：反競爭性抑制：競爭性抑制改變橫截距（Km

變大），非競爭性抑制改變縱截距（Vmax

變小）；反競爭性抑制，Km和

Vmax

值均減小。【例題2】假設(shè)濃度為2×10-5mol/L的某抑制劑抑制了一個酶催化反應(yīng)的75%，求這個非競爭性抑制的Ki?【解】

已知:[I]=2×10-5mol/L，V’max/Vmax=0.25

V’max/Vmax=1/(1+[I]/Ki)=1/(1+2×10-5/Ki)=0.25

所以:Ki=6.7×10-5mol/L

三、溫度對酶反應(yīng)的影響

1、酶的最適溫度：酶達到最大反應(yīng)速度時的溫度最適溫度是酶的特征之一，但不是一個特征常數(shù)，它與反應(yīng)時間、溶液的離子強度、緩沖溶液種類有關(guān)最適溫度2、溫度對酶促反應(yīng)的影響溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快；另一方面,溫度升高,酶的高級結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導致酶活性降低甚至喪失。因此酶的最適合溫度是二者平衡的結(jié)果.3、大部分酶在60Co以上失活變性。一般動物酶的最適溫度在35-40Co，植物酶的最適溫度在40-50Co。少數(shù)酶能耐受高溫，如細菌耐高溫淀粉酶在93Co時活力最大，牛胰核糖核酸酶在100Co時仍不失活。4、酶在干燥情況下比在潮濕情況下耐受的溫度高，這一點可用于酶的保存。四、pH對酶反應(yīng)的影響1、最適pH：酶具有最大的催化活性，酶促反應(yīng)速度達到最大時的溶液pH。2、pH對酶活力的影響影響酶活性中心基團的解離影響底物某些基團的解離影響酶蛋白空間構(gòu)象，甚至失活3、最適pH是酶的特征之一，但不是一個特征常數(shù)，它與底物種類、濃度和緩沖溶液成分有關(guān)，而且與酶的等電點不一致.五、酶濃度對酶反應(yīng)的影響1、在底物足夠過量而其它條件固定的情況下，并且反應(yīng)系統(tǒng)中不含有抑制酶活性的物質(zhì)及其他不利于酶發(fā)揮作用的因素，酶促反應(yīng)的速度和酶濃度成正比。2、有時出現(xiàn)酶濃度增大，反應(yīng)速度反而下降的現(xiàn)象，這是由于酶純度不夠，含有抑制酶活性的物質(zhì)。六、激活劑對酶作用的影響1、激活劑凡是能提高酶活力的簡單化合物都稱為激活劑（activator)，大部分是一些無機離子和小分子簡單有機物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等；2、激活劑的激活作用具有相對性

一般情況下，一種激活劑對某種酶是激活劑，而對另一種酶則起抑制作用；對于同一種酶，不同激活劑濃度會產(chǎn)生不同的作用，濃度過大甚至會出現(xiàn)抑制作用。3、作用機理（1）離子激活劑：可與酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團結(jié)合，可能是酶活性部位的組成部分，也可能作為輔酶或輔基的一個組成部分起作用；（2）小分子激活劑：如巰基乙醇、半胱氨酸主要是飽和酶分子中的巰基；（3）螯合劑EDTA：解除某些重金屬離子對酶的抑制作用。（一）快速平衡法1、酶和底物首先形成復合物，快速達到平衡，隨后才轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。2、推導假設(shè)[S]》[E]V=dp/dt|t=0=

ds/dt|t=0等溫條件下、穩(wěn)定pH（緩沖溶液中）單底物反應(yīng)不考慮酶的失活六、酶促反應(yīng)動力學方程的推導3、推導過程解離常數(shù)：

