靜電自組裝技術(shù)論文主題：阿加曲班,殼聚糖,透明質(zhì)酸,膜修飾

I血液凈化治療已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種危重疾病的治療，其過(guò)程必然涉及到體外循環(huán)。然而由于管路、透析器/濾器等人工材料尚無(wú)法做到完全的生物相容，故凝血因子的激活無(wú)法避免。因此，改善人程學(xué)、醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。從纖維素膜到合成膜再到膜表面改性處理，膜的血液相容性已經(jīng)得到很大提高。但該類膜在臨床應(yīng)用中仍然離不開(kāi)使用一定劑量的全身抗凝劑。血管內(nèi)皮除具有完美的血液相容性外，還能夠局部釋放抗凝因子，因而能維持血液在血管內(nèi)順利循環(huán)。在提高膜材料的血液相容性的同時(shí)，在膜表層裝載抗凝藥物并實(shí)現(xiàn)其局部釋放，作用于血流一膜接觸層面，可使抗凝更有針對(duì)性，最大程度發(fā)揮膜材料局部抗凝效能，可望減少或脫離全身抗凝劑的通過(guò)靜電自組裝技術(shù)構(gòu)建一種裝載抗凝藥物的修飾膜濾器，該濾器膜材料具有良好的血液相容性，同時(shí)所裝載的抗凝藥物能夠局(1)根據(jù)靜電自組裝原理，將殼聚糖-阿加曲班混合溶液及透明質(zhì)酸溶液交替涂敷于聚砜膜濾器膜內(nèi)面，構(gòu)建抗凝修飾膜濾器。(2)采用掃描電鏡觀察修飾膜表面形貌及厚度，跟蹤觀察分子自組裝過(guò)程。(3)親水角測(cè)量?jī)x測(cè)定修飾膜表面親水角，觀察其親水性改變。(4)在摸索測(cè)量阿加曲班濃度的高效液相色譜法所需條件的基礎(chǔ)上，將生理鹽水注入修飾膜濾器進(jìn)行浸泡。分別于30min、1h、2h、3h、5h、10h、15h、20h從浸泡液中取樣3ml,采用高效液相色譜法檢測(cè)浸泡液中阿加曲班濃度。通過(guò)檢測(cè)濃度的改變，觀察膜的1掃描電鏡觀察修飾膜內(nèi)表面：在分子自組裝的過(guò)程中，膜內(nèi)表面形貌從稀疏不均勻的小島顆粒狀分布到逐漸形成致密均勻的細(xì)顆粒狀分布。膜的厚度在4個(gè)雙分子層前無(wú)顯著變化，4個(gè)雙分子層后膜的厚度隨著雙分子層數(shù)的增加而增厚。2測(cè)定修飾膜內(nèi)表面親水角：隨著兩種親水性質(zhì)不同的物質(zhì)交替涂敷膜內(nèi)表面，膜表面的親水角隨之發(fā)生交替變化；并且隨著雙分子層數(shù)的增加，其親水角不斷變小。3藥物緩釋實(shí)驗(yàn)：在經(jīng)過(guò)15h浸泡后，浸泡液中可以檢測(cè)到阿加曲班，但此時(shí)阿加曲班的濃度未達(dá)到其有效抗凝濃度。1殼聚糖/透明質(zhì)酸靜電自組裝可以修飾聚砜膜，綜合考慮其親水性、通透性，4個(gè)雙分子層為適宜層數(shù)。2殼聚糖/透明質(zhì)酸靜電自組裝可以裝載阿加曲班，并實(shí)現(xiàn)阿加關(guān)鍵詞靜電自組裝技術(shù)，阿加曲班，殼聚糖，透明質(zhì)酸，膜修飾Bloodpurificationtherapyofmanycriticalillness,theprocesswillinevitablyinvolvecardiopulmonarybypass.However,duetopipeline,dialyzer/filterandactivationofcoagulationfactorscannotbeavoided.Therefore,improvingthebiocompatibilityofartificialmaterials,especiallythebloodengineering,medicine.Fromcellulosemembranestosynmembranes,thebloodcompatibilityofthedialysismembraneswasimprovedgreatly.Butitstillneedalittendothelialcellswithbestbloodcompatformthrombosis.So,simulatingtheendothelialcebloodcompatibilitysurface,mayimprovetheeffectivenWewillconstructanewfiltermembraneofmolecularself-assemblytechnique.Thenewtypereleaseanticoagulantlmembranefilterinturns,accordingtothepmolecularself-assemblytechnique.(1)Toconfirmeverystemolecularself-assemblecoatings,weusescanningelectronmicrtoobservethesurfacemorph(2)Toobservethechangesofmembranehydrophilicity,weusecontactanglemeasuringmachinetomeasurethehydrophilicityangleofthemembranesurface.(3)Exploretheconditionsofmeaconcentrationrequiredforhigh-performancechromatography.Thenwedoasustained-rehigh-performanceliquidchromatographytomeasuretheargatrocharacteristicsofmembraprocess,themembranesurfacemorphologygraduallychanges,fnon-uniformdistributionofislanVisevenlydistributed2Hydrophilicityangleshows:twodifferenthydrophilicappearalternately;andbimol3Theresultsofdrugrelease:argatrobanhasbeen1electrostaticmodifythesurfaceofpolysulfonemembitshydrophilicity.Toavoidaffectingthedialysisperformanceofthemembrane,fourpairsofmolecularlayersaremostsuitable.2Argatrobancanbeloadedbychitosan/hyaluronicaciKeywords:elehyaluronicacid,modifiedm碩士學(xué)位論文英文縮略詞 I Ⅲ 1第二章材料與方法 4 4 5 5 65阿加曲班修飾膜濾器的表面特征觀察 6 7 78統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 8 9 9 9 第五章結(jié)論 23 英文縮略詞碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文1血液凈化治療已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腎衰竭、多器官功能障礙綜合癥、急性胰腺炎、溶血尿毒綜合癥等危重疾病的治療。血液凈化過(guò)程必然涉及到體外循環(huán)，由于管路、透析器等人工材料尚無(wú)法做到完全的生物相容，故凝血因子的激活無(wú)法避免。