食品中乳鐵蛋白的測定酶聯(lián)免疫吸附法

1食品中乳鐵蛋白的測定酶聯(lián)免疫吸附法本文件規(guī)定了食品中乳鐵蛋白測定的酶聯(lián)免疫吸附法。本文件適用于生乳、巴氏殺菌乳、調制乳、風味發(fā)酵乳、含乳飲料等含乳或添加乳成分液體食品，以及調制乳粉、嬰幼兒配方乳粉、固體飲料等含乳或添加乳成分固體食品中乳鐵蛋白含量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3原理利用抗原-抗體特異性結合反應，對樣品中乳鐵蛋白含量進行競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定。標準品或樣品中游離的乳鐵蛋白與其酶標記物競爭性的結合微孔中預先包被的乳鐵蛋白抗體結合位點。未結合的乳鐵蛋白在洗滌步驟被除去。結合的酶標記物將無色的底物轉化為藍色產(chǎn)物。加入反應終止液后顏色由藍色轉變?yōu)辄S色。標準品或樣品中乳鐵蛋白含量與吸光度值成反比，通過測定450nm波長下吸光度值和繪制標準曲線，計算得到樣品中乳鐵蛋白含量。4試劑和材料4.1乳鐵蛋白酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（EuroProximaLACTOFERRINFASTELISA）1參見附錄A，或與本標準檢測原理相同且經(jīng)等效驗證的乳鐵蛋白酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒。4.2純水根據(jù)GB/T6682-2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水。4.3空白嬰幼兒配方乳粉市售未添加且未標注含有乳鐵蛋白的嬰幼兒配方乳粉。5儀器和設備1給出這一信息是為了方便本文件的使用者，并不表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可以使用這些等效的產(chǎn)品。25.1酶標儀：450nm。5.2分析天平：感量0.01g。5.3渦旋混勻儀。5.4微孔板振蕩器。5.5單道移液器：2μL~20μL，10μL~100μL，50μL~200μL，100μL~1000μL，500μL~5000μL。5.6八道移液器：30μL~300μL。6分析步驟6.1試劑配制6.1.11×稀釋緩沖液：按照1:10比例稀釋試劑盒中10×稀釋緩沖液濃縮液，現(xiàn)配現(xiàn)用。如移取1.0mL10×稀釋緩沖液濃縮液到9.0mL水中稀釋混勻。6.1.21×洗滌緩沖液：按照1:20比例稀釋試劑盒中20×洗滌緩沖液濃縮液，現(xiàn)配現(xiàn)用。如移取1.0mL20×稀釋緩沖液濃縮液到19.0mL水中稀釋混勻。1個微孔需約1.0mL1×洗滌緩沖液洗滌。6.1.3標準稀釋工作液的配制：試劑盒標準品瓶中加入2.0mL1×稀釋緩沖液（6.1.1），混勻，得到濃度為2.5μg/mL的標準稀釋工作液。400μL/管分裝在潔凈的1.5mL離心管中，儲藏在-20°C條件下至試劑盒有效期結束。每次測定前取出1管回復至室溫，即為標準稀釋工作液7。使用標準稀釋工作液7進行其它梯度標準稀釋工作液的配制：儲藏在-20°C條件下的標準稀釋工作液7回復至室溫后，點甩離心，按照表1用1×稀釋緩沖液（6.1.1）逐級稀釋并混勻。表1梯度標準稀釋工作液的配制編號濃度(μg/mL）配制方法標準稀釋工作液10200μL1×稀釋緩沖液標準稀釋工作液20.078200μL標準稀釋工作液3+200μL1×稀釋緩沖液標準稀釋工作液30.156200μL標準稀釋工作液4+200μL1×稀釋緩沖液標準稀釋工作液40.313200μL標準稀釋工作液5+200μL1×稀釋緩沖液標準稀釋工作液50.625200μL標準稀釋工作液6+200μL1×稀釋緩沖液標準稀釋工作液6200μL標準稀釋工作液7+200μL1×稀釋緩沖液標準稀釋工作液72.500標準品瓶中加入2.0mL1×稀釋緩沖液6.1.41×酶標記物：使用前點甩離心。用1×稀釋緩沖液（6.1.1）按照1:100比例稀釋試劑盒中100×乳鐵蛋白-HRP濃縮液，現(xiàn)配現(xiàn)用。