Km=K-1/K1=[S][E]/[ES]決速步反應(yīng)：

V=dp/dt=K2[ES]總酶濃度：[Et]=[E]+[ES]所以：Km=[S]（[Et]-[ES]）/[ES][ES]=[S][Et]/（Km+[S]）

V=K2[ES]=K2[S][Et]/（Km+[S]）故：V=Vmax[S]/（Km+[S]）

這就是著名的米氏方程

Vmax=K2[Et],Km=K-1/K1內(nèi)容提要1、術(shù)語解釋：米氏常數(shù)、競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制；酶的最適溫度、酶的最適pH、激活劑；2、酶動力學的測定常常是測定反應(yīng)的起始速度，酶促反應(yīng)的第一步是形成酶-底絡(luò)合物。在反應(yīng)起始時，酶促反應(yīng)對酶濃度時一級反應(yīng)，相對于底物濃度的變化表現(xiàn)為典型的雙曲線特征，當酶被底物飽和時達到最大反應(yīng)速度Vmax,3、米氏方程描述酶動力學行為。米氏常數(shù)Km等于反應(yīng)速度一半時的底物濃度，Km是酶的特征常數(shù)。Km是酶對底物親和力的量度，Km越少，表明酶對底物的親和力越大。4、酶促反應(yīng)受到抑制劑的影響。酶抑制劑可分為可逆抑制和不可逆抑制，可逆抑制劑與酶非共價結(jié)合，不可逆抑制劑與酶活性部位的功能基團共價結(jié)合。5、可逆抑制可分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。競爭性抑制不改變Vmax、Km變大，非競爭性抑制不改變Km、Vmax變小，反競爭性抑制，Km和Vmax值均減小。6、酶促反應(yīng)受pH和溫度的影響，大多數(shù)酶都存在一個最適pH和最適溫度，在最適pH和最適溫度下，酶促反應(yīng)具有最大的反應(yīng)速度，但最適pH和最適溫度都不是酶的特征常數(shù)。大多數(shù)酶的反應(yīng)速度-pH以及反應(yīng)速度-溫度曲線是鐘形曲線。習題1、請推導米氏動力學方程2、一個遵循米氏動力學酶的Km為3.0

mol/L，問酶活性部位被底物飽和的分數(shù)分別為10%、50%、90%時，底物濃度分別為多少？3、某酶的Km為4.7×10-5mol/L，最大反應(yīng)速度為22μmol/min，底物濃度為2×10-4mol/L，計算（1）當競爭性抑制劑濃度為5×10-4mol/L、非競爭性抑制劑濃度亦為5×10-4mol/L時，Ki均為3×10-4mol/L時酶的催化反應(yīng)速度？（2）上述兩種情況抑制的百分比是多少？答案2、（1）V=10%Vmax

則：10%=[s]/([s]+Km)，[S]=Km/9=3.0/9=0.33mol/L(2)V=50%Vmax,[S]=Km=3.0mol/L(3)V=90%Vmax,同法得：[S]=9Km=27mol/L3、（1）當競爭性抑制劑濃度為5×10-4mol/L時

V1=Vmax·[s]/(km(1+[I]/ki)+[S])=13.5μmol/L·min

（2）當非競爭性抑制劑濃度為3×10-4mol/L時

V2=Vmax·[s]/(km+[S])(1+[I]/ki)=6.68μmol/L·min

（3）沒有抑制劑時的酶催化速度

V=Vmax·[s]/(km+[S])=17.8μmol/L·min

故：競爭性抑制的抑制百分比=1-V1/V=24%

非競爭性抑制的抑制百分比=1-V2/V=62.5%答案2、（1）V=10%Vmax

則：10%=[s]/([s]+Km)，[S]=Km/9=3.0/9=0.33mol/L(2)V=50%Vmax,[S]=Km=3.0mol/L(3)V=90%Vmax,同法得：[S]=9Km=27mol/L3、（1）當競爭性抑制劑濃度為5×10-4mol/L時