因此，抗凝是血液凈化治療的必要前提。而接受血液凈化治療的患者由于原發(fā)病的影響，很多存在一定凝血功能障礙，使抗凝方法的應(yīng)用非常復(fù)雜。而到目前為此，國(guó)際上尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)抗凝方案"。目前對(duì)抗凝方法的研究絕大部分集中于抗凝藥物的應(yīng)用上，對(duì)于濾器膜材料進(jìn)行改進(jìn)的研究較少。分子自組裝(LayerbyLayerself-assembly,LBL)是指分子與分子在一定條件下依賴非共價(jià)鍵分子間作用力(氫鍵、范德華力、靜電力、疏水作用力等)自發(fā)連接成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的分子聚集體的過(guò)程。靜電層層自組裝是分子自組裝技術(shù)的一種，是基于靜電相吸而產(chǎn)生多層膜自我組裝體系的技術(shù)，最早由Decher和Hong2于1991年提出。輪流地交換吸附溶液，使兩種帶相反電荷的離子相互吸引結(jié)合構(gòu)成多層膜結(jié)構(gòu)。具體而言就是將底物上帶有電荷的聚合物表面連續(xù)而又交替地沉浸在帶有完全相反電荷的兩種溶液中，利用靜電相吸的作用，使帶不同電荷的兩種物質(zhì)有序而緊湊地連接在一起，重復(fù)數(shù)次得到多層膜結(jié)構(gòu)(如下圖)。該技術(shù)對(duì)于構(gòu)建生物活性的表面來(lái)說(shuō)是一種簡(jiǎn)單而又高效的方法，能顯著提高材料表面的生物相容性。層層自組裝技術(shù)具有得天獨(dú)厚的優(yōu)點(diǎn)：(1)對(duì)材料表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)、活性官能團(tuán)不作要求；(2)層狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)建過(guò)程不需要任何外加條件如能量的提供；(3)具有高吸收能力；(4)可以使用各種具有生物相容性的水溶性聚合物(尤其是各種生物活性的生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸),為其在生物材料表面工程應(yīng)用提供了便利3。目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于光源、藥物緩釋、生物工程材料等領(lǐng)域。2+殼聚糖(Chitosan,CS),又名脫乙酰殼多糖，是甲殼素(殼多糖)脫乙?；漠a(chǎn)物，是一種重要的天然多糖，來(lái)源豐富，制備簡(jiǎn)單，它無(wú)毒無(wú)味，無(wú)刺激性，具有良好的生物相容性和生物降解性能。值得注意的是，殼聚糖是自然界中唯一的堿性多糖，是一種陽(yáng)離子聚合物。透明質(zhì)酸(sodiumhyaluronate,HA)是人體內(nèi)廣泛存在的生理物質(zhì)，是由纖維母細(xì)胞合成的，分布于整個(gè)結(jié)締組織，最重要的作用是形成松散的結(jié)締組織。在皮膚、關(guān)節(jié)滑液、眼玻璃體、臍帶等許多器官和組織中也有較高含量。透明質(zhì)酸是由N-乙酰-D-氨基己糖和D-葡萄糖醛酸構(gòu)成的酸性黏多糖，它是一種長(zhǎng)線條的多聚鏈，是一種陰離子聚合物。Thierry?等在金屬支架表面通過(guò)靜電自組裝構(gòu)建了透明質(zhì)酸/殼聚糖的聚電解質(zhì)多層膜表面。血小板粘附實(shí)驗(yàn)表明多層膜修飾后，金屬支架的血小板粘附量減少了38%。若在多層膜中負(fù)載藥物硝普鈉，血小板的粘附量進(jìn)一步減少，與未修飾的支架相比粘附量減少達(dá)40%。充分證明這種利用層層自組裝構(gòu)建的天然聚多糖涂層可有效阻抗血栓形成。阿加曲班(argatroban)是化學(xué)合成的低分子藥物，是精氨酸的衍生物，相對(duì)分子質(zhì)量527U。阿加曲班能直接與凝血酶的催化活性位點(diǎn)(包括絲氨酸-組氨酸-精氨酸結(jié)構(gòu))結(jié)合，滅活凝血酶。由于阿加曲班分子量小，它能進(jìn)入到血栓內(nèi)部，直接滅活已經(jīng)與纖維蛋白結(jié)合的凝血酶。其作用特點(diǎn)為：①直接滅活凝血酶的活性，對(duì)凝血酶的產(chǎn)生沒(méi)有直接作用，其作用不依賴于抗凝血酶；②不但滅活液相凝血酶，還能夠滅活與纖維蛋白血栓結(jié)合了的凝血酶；③阻斷凝血瀑布的正反饋，間接抑制凝血酶的產(chǎn)生；④治療劑量下對(duì)血小板功能無(wú)影響，不導(dǎo)致血小板減少癥；⑤具有良好的劑量-反應(yīng)關(guān)系，效果和安全性可以預(yù)測(cè)；⑥與活化部分凝血活酶時(shí)間或者活化凝血時(shí)間相關(guān)性良好5。目前應(yīng)用分子自組裝技術(shù)對(duì)血液凈化膜表面進(jìn)行修飾，以獲得更好的血液碩士學(xué)位論文第一章前言3相容性膜的研究很少，且仍然達(dá)不到臨床需要67。本實(shí)驗(yàn)在前期平面膜實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以常用濾器膜—聚砜膜為膜基材，以透明質(zhì)酸和殼聚糖為陰陽(yáng)離子聚電解質(zhì)，在聚砜膜表面進(jìn)行靜電分子自組裝。同時(shí)將抗凝藥物阿加曲班與殼聚糖共混，實(shí)現(xiàn)了阿加曲班的裝載，并使其緩慢釋放。4第二章材料與方法2血泵：尼普諾公司4高效液相色譜儀：[四元泵(帶在線真空脫氣機(jī)),自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器]:美國(guó)Agilent公司8磨樣機(jī)9聚砜膜濾器：費(fèi)森尤斯AV400濾器10眼科手術(shù)剪刀1.2主要試劑1殼聚糖：脫乙酰度90%,粒度100目，分析純。山東濰坊海之源生物制品2透明質(zhì)酸：醫(yī)用級(jí)別，中國(guó)山東福瑞達(dá)生物化工有限公司3乙酸：分析純，長(zhǎng)沙化工廠8乙醚：分析純，長(zhǎng)沙化工廠9乙酸乙酯：分析純，長(zhǎng)沙化工廠10異丙醇：分析純，長(zhǎng)沙化工廠11去離子水：湘雅醫(yī)院人工腎水處理室12阿加曲班粉末：日本三菱制藥廠52主要試劑的配置2.1殼聚糖溶液的配置：中。加入99%乙酸溶液，調(diào)節(jié)PH值至5.5。攪拌器攪拌1小時(shí)后室溫靜為2%、1%、0.5%、0.25%、0.2%、0.1%的殼聚糖溶液。2.2透明質(zhì)酸溶液的配置：水中。攪拌器攪拌4小時(shí)后室溫靜置24小時(shí)。真空抽濾器抽濾除氣泡后0.1%、0.05%的透明質(zhì)酸溶液。3.1方法：①聚砜膜濾器保持直立，50ML注射器分別抽取不同濃度的殼聚糖溶液、透明質(zhì)酸溶液，交替從濾器上端血液入口往下注射，從濾器下端血液出口出來(lái)。感受壓力變化、觀察溶液通過(guò)濾器的難易情況。纖維管，燈光下觀察中空纖維管有無(wú)堵塞。③重復(fù)以上步驟，直至挑選出合適的殼聚糖、透明質(zhì)酸溶液的濃度。3.2選擇標(biāo)準(zhǔn)：起破膜。維管。④在涂層過(guò)程中，宜有少量碎片狀、短絲型絡(luò)合物形成，以免濃度過(guò)低，涂層不成功。⑤在燈光下，如果發(fā)現(xiàn)中空纖維管中過(guò)多黑色暗影(即被絡(luò)合物堵塞),則該濃度淘汰。6阿加曲班溶液中，滴入乙酸溶液，調(diào)節(jié)PH值到5.5,攪拌器攪拌1小時(shí)后避光靜置24小時(shí)。真空抽濾器抽濾除氣泡后備用。③按下圖所示連接設(shè)備。—管路④將去離子水放入燒杯，打開(kāi)血泵，流速為80ml/min。循環(huán)10分鐘。并排盡空氣后，繼續(xù)閉式循環(huán)30分鐘，使殼聚糖-argatroban溶液與透⑥去離子水沖洗10分鐘。⑦將透明質(zhì)酸溶液引入循環(huán)管路，預(yù)沖并排盡空氣，閉式循環(huán)30分鐘后排⑧去離子水沖洗管路10分鐘。⑨重復(fù)步驟⑤⑥⑦⑧5次后，氮?dú)獯蹈蔀V器備用。5阿加曲班修飾膜濾器的表面特征觀察5.1親水角測(cè)定5.2掃描電鏡觀察厚度變化7把樣品(約2厘米)粘貼在透明膠帶上，再將此帶透明膠封住一個(gè)塑料管子(底直徑1.8厘米，高1厘米)的一端(樣品在管子內(nèi)部)。再將固化膠(樹(shù)脂)倒入管子，4小時(shí)固化后將透明膠帶撕掉，再過(guò)24小時(shí)之后可以磨樣、拋光。取未修飾膜、涂膜4層、6層、8層、10層、12層時(shí)的修飾膜，觀察膜厚預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膜表面形貌在分子自組裝涂膜8層之前變化顯著,故取涂膜2層、4層、8層、10層時(shí)的修飾膜觀察膜表面形貌變化，取中空纖維磨樣①準(zhǔn)備好依據(jù)步驟4制備的阿加曲班修飾膜濾器五支(其雙分子層數(shù)根據(jù)接觸，開(kāi)始浸泡。中取樣3ml,進(jìn)行阿加曲班濃度檢測(cè)。5支濾器每支濾器8個(gè)標(biāo)本，標(biāo)7.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇7.1.2流動(dòng)相的選擇7.1.3柱溫的選擇阿加曲班不耐高溫，應(yīng)考察30～55℃不同溫度對(duì)阿加曲班色譜行為和柱效的影響。87.1.4阿加曲班的萃取條件的探索阿加曲班為精氨酸的衍生物，在甲醇中溶解，在乙醇和水中微溶，國(guó)外文獻(xiàn)[8-10報(bào)道一般用蛋白沉淀法處理樣品，樣品雜質(zhì)峰多，靈敏度有限。本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑萃取法處理供試品?？疾觳煌軇┘芭浔鹊妮腿』厥章?，選擇萃取回收率高、揮發(fā)時(shí)間短、雜質(zhì)少的有機(jī)溶劑。7.1.5色譜行為的觀察用抽濾器將7.1.2所選取的流動(dòng)相通過(guò)0.45mm的微孔濾膜去除雜質(zhì)，開(kāi)機(jī)穩(wěn)定半小時(shí)后。觀察阿加曲班和內(nèi)標(biāo)物的色譜行為，繪制色譜圖。7.1.6內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選定根據(jù)選擇的波長(zhǎng)，選擇合適的內(nèi)標(biāo)物，使內(nèi)標(biāo)在該波長(zhǎng)時(shí)吸收峰高、并且在液相色譜法時(shí)可以與阿加曲班完全分離且分離時(shí)間與阿加曲班靠近。7.1.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以及定量下限的測(cè)定用生理鹽水將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成不同濃度的供試品，按7.2項(xiàng)操作萃取所得的沉渣用甲醇溶解，按7.3方法穩(wěn)定液相色譜儀后進(jìn)樣。以得到的阿加曲班峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(A)對(duì)血藥濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得出阿加曲班標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，并得出定量下限。7.1.8方法回收率的測(cè)定及精密度試驗(yàn)配制低、中、高3個(gè)濃度的阿加曲班標(biāo)準(zhǔn)供試品各5份，按7.2項(xiàng)操作萃取所得的沉渣用甲醇溶解，按7.3方法穩(wěn)定液相色譜儀后進(jìn)樣。記錄阿加曲班與內(nèi)標(biāo)的峰面積，代入回歸方程計(jì)算濃度，以測(cè)得量與加入量的比值計(jì)算方法學(xué)回收率及日內(nèi)精密度。連續(xù)3天配制并測(cè)定上述濃度樣品，即得日間精密度。7.1.9室溫放置穩(wěn)定性測(cè)定配制低、中、高3個(gè)濃度的阿加曲班標(biāo)準(zhǔn)供試品各若干份，在室溫下放置8h、萃取吹干后于-70℃冰箱中放置24h、樣品反復(fù)凍溶3次(24h內(nèi))、冰凍(-20℃,21天)等條件下測(cè)定阿加曲班濃度考察其穩(wěn)定性。7.2高效液相色譜法測(cè)定浸泡液中阿加曲班濃度依據(jù)上述步驟探索出的測(cè)定方法，對(duì)由步驟6所取得的標(biāo)本中阿加曲班的濃度進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)5次，取均值。結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用直線回歸分析，統(tǒng)計(jì)分析過(guò)程用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件完成。9第三章結(jié)果1.殼聚糖、透明質(zhì)酸的合適濃度經(jīng)多次試驗(yàn)，符合條件的殼聚糖濃度為0.25%、透明質(zhì)酸濃度為0.05%。2阿加曲班修飾膜濾器的表征觀察2.1親水角變化本實(shí)驗(yàn)中靜滴親水角測(cè)量跟蹤分子組裝過(guò)程顯示(見(jiàn)表1):在組裝之前，出兩種類型的親水角交替出現(xiàn)，呈鋸齒狀變化。在涂敷4個(gè)雙分子層后，親水角顯著降低。詳見(jiàn)見(jiàn)表1、圖1:分子自組裝表層親水角(度)碩士學(xué)位論文第三章結(jié)果02.2修飾膜厚度變化如圖2所示(從上至下分別為未修飾聚砜膜、4層、6層、8層、10層、12層):PS膜未進(jìn)行修飾時(shí)(0層),厚度為35.20±1.24um;涂膜至4層時(shí)，00688圖2修飾膜厚度變化圖樣顆粒，分布欠規(guī)整，大小不一；隨涂膜繼續(xù)進(jìn)行至4層，顆粒逐漸變得細(xì)小，大小一致，密布均勻分布于膜表面；涂膜至8層時(shí)，原膜基材表面基本被覆蓋，排列整齊；涂膜8層后，膜表面形態(tài)貌不再隨層數(shù)增加而發(fā)生顯著變化。碩士學(xué)位論文3高效液相色譜法測(cè)定阿加曲班濃度所需色譜條件的探索3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇對(duì)阿加曲班的甲醇溶液進(jìn)行了紫外掃描，結(jié)果在260nm和333nm處有最大吸收峰，選擇333nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)周圍時(shí)間出峰的干擾物質(zhì)少、成峰清晰、峰型對(duì)稱、靈敏度好。