V1=Vmax·[s]/(km(1+[I]/ki)+[S])=13.5μmol/L·min

（2）當非競爭性抑制劑濃度為3×10-4mol/L時

V2=Vmax·[s]/(km+[S])(1+[I]/ki)=6.68μmol/L·min

（3）沒有抑制劑時的酶催化速度

V=Vmax·[s]/(km+[S])=17.8μmol/L·min

故：競爭性抑制的抑制百分比=1-V1/V=24%

非競爭性抑制的抑制百分比=1-V2/V=62.5%Section3、酶作用機制和酶的調(diào)節(jié)酶的活性中心影響酶催化效率的因素酶催化反應(yīng)機制的實例酶的活性調(diào)節(jié)同工酶和多酶體系一、酶的活性中心（activecenter）

1、概念對于不需要輔酶的酶來說，活性中心就是酶分子在三維結(jié)構(gòu)上比較靠近的少數(shù)幾個氨基酸殘基或是這些殘基上的某些基團，它們在一級結(jié)構(gòu)上可能相距甚遠，甚至位于不同的肽鏈上，通過肽鏈的盤繞，折疊而在空間構(gòu)象上相互靠近；對于需要輔酶的酶來說，輔酶分子或其某一部分往往就是活性中心的組成部分。2、活性中心的功能部位結(jié)合部位：一定的底物靠此部位結(jié)合到酶分子上；催化部位：底物的鍵在此部位被打斷或形成新的鍵，從而發(fā)生一定的化學變化。

3、酶活性部位的特點活性部位在酶分子的總體中只占相當小的部分：往往只由幾個氨基酸殘基組成；酶的活性部位是一個三維實體：活性部位的三維結(jié)構(gòu)是由酶的一級結(jié)構(gòu)所決定的?；钚圆课坏陌被釟埢谝患壗Y(jié)構(gòu)上可能相距甚遠，但在肽鏈的盤繞、折疊而在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近；酶活性部位是一個疏水區(qū)域：酶的活性部位是位于酶分子表面的一個裂縫，這是相當疏水的區(qū)域，非極性基團較多，產(chǎn)生一個微環(huán)境，此裂縫內(nèi)的底物濃度相當高，從而提高了與底物的結(jié)合能力；而其內(nèi)少量的極性氨基酸殘基可與底物結(jié)合而發(fā)生催化作用；誘導契合是一個動態(tài)的辨認過程：酶的活性部位與底物結(jié)合中，酶與底物的構(gòu)象發(fā)生變化后互補，即誘導契合是一個動態(tài)的辨認過程。底物通過次級鍵較弱的力結(jié)合到酶上：酶與底物結(jié)合成ES復合物，主要作用力為次級鍵（氫鍵、鹽鍵、范德華力和疏水相互作用）；酶活性部位具有柔性或可運動性。二、影響酶催化效率的因素1、酶與底物的臨近效應(yīng)與定向效應(yīng)（1）臨近效應(yīng)指兩個反應(yīng)的分子，它們反應(yīng)的基團需互相靠近，才能反應(yīng)。酶促反應(yīng)速度與底物濃度成正比，底物與酶活性中心的靠近，提高活性中心的底物有效濃度，從而大大提高酶促反應(yīng)速度。（2）定向效應(yīng)指酶的催化基團與底物的反應(yīng)基團之間的正確定向。當?shù)孜锱c活性中心結(jié)合時，酶蛋白經(jīng)誘導而發(fā)生構(gòu)象變化，底物反應(yīng)部位（基團或鍵）與酶的催化部位發(fā)生楔合，即“定向”作用，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點。2、底物的形變和誘導契合

底物與酶結(jié)合誘導酶的分子構(gòu)象變化，變化的酶分子又使底物分子的敏感鍵產(chǎn)生“張力”甚至“形變”，產(chǎn)生“電子張力”而引起敏感鍵的一端更加敏感，使底物比較接近它的過渡態(tài)，形成一個相互契合的酶-底復合物，進一步轉(zhuǎn)換成過渡態(tài)，降低反應(yīng)活化能，大大提高酶促反應(yīng)速度。3、酸堿催化酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸－堿催化方式。廣義酸－堿催化是指通過質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子,或是通過質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達到降低反應(yīng)活化能的過程。

廣義酸基團（質(zhì)子供體）廣義堿基團（質(zhì)子受體）

酶活性中心上有的基團是質(zhì)子供體，有的為質(zhì)子受體，均可進行催化作用。酶蛋白中起廣義酸堿催化作用的功能基：氨基、羰基、羧基、硫氫基、酚羥基和咪唑基。組氨酸的咪唑基：既是很強的親核基團，又是有效的廣義酸堿功能基。1）其解離常數(shù)約6.0，即其解離下來的質(zhì)子濃度與水中的[H+]相近，所以在中性條件下，有一半以酸形式存在，另一半以堿形式存在，即可作為質(zhì)子供體，又可作質(zhì)子受體而在酶反應(yīng)中起催化作用；2）其供出和接受質(zhì)子的速度十分迅速，且供出和接受的速度相等。

4、共價催化催化劑通過與底物形成反應(yīng)活性很高的共價過渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過程，稱為共價催化；酶的親核基團（如羥基、巰基）對底物的親電子中心進行攻擊。親核基團含有可提供電子的原子，向底物親電子的原子提供電子，由此形成不穩(wěn)定的共價中間物。但酶的親核基團易變，所形成的共價中間物不穩(wěn)定，隨后會被水分子或第二種底物攻擊而給出所需的產(chǎn)物，由此可加快中間物的分解而釋放出產(chǎn)物。酶蛋白分子上的主要親核基團：Ser的的羥基、Cys的硫基、His的咪唑基、Asp的羧基。某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價催化作用。5、金屬離子催化（1）金屬離子催化：大部分酶的催化活性需要金屬離子的參與。（2）分類金屬酶:金屬離子作為酶的輔基金屬激活酶：金屬離子作為酶的激活劑（3）機理通過結(jié)合底物為反應(yīng)定向；通過可逆地改變金屬離子的氧化態(tài)調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)；通過靜電穩(wěn)定或屏蔽負電荷。6、活性部位微環(huán)境的影響某些酶的活性中心穴內(nèi)相對是非極性的，催化基團被低介電環(huán)境包圍，并排除高極性的水分子。這樣，底物分子的敏感鍵和酶的催化基團之間就會有很大的反應(yīng)力。水會減弱極性基團間的相互作用。水的極性和形成氫鍵的能力很大，水的介電常數(shù)極高。這種高極性使它在離子外形成定向的溶劑層，產(chǎn)生自身的電場，從而大大減少了它所所包圍的離子間的靜電作用或氫鍵作用。三、酶催化反應(yīng)機制的實例1、溶菌酶溶菌酶的生物學功能是催化細菌細胞壁多糖的水解。（1）細胞壁多糖：N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）-N-乙酰氨基葡萄糖乳酸（NAM）的共聚物，NAG與NAM以β-1,4糖苷鍵交替排列。

溶菌酶N-乙酰胞璧酸:N-乙酰葡糖胺與乳酸形成的醚類（2）溶菌酶的最適小分子底物：為NAG-NAM交替的六糖，以A、B、C、D、E、F表示，其中D是NAM。（3）溶菌酶分子中有一個狹長的凹穴，正適合于小分子底物的嵌合。凹穴中的Glu35和Asp52是活性中心的氨基酸殘基。（4）作用原理當酶與細胞壁接觸時，與六個暴露在外的氨基糖殘基結(jié)合。此時酶的構(gòu)象發(fā)生變化，Glu35和Asp52相互靠近，并與底物的D糖起“靠近”和“定向”效應(yīng)：Asp52羧基上的一個氧原子距離D環(huán)上的C1及D環(huán)上的氧原子只有0.3nm，Glu35羧基上的一個氧原子距離D糖的糖苷鍵上的氧原子也只有0.3nm；同時，在酶作用下，D糖構(gòu)象也發(fā)生變形，由正常椅式變成能量較高的半椅式或船式構(gòu)象。結(jié)合后，Glu35由于處于非極性區(qū)，呈不解離狀態(tài)-COOH，這樣它可以起著廣義酸催化作用，提供一個質(zhì)子給糖苷鍵的氧原子，使得氧原子與D環(huán)C1間的糖苷鍵斷開，而C1帶上正電荷，成為正碳原子C1+。處于極性區(qū)的Asp52在通常情況下呈離子化狀態(tài)-COO-，這樣它就起著穩(wěn)定C1+的作用，協(xié)調(diào)C1-O間糖苷鍵的斷裂，直到環(huán)境中水分子的OH-與C1+結(jié)合，H+與Glu35結(jié)合，使兩者恢復非離子化形式。由此完成一次水解反應(yīng)。2、胰凝乳蛋白酶(1)專一性地水解芳香族氨基酸和大的疏水氨基酸的羧基形成的肽鍵。（2）胰凝乳蛋白酶的活性中心