故選擇333nm做為檢測(cè)波長(zhǎng)。3.2流動(dòng)相的選擇阿加曲班是具有胍基和羧基為偏堿性的兩性化合物，實(shí)驗(yàn)時(shí)直接用甲醇/水做流動(dòng)相峰形分叉，不對(duì)稱。而直接用乙腈/水做流動(dòng)相向右拖尾嚴(yán)重，峰型不對(duì)稱。故直接使用甲醇、水、乙腈其峰型均不符合要求，出峰時(shí)間都不能直接確定。故本實(shí)驗(yàn)選擇了乙腈-三乙胺溶液作流動(dòng)相并考察了不同的三乙胺濃度和PH值對(duì)色譜峰形及柱效的影響。三乙胺濃度在0.1%～2%之間隨著濃度的升高色譜峰形的拖尾減小，峰型漸漸對(duì)稱、柱效提高。但在2%～5%變化不顯著,故選擇2%的三乙胺做流動(dòng)相。然后通過(guò)對(duì)流動(dòng)相PH值的考察，發(fā)現(xiàn)PH值為6.95的峰形最對(duì)稱、柱效最高。3.3柱溫的選擇考察了30～55℃不同溫度對(duì)阿加曲班色譜行為和柱效的影響，隨著溫度的升高色譜峰形變化不明顯、但柱效有少許提高。并且當(dāng)柱溫45℃~55℃之間時(shí)柱效3.4阿加曲班的萃取條件的探索萃取回收率，結(jié)果：乙酸乙酯與異丙醇的混合溶劑(4:1)的萃取劑回收率在80%長(zhǎng)，需40分鐘左右。故選擇乙酸乙酯與異丙醇(1:4)的混合溶劑為萃取劑。本3.5色譜行為觀察鹽水中加入阿加曲班以及硝基安定后，阿加曲班保留時(shí)間為定為5.5min,具體色譜圖見(jiàn)圖5:3.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以及定量下限的測(cè)定用生理鹽水將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成0.51,1.02,2.04,4.08,8.16,20.4,51.0μg·mL1系列濃度的供試品，以阿加曲班峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(A)對(duì)血藥濃度(C)進(jìn)行線性回歸。得阿加曲班標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.021C-0.002,權(quán)重為1/C,決定系數(shù)(相關(guān)系數(shù)r2)為0.9992,線性范圍為0.51～51.0μg·mL1,定量3.8方法回收率以及精密度試驗(yàn)配制0.51,4.08,51.0μg·mL13個(gè)濃度的阿加曲班標(biāo)準(zhǔn)供試品各5份，記錄阿加曲班與內(nèi)標(biāo)的峰面積，代入回歸方程計(jì)算濃度，以測(cè)得量與加入量的比值計(jì)算方法學(xué)回收率，即得日內(nèi)精密度。連續(xù)3天配制并測(cè)定上述濃度樣品，即得日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表2:濃度日內(nèi)(intra-day)日間(inter-day)回收率回收率3.9室溫放置穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明阿加曲班在放置、冰凍之后穩(wěn)定性均良好。4高效液相色譜法測(cè)定浸泡液中阿加曲班濃度色譜柱：KromasilC18(4.6mm×250流動(dòng)相：乙腈-2%三乙胺溶液(40:60)用磷酸調(diào)ph值到6.9;柱溫：45℃;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：333nm;內(nèi)標(biāo)：硝基安定萃取方法：精取0.50mL浸泡液置10mL具塞玻璃離心管中，精基安定內(nèi)標(biāo)溶液(202μg·mL1),混勻，再加入3mL混合萃取液(乙酸乙酯：異丙醇=4:1),旋渦振蕩1min,4000r·min1離心8min,取有機(jī)層在35℃下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00μL甲醇溶解，進(jìn)樣20μL。測(cè)量所得的結(jié)果見(jiàn)表3:表3浸泡液標(biāo)本中阿加曲班的濃度浸泡時(shí)間1235生物材料(Biomaterial)是用于取代、修復(fù)活組織的天然或人造材料。它是生命科學(xué)、材料科學(xué)、醫(yī)學(xué)、工程學(xué)等多學(xué)科相互滲透和發(fā)展的產(chǎn)物。生物材料的狹義含義是生物醫(yī)用材料(BiomedicineMaterials)。按照材料的性質(zhì)，生物醫(yī)用材料可分為天然生物材料(如豬心瓣膜、牛心包、羊膜等)、金屬材料(如鈦及其合金)、無(wú)機(jī)非金屬材料(如羥基磷灰石、生物玻璃等)、高分子材料以及雜化生物醫(yī)用材料。對(duì)于與生物體內(nèi)環(huán)境直接接觸的的高分子材料(PolymerMaterials),一般應(yīng)具有兩種基本性能：即醫(yī)用功能性和生物相容性(Biocompatibility)。實(shí)際上這也就包含了對(duì)材料其他性能如物理機(jī)械性能、化學(xué)穩(wěn)定性、毒性、加工成型性等方面的要求。醫(yī)用功能性是指材料在與生物體組織相結(jié)合后能達(dá)到診斷或醫(yī)療的效果。而生物相容性是指材料和活體組織之間相互容納的程度。它包含兩層含義：血液相容性和組織相容性。生物相容性是生物醫(yī)用材料區(qū)別于其他材料的最重要的特征，是評(píng)價(jià)一種材料能否在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的根本依據(jù)。生物醫(yī)用高分子膜是膜技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的重要部分，以高分子膜為核心元件的人工肺、人工肝、人工腎等已經(jīng)挽救了成千上萬(wàn)生命垂危病人的生命。隨著材料科學(xué)和膜技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，高分子膜在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前途將更加廣泛。但目前應(yīng)用的高分子膜均不是完全血液相容的，因此當(dāng)與血液直接接觸時(shí)會(huì)產(chǎn)生凝血現(xiàn)象，臨床上只好采用輸入抗凝劑的方法防止凝血。透析膜是透析器最重要的部分，透析膜材料是影響血液透析治療效果的關(guān)鍵因素。目前，臨床常用的透析膜可分為三類：1.未修飾的纖維素膜；2.改性或面均有較大的區(qū)別.目前，合成膜(包括聚丙烯腈膜、聚砜膜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸脂酯膜、聚胺膜)由于生物相容性好、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)和超濾系數(shù)均較大，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于血液凈化。然而作為一種直接與血液接觸的生物材料，對(duì)血液而言透析膜畢竟是一種異體物質(zhì)，始終不同于人體血管內(nèi)皮細(xì)胞，與血液相接觸，不可避免會(huì)引起機(jī)體的反應(yīng).提高透析膜的生物相容性，尤其是血液相容性，是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和方向之一.理想的透析膜應(yīng)與人體的血管內(nèi)皮性能極為接近，無(wú)毒性，無(wú)抗原性，不激活補(bǔ)體、白細(xì)胞和單核細(xì)胞，無(wú)細(xì)胞因子的釋放，對(duì)凝血系統(tǒng)也沒(méi)有影節(jié)膜表面的微觀不均勻性，改善膜表面的親水性，減少透析膜對(duì)凝血及氧化應(yīng)激的影響，從而提高膜的透析充分性和生物相容性，減少并發(fā)癥的發(fā)生。血液相容性(Blood-compatibility)是指材料與血液接觸后，不引起血漿蛋白的變性，不破壞血液的有效成分，不導(dǎo)致血液的凝固和血栓的形成。當(dāng)血液在以內(nèi)皮細(xì)胞為內(nèi)壁的血管中正常流動(dòng)時(shí)，一般不與血液相接觸時(shí)，血液的流動(dòng)狀態(tài)和血管壁狀態(tài)都發(fā)生了變化，材料被生物體作為異物而識(shí)別，二者界面在發(fā)生了一系列復(fù)雜的相互作用后，產(chǎn)生凝血現(xiàn)象。其原理如下：首先，小分子(水和無(wú)機(jī)鹽等)和血漿蛋白(包括部分凝血因子、抗凝血因子)相繼吸附在材料表面，形成一蛋白質(zhì)吸附層。這一過(guò)程十分迅速，大約只需幾秒。材料的表面性質(zhì)極大地影響著吸附蛋白層的數(shù)量、組成、結(jié)構(gòu)，這對(duì)血栓的形成起重要作用。其次，吸附在材料表面的蛋白質(zhì)變性、活化。在Ca2存在的條件下，通過(guò)激活凝血因子、血小板粘附、紅細(xì)胞粘附三條途徑，最終導(dǎo)致血栓的形成。其中以凝血因子的激活和血小板粘附起主導(dǎo)作用，而這兩者之間又相互影響，相互促進(jìn)。同時(shí)，由于生物體系還存在著抗凝血系統(tǒng)負(fù)反饋機(jī)制，如抗凝血因子體系、抗血小板體系、纖維蛋白溶解體系等，也將受到材料表面性質(zhì)的影響，與凝血系統(tǒng)協(xié)同作用，決定材料表面凝血反應(yīng)的速度與程度。材料與血液接觸后，不形成不可逆的血栓過(guò)程，稱為具有抗凝血性(Antithromboeicity)。依據(jù)材料表面的凝血機(jī)制，形成血栓的任何一個(gè)環(huán)節(jié)受到抑制或阻斷，都可得到良好的抗凝血性。就目前而言，抗凝血高分子生物材料(AntithromboeicityBiomedicineMaterials)的設(shè)計(jì)大致從以下幾個(gè)方面著手：1.材料表面的接技改性。材料表面的接枝改性(Graft-modified)是從減少材料與血液成分相互作用，阻抗血漿1e。2.材料表面負(fù)載電荷。靜電排斥作用可以阻礙血漿蛋白及血小板等物質(zhì)的吸附，從而有利于抗凝血。3.材料表面生物化。將具有抗凝血功能的生物活性物質(zhì)通過(guò)共價(jià)鍵合、離子鍵合、交聯(lián)、吸附等方式負(fù)載到材料表面是提高血液相容性化是抗凝血的研究的新動(dòng)向。目前，表皮偽內(nèi)膜的聚四氟乙烯人工血管已在國(guó)內(nèi)臨床上得到了應(yīng)用20。靜電層層自組裝可以控制自組裝膜的結(jié)構(gòu)和厚度，并且由于靜電相互作用的非特異性，可以較容易地將生物功能大分子、導(dǎo)電聚合物、感光聚合物引入到薄膜中去，形成具有生物功能、導(dǎo)電功能和光活性的薄膜。其工藝簡(jiǎn)單，制備條件溫和，可實(shí)現(xiàn)多種生物分子的表面固定。且有序的組裝體可保護(hù)生物大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)和生物穩(wěn)定性，適用于具有復(fù)雜體型結(jié)構(gòu)的材料，已成為生物醫(yī)用材料表骨素(帶負(fù)電荷)和殼聚糖(帶正電荷)作為生物功能大分子，對(duì)透析器膜表面進(jìn)行修飾。結(jié)果證明：經(jīng)過(guò)四個(gè)雙層裝載后(硫酸軟骨素層與血液接觸),接觸角以及膜zeta電位達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值。經(jīng)過(guò)修飾后，膜的親水性、生物相容性可大大提高。與血液接觸的硫酸軟骨素層可以抑制血小板黏附和血漿纖維蛋白原吸附，明顯延長(zhǎng)凝血時(shí)間。另外經(jīng)過(guò)修飾的膜還具有一定的抗菌能力。阿加曲班(AG)屬于新型直接凝血酶抑制劑，通過(guò)直接滅活凝血酶的活性發(fā)揮作用，另外由于阿加曲班分子量小，它能進(jìn)入到血栓內(nèi)部，直接滅活已經(jīng)與纖維蛋白結(jié)合的凝血酶。其起效迅速、半衰期短、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，適合作為局部殼聚糖(chitosan,CS)分子式為(C6H11NO4)n,其分子鏈每一個(gè)糖單元帶有一個(gè)氨基，其氮原子上有一對(duì)未結(jié)合的電子，使氨基呈弱堿性，能結(jié)合一個(gè)氫離子，從而使CS成為帶陽(yáng)性電荷的聚電解質(zhì)，能與陰離子聚電解質(zhì)通過(guò)靜電相互作用進(jìn)行分子自組裝。在酸性條件下，CS表現(xiàn)為一種線性高分子聚電解質(zhì)，更有利于進(jìn)行分子自組裝26]。透明質(zhì)酸(HA)分子式為(C14H21NO11)n,其分子鏈上每一個(gè)二糖單元帶有一個(gè)羧基，易失去一個(gè)氫離子而帶陰性電荷，能與陽(yáng)性聚電解質(zhì)進(jìn)行分子自組裝。CS和HA對(duì)機(jī)體無(wú)毒、無(wú)熱原反應(yīng)，具有良好的生物相容性、成膜性和一定的抗菌性能，且原料來(lái)源豐富，制備技術(shù)成熟，因而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)用材料表面修飾，為靜電分子自組裝常用的IC28和ChiHJ等2利用CS和HA作為陰陽(yáng)離子聚合物在多種材料表面實(shí)現(xiàn)了分子自組裝。故本實(shí)驗(yàn)以CS和HA作為陰陽(yáng)離子聚合物對(duì)聚砜膜表面進(jìn)行分子自組裝。對(duì)于帶異種電荷的高分子聚電解質(zhì)組裝成膜的機(jī)理，Lowack30等人通過(guò)對(duì)膜體系中各種作用力的研究，提出了控制聚電解質(zhì)復(fù)合膜自組裝的分1)在成膜時(shí)，在帶相反電荷的鏈段之間形成了離子鍵，聚電解質(zhì)的化學(xué)組成對(duì)膜的影響很小；2)表面電荷過(guò)度補(bǔ)償；3)靜電排斥作用，限制了聚電保證了連續(xù)吸附層具有相同的厚度；4)等溫吸附線中強(qiáng)的滯后現(xiàn)象，使多層膜在刷洗過(guò)程中具有適宜的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)掃描電鏡測(cè)量其厚度可知：在涂膜8層之前，膜厚度變化不顯著。從第8層開(kāi)始，膜的厚度開(kāi)始出現(xiàn)線性增加。隨著自組裝的繼續(xù)進(jìn)行，膜的厚度也在不斷增加，且每個(gè)雙分子層的厚度大致相同。為不影響其通透性能，選用4個(gè)雙分子層比較適宜。