由Ser195、His57和Asp102組成，其中Ser195是酶活性中心的底物結(jié)合部位，His57是活性中心內(nèi)的催化部位，在三維結(jié)構(gòu)中這三個氨基酸殘基是十分靠近的。（3）胰凝乳蛋白酶作用原理

活性中心的Ser195、His57及Asp102構(gòu)成一個氫鍵體系，使His57的咪唑基成為Asp102羧基及Ser195羥基間的橋梁，Ser195由于His57及Asp102的影響而成為很強的親核基團，易于提供電子。這個氫鍵體系稱為“電荷中繼網(wǎng)”。在大部分情況下，網(wǎng)中Asp102以離子化形式-COO-，Ser195以非離子化形式-CH2OH存在；但也有另一種情況，即由于Asp102從Ser195吸引一個質(zhì)子所造成，想接力賽跑那樣，質(zhì)子先從Ser195傳遞到His57上，再由His57傳遞到Asp102上。在此酶促反應(yīng)中，His57咪唑基起著廣義酸堿催化作用：先促進Ser195的羥基親核地附著到底物敏感肽鍵的羰基碳原子上，形成共價的酰化中間物，再促進酰化的ES中間物上的?；D(zhuǎn)移到水或其他的酰基受體（如醇，氨基酸等）上。其對多肽底物水解可分兩個階段：

A、水解反應(yīng)的酰化階段Ser195羥基的氧原子對底物敏感鍵的羰基碳原子進行親核攻擊，形成了一個為時暫短的四聯(lián)體過渡態(tài)。在這過渡態(tài)中，底物的?；糠峙cSer195的羥基、氨基部分與His57的咪唑基相連接。在此過程中，通過電荷中繼網(wǎng)（絲氨酸向組氨酸提供質(zhì)子）發(fā)生反應(yīng)，敏感肽鍵斷裂，底物中的胺成分通過氫鍵與His57咪唑基相連，底物的羧基部分通過酯鍵與Ser195的羥基相連。