LudovicRichert等311曾以CS和HA為組裝高分子聚合物，采用分子自組裝構(gòu)筑了多層膜，并就分子自組裝的過(guò)程作了專題探討，認(rèn)為：靜電分子自組裝的過(guò)程大致可分為兩個(gè)階段，首先是高分子聚合物在基材表面呈液滴狀分布階段，該階段為分子自組裝的初期，聚合物因靜電作用力吸附于膜基材表面，同時(shí)又因本身分子間作用力使有限的分子聚集成團(tuán)，而出現(xiàn)小島狀顆粒；接下來(lái)，隨自組裝繼續(xù)進(jìn)行，分子間作用力使越來(lái)越多的分子連接成片，表現(xiàn)為小島狀顆粒開(kāi)始連接，并且呈膜狀在基材表面鋪展。本實(shí)驗(yàn)以CS和HA為組裝分子對(duì)，并將AG和CS混合，隨CS的組裝而實(shí)現(xiàn)AG的裝載，并對(duì)分子組裝過(guò)程進(jìn)行了觀察，所得結(jié)果與其報(bào)道基本一致。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，膜修飾的初期，PS表面出現(xiàn)小島狀稀疏分布顆粒，之后顆粒變細(xì)、變密，隨膜修飾的繼續(xù)進(jìn)行，表面顆粒出現(xiàn)一個(gè)從稀疏不均勻分布到致密均勻分布的漸變過(guò)程，說(shuō)明修飾過(guò)程使膜表面成功的涂敷了一層新的物質(zhì)。親水角是判定物質(zhì)親水性能的重要因素，因其測(cè)量方便、快速，故廣泛用于研究材料表面性質(zhì)研究。物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同及其所含極性基團(tuán)不同，因而具有不同的親水性。殼聚糖與透明質(zhì)酸所含基團(tuán)不同，其具有不同的親水性。透明質(zhì)酸是鏈狀聚合物，由(1-β-4)D-葡糖醛酸(1-β-3)N-乙?；?D-氨基葡糖的雙糖單位等摩爾重復(fù)連接組成，HA分子中含有的大量的羧基和羥基可與水形成氫鍵而結(jié)合大量的水。電子顯微鏡下證實(shí)32透明質(zhì)酸為線形單鏈，在水中擴(kuò)展成隨機(jī)的線圈狀，直徑約為500nm。透明質(zhì)酸分子中每一雙糖單位均含有一個(gè)羧基，在生理?xiàng)l件下可解離形成負(fù)離子，等空間負(fù)離子的相互排斥，使其分子在水溶液中處于松展?fàn)?，占?jù)大量空間，可結(jié)合多于本身1000倍的水]。故其親水性強(qiáng)于殼聚糖。親水角測(cè)量結(jié)果顯示兩種親水性質(zhì)的膜表面交替出現(xiàn)，提示組裝過(guò)程中CS、HA交替組裝成功。在涂層4個(gè)雙分子層后，親水角已經(jīng)下降到50度以下，再增加涂層的層數(shù)并不能顯著降低親水角。為不影響濾器的透析性能，在提高其親水性的同時(shí)應(yīng)盡量減少涂層所引起的厚度增加，故只需涂層4個(gè)雙分子層就足隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，微創(chuàng)性的介入治療已經(jīng)應(yīng)用于各臨床學(xué)科。醫(yī)用植入體及介入治療的表面藥物控釋涂層可以形成長(zhǎng)效、靶向的藥物傳遞體系，局部的高濃度藥物可以提高治療的有效性，降低系統(tǒng)毒性。層層自組裝涂層表面規(guī)整的層狀水凝膠結(jié)構(gòu)同時(shí)也為藥物控釋涂層提供了良好的手段33。Etienne0等研究了由透明質(zhì)酸和殼聚糖組裝的多層膜在各種酶及在生理環(huán)境條件下的降解特性。研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)交聯(lián)前，HA/CS多層膜在溶菌酶，淀粉酶存在條件下快速降解，而經(jīng)過(guò)交聯(lián)后多層膜的抗降解能力大大提高。在小鼠口腔中的體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)后的多層膜在3天后仍有60%的剩余。HuangLY等35采用分子自組裝技術(shù)成功在支架表面實(shí)現(xiàn)了西羅莫司的緩釋涂層，發(fā)現(xiàn)5層藥物緩釋涂層在體內(nèi)最長(zhǎng)釋放時(shí)間就可以達(dá)到20天以上，而且西羅莫司的釋放速度還可以通過(guò)分子自組裝的層數(shù)來(lái)進(jìn)行調(diào)控。目前，分子自組裝構(gòu)建多層膜用于裝載和釋放藥物在血管支架表面修飾中已經(jīng)較為成熟，然而在血液凈化領(lǐng)域還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CS和HA的靜電層層自組裝，將CS直接溶于AG溶液中，通過(guò)層層自組裝實(shí)現(xiàn)了CS和HA對(duì)AG的裝載。通過(guò)浸泡釋放試驗(yàn)證明，AG確實(shí)已經(jīng)成功裝載于CS/HA雙分子層中，并且經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間浸泡后可以釋放出來(lái)。但是其釋放出來(lái)所需要的時(shí)間太長(zhǎng)。檢測(cè)結(jié)果顯示在浸泡15h后才會(huì)出現(xiàn)微量，而這個(gè)劑量完全不能達(dá)到其有效抗凝所需劑量36。AG緩釋出現(xiàn)的時(shí)間過(guò)晚，與本實(shí)驗(yàn)設(shè)想有出入。這外由于浸泡液使用的是生理鹽水，其中不含有能溶解CS、HA的酶，在浸泡過(guò)程中對(duì)雙分子層的破壞較小，也可能導(dǎo)致AG緩釋時(shí)間延長(zhǎng)。第五章結(jié)論1殼聚糖/透明質(zhì)酸靜電自組裝可以修飾聚砜膜，綜合考慮其親水性、通透性，4個(gè)雙分子層為適宜層數(shù)。2殼聚糖/透明質(zhì)酸靜電自組裝可以裝載阿加曲班，并實(shí)現(xiàn)阿加曲班的緩慢[1].UchinoS,BellomoR,MorimatsuH,etal.ConfortheKidney(B.E.S.T.Kidney)Investigators.[J]Intensi[2].DecherG,HongJD,SchmittJ.Buildupofuself-assemblyprocess:IConsecutivelyalcationicpolyelectrol[3].GrothT,LendleinA.Layer-by-LayerdepositionofpolyelectrolytesAtoolfortheinvivorepairofbl[4].ThierryB,WinnikFM,TabrizianM,etal.Bioactivecoatstentsbasedoncules.2003.Nov-Dec;4(6):1564-71.[5].FareedJ,JeskeWP.Small-moleculedirectantithrombins:argResClinHaematol,2004,17(1):127-138.multilaye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期較長(zhǎng)，約2倍于普通肝素，且不易被血透清除。但因較少引起出血，適用于高危出血傾向的患者。但是低分子肝素沒(méi)有理想的臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)，其個(gè)體化劑量的調(diào)整比普通肝素困難。