B、水解反應(yīng)的脫酰階段

首先胺從酶上釋放出來，底物的羧基部分與酶就成了?；福@是中間復合物。接著水分子進入活性中心，電荷中繼網(wǎng)從水中吸收一個質(zhì)子，結(jié)果OH-立即攻擊已連在Ser195上的底物羧基碳原子，也形成一個短暫的四聯(lián)體過渡態(tài)。然后His57供出一個質(zhì)子到Ser195的氧原子上，結(jié)果底物中的酸成分從Ser195上釋放出來，酶又恢復自由狀態(tài)。3、糜蛋白酶4、羧肽酶（1）此酶是單鏈蛋白質(zhì)，其中緊密地結(jié)合著一個Zn2+離子。這個離子對酶的活性很重要。該酶是一個外肽酶，催化肽鏈C-末端的肽鍵水解。在酶的三維結(jié)構(gòu)中，Zn2+離子處于接近酶表面的溝槽中，它與兩個組氨酸（His196,69）側(cè)鏈和一個谷氨酸（Glu72）及一個水分子形成一個四面體，Zn2+離子在此四面體中與這三個氨基酸以配價鍵相連。離Zn2+離子不遠有一個“裂縫”（見下圖），允許底物C-末端伸入。裂縫頂部還有一個口袋，可以接受C-末端的R基團，酶的Tyr248（酪）、Arg145（精）、Glu270及Zn2+將底物分子適當?shù)囟ㄎ挥诨钚灾行闹?。?）作用原理A、在底物誘導下，酶活性中心的結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大改變，底物的“靠近”和“定向”效應(yīng)十分顯著；B、酶的Glu270使底物的敏感肽鍵發(fā)生電子張力，使敏感肽鍵變得極易斷裂。C、底物結(jié)合的過程分五步酶側(cè)鏈中Arg145上的正電荷與底物C-末端氨基酸殘基上羧基的負電荷發(fā)生靜電吸引作用；該氨基酸殘基進入酶的非極性口袋中；底物敏感鍵上羰基中的氧與Zn2+離子相接近；底物的末端氨基通過一個插入的水分子與酶中Glu270的側(cè)鏈建立氫鍵。

D、構(gòu)象變化結(jié)果Arg145的胍基和Glu270的羧基相向移動了0.2nm；Arg145的結(jié)合，使底物末端從口袋中推走了4個水分子，并將結(jié)合在Zn2+離子上的水分子推開（但留在附近），底物自身結(jié)合到Zn2+離子上；由于Arg145的移動帶動了Tyr248的羥基移動1.2nm，從酶表面移到底物肽鍵附近，由此關(guān)閉了活性中心的凹道，活性中心從充滿水的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷畢^(qū)。

E、酶與底物結(jié)合后，Zn2+離子、Glu270和Tyr248的作用：

Zn2+離子：使敏感肽鍵產(chǎn)生電子張力。酶與底物靠近時，敏感肽鍵指向Zn2+離子，在該離子作用下，底物羰基碳原子的電子云密度降低，呈正電性，這樣羰基碳原子在親核攻擊下更加脆弱。同時Glu270負電荷靠近肽鍵加大了這種偶極矩。因此Zn2+離子對底物造成的電子張力大大地促進了底物的水解。

Glu270和Tyr248：第一種說法：Glu270首先激活水分子，使其釋放出OH-，由OH-直接攻擊底物敏感肽鍵的羰基碳原子，同時Tyr248提供一個質(zhì)子，由此底物的肽鍵直接水解；第二種說法：Glu270直接攻擊羰基碳原子，并且Tyr248向該肽鍵的-NH-提供一個質(zhì)子，肽鍵斷開，生成一個胺和一個Glu270與底物羰基相連的酸酐，最后水分子使酸酐水解，生成一個酸和復原的酶。注意：（1）Tyr248參與底物與酶的結(jié)合過程，而在催化過程中僅僅是起提供質(zhì)子的作用，并不是催化所必需的；（2）在羧肽酶A中，底物有末端羧基，就能與Arg145的正離子基團形成鹽鍵，觸發(fā)Tyr248移至酶活性中心。如果底物沒有末端羧基，就不發(fā)生這種結(jié)合和移動，酶則不表現(xiàn)活性。

結(jié)論胰凝乳蛋白酶其活性中心由Ser195、His57及Asp102構(gòu)成一個電荷轉(zhuǎn)接系統(tǒng)，稱為電荷中繼網(wǎng)，其催化反應(yīng)包括水解反應(yīng)的?；A段和水解反應(yīng)的酰化階段。胰蛋白酶、彈性蛋白酶都來源于胰臟，與胰凝乳蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)極為相似，一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列也有40%的相似性，三者活性中心的絲氨酸殘基附件的氨基酸序列完全一樣，同屬絲氨酸蛋白酶家族；他們的作用機理表現(xiàn)出極大的相似性，但底物的專一性有很大的差異。四、酶的調(diào)節(jié)1、別構(gòu)調(diào)節(jié)當效應(yīng)物分子可逆地結(jié)合到酶的某一非催化部位時，引起酶的結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）變化，進而改變酶的活性，這種調(diào)節(jié)稱別構(gòu)調(diào)節(jié)。受別構(gòu)調(diào)節(jié)的酶稱別構(gòu)酶，引起別構(gòu)調(diào)節(jié)的效應(yīng)物稱調(diào)節(jié)物別構(gòu)激活：因別構(gòu)而導致酶活性增加別構(gòu)抑制：因別構(gòu)而導致酶活性降低不同（效應(yīng)調(diào)節(jié)物）：異促效應(yīng)（heterotropiceffect）相同（均為底物）：同促效應(yīng)（homotropiceffect）調(diào)節(jié)物結(jié)合后對后繼配體的影響調(diào)節(jié)物性質(zhì)正協(xié)同效應(yīng)（positivecooperativeeffect）負協(xié)同效應(yīng)（negativecooperativeeffect）（1）別構(gòu)酶(Allostericenzyme)的結(jié)構(gòu)特征

別構(gòu)酶一般是寡聚酶，常含多個亞基（有四級結(jié)構(gòu)），通過次級鍵由多亞基構(gòu)成。除有結(jié)合底物和起催化作用的活性中心外，還含可結(jié)合調(diào)節(jié)物的別構(gòu)中心，前者負責對底物的結(jié)合和催化，后者負責調(diào)節(jié)反應(yīng)速度。別構(gòu)酶的活性中心（活性部位）和別構(gòu)中心（調(diào)節(jié)部位）位于酶蛋白的不同部位上，可能在同一亞基上，也可能分別在不同的亞基上；每個別構(gòu)酶分子可以有一個以上的活性部位和調(diào)節(jié)部位。（2）別構(gòu)酶的動力學別構(gòu)酶不符合米氏方程，存在協(xié)同效應(yīng)。所以其[S]對v的動力學曲線不是雙曲線，而是S形曲線（正協(xié)同）或表觀雙曲線（負協(xié)同）。

S形曲線：表明酶結(jié)合一分子底物（或調(diào)節(jié)物）后，酶的構(gòu)象發(fā)生變化，從而大大增加對后續(xù)底物分子的親和性，促進后續(xù)分子與酶的結(jié)合，表現(xiàn)為正協(xié)同性，這種酶稱為具正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶。表觀雙曲線：在底物濃度較低范圍內(nèi)酶的活力上升很快，但隨后底物濃度雖有較大的提高，但反應(yīng)速度升高卻很小，表現(xiàn)為負協(xié)同性，這種酶稱為具有負協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶。怎么區(qū)分米氏酶與別構(gòu)酶？koshland建議用飽和比值（saturationratio,Rs）典型的米氏酶RS=81具有正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶RS<81具有負協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶RS>81

米氏酶的Km和別構(gòu)酶的K0.5都是指反應(yīng)速率為Vmax一半時的底物的濃度K型效應(yīng)物和V型效應(yīng)物：能改變底物的K0.5而不改變反應(yīng)Vmax的效應(yīng)物稱為K型效應(yīng)物；能改變Vmax而不改變K0.5的效應(yīng)物稱為V型效應(yīng)物。別構(gòu)酶的脫敏作用：別構(gòu)酶經(jīng)加熱或化學試劑處理，可引起別構(gòu)酶解離，失去調(diào)節(jié)活性，稱為脫敏作用。脫敏后的酶表現(xiàn)為米氏酶的動力學雙曲線。（3）別構(gòu)酶范例(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶,ATCase)

底物N-氨甲酰磷酸和天冬氨酸促進ATCase活性，為同促效應(yīng)；CTP為最終產(chǎn)物，降低了酶與底物的親和性，抑制ATCase活性；ATP為非底物分子，但可增強酶與底物的親和性而激活A(yù)TCase，起到