而且在有些病人，低分子肝素仍然可以引起透析相關(guān)性出血和其他并發(fā)癥5.局部枸櫞酸抗凝法鈣是血液凝固必需的元素。枸櫞酸又名檸檬酸，能夠螯合血中鈣離子生成難以解離的可溶性復(fù)合物枸櫞酸鈣，致使血中鈣離子減少，阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，從而達(dá)到抗凝作用。枸櫞酸進(jìn)人體內(nèi)后，主要在肝臟、肌肉組織及腎皮質(zhì)參加三羧酸循環(huán)，很快被代謝為碳酸氫根，而無(wú)任何殘留。當(dāng)停止輸入枸櫞酸半小時(shí)后，機(jī)體能將之完全代謝，使體內(nèi)離子鈣及枸櫞酸根濃度恢復(fù)正常4。局部檸檬酸抗凝方法為：在體外循環(huán)動(dòng)脈端輸入一定濃度的枸櫞酸鈉溶液，以顯著降低局部離子鈣濃度，防止血液在透析器和血管管路凝血；當(dāng)血液回輸至體內(nèi)后，通過(guò)補(bǔ)充足夠的離子鈣，使機(jī)體凝血功能保持正常。這樣既可起到體外循環(huán)抗凝作用，又不至于影響體內(nèi)凝血功能，從而減少出血并發(fā)癥的發(fā)生率。局部檸檬酸抗凝的常用方法是將檸檬酸直接從動(dòng)脈端輸入或者將檸檬酸混入置換液中，也有報(bào)道將檸檬酸直接加入透析液中。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有大量的在血液凈化治療中成功應(yīng)用局部檸檬酸抗凝的報(bào)道15,16.17。實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用表明：局部檸檬酸抗凝不僅可以達(dá)到充分抗凝的效果，還可以抑制多型核細(xì)胞及血小板的活化8,減少氧化還原反應(yīng)8,改善生物相容性，并明顯減少出血等并發(fā)癥1?-21的發(fā)生率。另外還可以提高透析器清除率7,碩士學(xué)位論文延長(zhǎng)透析器使用壽命22。枸櫞酸鈉抗凝主要并發(fā)癥包括容量負(fù)荷過(guò)多、低鈣血癥前列環(huán)素具有抑制血小板聚集、粘附的作用，對(duì)體內(nèi)凝血系統(tǒng)影響較小，半衰期僅2分鐘，可用于高危出血傾向及肝素不耐受的透析患者3。但由于部分病人會(huì)出現(xiàn)血管擴(kuò)張、劑量依賴性低血壓、心動(dòng)過(guò)緩等不良反應(yīng)，且無(wú)中和制劑，限制了其在臨床的應(yīng)用。甲磺奈莫司他(FuT)是一種人工合成的小分子蛋白酶抑制劑，分子量?jī)H為539Da,可抑制胰蛋白酶、凝血酶等，并具有抗血小板聚集的作用。其體內(nèi)半衰期僅23分鐘，對(duì)血脂無(wú)影響，且不易引起出血?，F(xiàn)已在日本開(kāi)始用于透析，相關(guān)凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，其具有促進(jìn)纖維蛋白原血小板和抗纖維蛋白溶解作用。凝血酶有3個(gè)重要結(jié)構(gòu)：1個(gè)活化中心，2個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)(分別結(jié)合纖維蛋白和肝素)。直接凝血酶抑制劑(directthrombininhibitor,DTI)是新興的抗凝劑，它不僅能抑制凝血酶，也可抑制凝血酶介導(dǎo)的因子V、VⅢ、XⅢ,纖維蛋白原及血小板活性，且不會(huì)導(dǎo)致肝素誘導(dǎo)的血小板減少。此外它還具有抑制血小板聚集以及抗炎等作用。DTI分為單價(jià)DTI和二價(jià)DTI,拉加群、依非加群和伊諾加群等。二價(jià)DTI結(jié)合活化中心與底物結(jié)合位點(diǎn)，代表藥物為水蛭素(地西盧定或重組水蛭素)及比伐盧定。目前通過(guò)美國(guó)食品藥物管理局批準(zhǔn)的DTI有水蛭素、比伐盧定、阿加曲班和地西盧定。而目前在血液凈化治療的抗凝中應(yīng)用較多的有水蛭素、阿加曲班、美拉加群。直接凝血酶抑制劑中在血液凈化治療抗凝中運(yùn)用最多的是水蛭素與重組水蛭素。水蛭素是從歐洲醫(yī)用水蛭唾液腺提取的含有65個(gè)殘基的肽類，它的抗凝作用不依賴于抗凝血酶IⅢ(ATIII),是一種具有高度選擇性的凝血酶抑制劑。常常用于肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥患者以及ATII缺乏患者血液凈化的抗凝26,27。但是由于水蛭素的半衰期在腎功能不全時(shí)顯著延長(zhǎng)28,故在應(yīng)用水蛭素作為抗凝劑時(shí)，除了監(jiān)測(cè)APTT外，還要檢測(cè)血中r-水蛭素水平。阿加曲班是左旋精氨酸衍生物合成的DTI,相對(duì)分子質(zhì)量527D,是一種小分子直接凝血酶抑制劑，與凝血酶的活性部位可逆結(jié)合。阿加曲班是一種快速起效的凝血酶抑制劑，能有效的抑制游離的以及血栓內(nèi)的凝血酶，而不需要ATII的輔助29。與水蛭素不同的是，阿加曲班是在肝臟代謝，腎功能不全時(shí)其藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)沒(méi)有明顯的變化30。有報(bào)道證明腎功能不全時(shí)阿加曲班可以提供安全有效的體外抗凝31,32],而且并發(fā)癥很少。鑒于阿加曲班以上特點(diǎn)，使其成為臨床替代肝素抗凝治療的最有潛力的藥物。但是其昂貴的價(jià)格限制了其在臨床上的廣泛使用。美拉加群是一種分子量?jī)H為430Da的新型直接凝血酶抑制劑，其在歐洲被運(yùn)用于整形外科手術(shù)的抗血栓劑，用于血液凈化中33的報(bào)道比較少，而且主要經(jīng)腎臟代謝，腎功能受損時(shí)排泄受影響。這限制了其在血液凈化治療中的應(yīng)用。透析膜做為一種非生物物質(zhì)，與人體血管內(nèi)皮始終存在差別，不可避免地會(huì)引起機(jī)體的異常反應(yīng)。理想的生物相容性膜應(yīng)與人體的血管內(nèi)皮極為相近，應(yīng)是無(wú)毒性、無(wú)抗原性，無(wú)補(bǔ)體、白細(xì)胞和單核細(xì)胞激活及細(xì)胞因子的釋放，對(duì)凝血系統(tǒng)也沒(méi)有影響。而為了改善透析膜的生物相容性，除了不斷改善透析膜所用材料(由纖維素膜--改良纖維素膜--合成膜),近年來(lái)對(duì)透析膜表面修飾的研究也比較多。膜的表面性質(zhì)決定了血液和膜之間相互作用的特性及程度，包括蛋白質(zhì)的吸附、血栓癥、補(bǔ)體激活和免疫反應(yīng)等。膜表面的荷電性是膜表面性質(zhì)、血液和透析膜之間相互作用的關(guān)鍵特性之一。透析膜的表面荷電性能對(duì)透析膜的溶質(zhì)清除率、對(duì)補(bǔ)體激活作用和蛋白質(zhì)吸附、血液凝固均有重大影響34,是理解血液和膜之間相互作用的基礎(chǔ)。目前膜表面修飾抗凝中研究和應(yīng)用最多的是血仿膜肝素吸附法。其原理是：臨床所用的透析膜中血仿膜是唯一帶正電荷的膜，其膜表面帶有含正電荷的二已氨基乙基簇，而肝素為帶二價(jià)陰離子的粘多糖硫酸酯的鈉鹽。血仿膜肝素吸附法正是利用正負(fù)電荷相吸的原理，使膜內(nèi)帶正電荷的二已氨基乙基簇接觸帶負(fù)電荷的溶液時(shí)，在血仿膜透析器內(nèi)膜面形成有抗凝作用的肝素界面，達(dá)到局部良好的抗凝效果[35]。具體用法為：①透析前生理鹽水1000ml沖洗透析器及動(dòng)靜脈管路后，排空含有殘留消毒劑的預(yù)沖液；②肝素鹽水50mg--100mg/500ml做閉管循環(huán)，血泵速100ml/min,吸附25--30min后排空肝素鹽水；③再用生理鹽水500ml沖洗吸均證明其是一種安全有效的抗凝方法。由于肝素只吸附于透析膜上，并沒(méi)有進(jìn)入體內(nèi)，其引起出血并發(fā)癥的概率很低，而且不會(huì)出現(xiàn)肝素誘導(dǎo)血小板減少、骨質(zhì)凝方法。但是也有報(bào)道，認(rèn)為其存在少數(shù)病人不能充分抗凝、透析過(guò)程需要密切監(jiān)控、缺乏循證醫(yī)學(xué)證據(jù)等缺點(diǎn)，對(duì)其應(yīng)用持保守態(tài)度39。近年來(lái)亦有使用低分子肝素對(duì)透析器以及透析管路進(jìn)行表面修飾而成功抗凝的報(bào)道4。肝素吸附法僅僅利用了血仿膜表面的正電荷與帶負(fù)電荷的肝素結(jié)合，并沒(méi)有改變膜表面的荷電性，且僅僅應(yīng)用于血仿膜。近年來(lái)，有人開(kāi)始嘗試改變透析膜的表面荷電性。AN69聚丙烯腈膜表面帶負(fù)電荷，SylvieLavaud?1等運(yùn)用聚乙烯亞胺壓條法中和其表面負(fù)電荷，繼而與帶負(fù)電荷的肝素牢固結(jié)合，并成功應(yīng)用于羊的血液透析。Wen-ChingLin(42等將殼聚糖與肝素形成聚合電解質(zhì)絡(luò)合物，再共價(jià)固定于聚丙烯腈膜表面。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表面，修飾后的聚丙烯腈膜親水性增加，的是，經(jīng)過(guò)修飾后的聚丙烯腈膜能夠抑制綠膿桿菌的活性。盡管這些方法還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用，但是為我們探索膜修飾抗凝指出了一條新的道路。最近有人應(yīng)用層層自組裝技術(shù)(layer-by-layerself-assemblytechnique)進(jìn)行膜的表面修飾。層層自組裝技術(shù)是基于聚電解質(zhì)陰陽(yáng)離子所帶正負(fù)電荷間相互作用的一種自組裝超分子技術(shù)。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是在表面荷電的基材表面通過(guò)靜電相互作用交替地吸附上帶相反電荷的聚電解質(zhì)陰陽(yáng)離子。因此，它具有一系列優(yōu)點(diǎn)，如：組裝分子的選擇范圍廣泛，可以為合成的聚電解質(zhì)，也可以是蛋白質(zhì)、多糖、DNA等荷電的生物活性大分子；其制備工藝簡(jiǎn)單，通過(guò)簡(jiǎn)單的交替浸涂技術(shù)可實(shí)現(xiàn)在材料表面組裝分子在納米、亞微米尺度的有規(guī)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)；制備條件溫和，可在常溫水溶液中進(jìn)行，可以保證生物分子具有維持生物活性的天然構(gòu)像；此外，該方法適用的基體材料種類多，對(duì)基體材料的體型結(jié)構(gòu)適應(yīng)性強(qiáng)，并可在具有復(fù)雜體型結(jié)構(gòu)的裝置和材料上實(shí)現(xiàn)。具體方法為：殼聚糖(作為正電荷層及抗菌劑)和硫酸右旋糖苷(作為負(fù)電荷層及抗黏附劑)組成聚合電解質(zhì)層，然后應(yīng)用疊層自組裝技術(shù)對(duì)膜進(jìn)行表面修飾。研究43,4.45證明：經(jīng)過(guò)四個(gè)雙層裝載后(硫酸右旋糖苷層與血液接觸),接觸角以及膜zeta電位達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值。經(jīng)過(guò)修飾后，膜的親水性、生物相容性可大大提高。與血液接觸的右旋糖苷層可以抑制血小板黏附和血漿纖維蛋白原吸附，明顯延長(zhǎng)凝血時(shí)間。另外經(jīng)過(guò)修飾的膜還具有一定的抗菌能力。GuillermoA.Ameer等46在1999年發(fā)明了一種設(shè)備，肝素酶I以一種特殊的方式固定于其中。肝素酶I能特異性的將肝素降解為碎片并滅活其抗凝活性。局部肝素法抗凝時(shí)，將肝素從動(dòng)脈端注入，而將該設(shè)備安裝于靜脈端，在血液進(jìn)入體內(nèi)前將肝素完全清除。該方法可以達(dá)到充分的體外抗凝，而無(wú)魚(yú)精蛋白引起的反跳出血、低血壓等并發(fā)癥。該方法已經(jīng)成功的應(yīng)用于羊的血液凈化14,但不知為何一直無(wú)臨床應(yīng)用的報(bào)道?？鼓茄簝艋委煹靡赃M(jìn)行順利進(jìn)行的關(guān)鍵，而選擇何種抗凝方法需要根據(jù)患者的具體情況以及本單位的條件進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，個(gè)體化選擇對(duì)患者最有利的抗凝方法。ICU:fromrenalreplacementtherapy(RRT)tomultipleorgansupporttherapy(MOST).[J]IntJArtOrg,2002,25(8):733-747.[2].孫玉汾，容永璋.連續(xù)性血液濾過(guò)治療多器官功能障礙綜合征臨床分析[J][3].UchinoS,BellomoR,MorimatsuH,etal.Continuousrenalreplhaemofiltrationonoutcomesofacuterenaltrial.[J]Lancet2000;356:26-30[5].HenriquezF,Rodrihemodialysis.Casereportandreviewoftheliterature.[J]Nefrologia.2006;26(6):734-7.[6].LaiKN,HoK,CheungRCKetabonemetabolismandhyperlipidemiainpatientsonmaintenancehemodialysis.[J]IntJArtifOrgans20[7].TaalMW,MasudT,GreenD,Cdensityinhaemodialys[9].樊桂娟.局部肝素抗凝在高危出血傾向患者行血液透析中的應(yīng)用及護(hù)理[J]中國(guó)臨床護(hù)理雜志2006.5(6):13-15[10].FealyN,BaldwinI,JohnstoneM,controlledcrossoverstudycomparingregionalheparinizationtoregionalcitanticoagulationforcontinuousvenovenoushemofiltration.[[11].DavenportA.Low-molecular-weightheparinforroutin[12].GrzegorzewskaAE,M?otantiplateletdrugs,andbonemineraldensityindialysis[13].BerniehB,BoobesY,AlHakimMR,Long-TermUseofLow-Molecular-WeightHeparininHemodialysisPatients:A7-YearExperience.[J]BloodPurif.2009Feb4;27(3):