樣品數(shù)為X個，需配制1×酶標記物的體積為（7+X）×2×50μL+50μL。如樣品數(shù)為1個，需配制850μL1×酶標記物，移取8.5μL100×乳鐵蛋白-HRP濃縮液到841.5μL1×稀釋緩沖液（6.1.1）中稀釋混勻。6.1.5試劑配制前將試劑盒回復至室溫，使用完盡快放置2°C~8°C。6.2樣品前處理6.2.1乳鐵蛋白含量/標簽值<200mg/kg（L）的樣品6.2.1.1液體樣品3計算稀釋倍數(shù)，使得測定前樣品中乳鐵蛋白的濃度在0.156~0.313μg/mL之間，如稀釋倍數(shù)為100倍，需進行二級稀釋：移取100μL液體樣品，加入900μL1×稀釋緩沖液（6.1.1），渦旋混勻30s得到一級稀釋液；移取100μL一級稀釋液到900μL1×稀釋緩沖液（6.1.1）中，漩渦混勻30s后得到二級稀釋液。6.2.1.2固體樣品計算稀釋倍數(shù)，使得測定前樣品中乳鐵蛋白的濃度在0.156~0.313μg/mL之間，如稀釋倍數(shù)為200倍，需進行溶解和稀釋：取1.00g樣品，加水至10mL，渦旋混勻5min后，移取50μL液體樣品，加入950μL1×稀釋緩沖液（6.1.1），渦旋混勻30s得到稀釋液。6.2.2乳鐵蛋白含量/標簽值在200~2500mg/kg（L）范圍內的樣品計算稀釋倍數(shù)，使得測定前樣品中乳鐵蛋白的濃度在0.156~0.313μg/mL之間，如稀釋倍數(shù)為2000倍：固體樣品稱取1.00g，液體樣品移取1.0mL，加水至10mL，渦旋混勻5min后，移取50μL混勻后的樣品溶液至450μL1×稀釋緩沖液（6.1.1）中稀釋混勻得到一級稀釋液；移取50μL一級稀釋液到950μL1×稀釋緩沖液（6.1.1）中，渦旋混勻30s后得到二級稀釋液。6.2.3乳鐵蛋白含量/標簽值≥2500mg/kg（L）的樣品計算稀釋倍數(shù)，使得測定前樣品中乳鐵蛋白的濃度在0.156~0.313μg/mL之間，如稀釋倍數(shù)為40000倍：先按照6.2.2進行樣品前處理，稱取1.00g樣品，加水至10mL，渦旋混勻5min，用1×稀釋緩沖液（6.1.1）稀釋400倍后，得到樣品二級稀釋液。對空白嬰幼兒配方乳粉（4.3）進行樣品前處理：稱取1.00g樣品，加水至10mL，渦旋混勻5min，用1×稀釋緩沖液（6.1.1）稀釋200倍后，得到空白嬰幼兒配方乳粉稀釋液。用空白嬰幼兒配方乳粉稀釋液對樣品二級稀釋液進行進一步稀釋，移取50μL樣品二級稀釋液到450μL空白嬰幼兒配方乳粉稀釋液中混勻，此為用于測定的樣品液。6.3測定將預先包被有乳鐵蛋白抗體的微孔插入微孔板架并做好標記，標準稀釋工作液和樣品均做雙平行。平行加入50μL標準稀釋工作液1~7和樣品至微孔，再加入50μL1×酶標記物（6.1.4）至每個微孔。輕輕地水平搖動微孔板使其均勻混合，20℃~25℃黑暗處避光孵育30min。孵育結束后，倒去微孔中的液體，每個微孔每次加入300μL1×洗滌緩沖液（6.1.2）洗滌并在吸水紙上拍干，洗板3次。洗板結束后，加入100μL底物/發(fā)色劑至每個微孔，20℃~25℃黑暗處避光孵育15min。孵育結束后，加入100μL終止液至每個微孔，并立即讀取450nm波長下吸光度值。7結果與計算7.1標準曲線制作和測定結果計算以標準稀釋工作液2~7質量濃度為橫坐標，式（1）計算的百分比為縱坐標，繪制半對數(shù)曲線，計算樣品液中乳鐵蛋白濃度。乳鐵蛋白標準稀釋工作液和樣品液的百分比吸光度值按式（1）計算：4)式中：A——百分比吸光度值；S——乳鐵蛋白標準工作稀釋液或樣品液的平均吸光度值；S0——標準稀釋工作液1的平均吸光度值?？梢允褂迷噭┖信涮追治鲕浖IDASOFT?Win中cubicspline模式進行標準曲線繪制和測定結果計算，得到待測樣品液中的乳鐵蛋白的濃度。7.2測定結果表述固體樣品中乳鐵蛋白含量按式（2）計算：)式中：X——樣品中乳鐵蛋白含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；c——待測樣品液中乳鐵蛋白濃度，單位為微克每毫升(μg/mL）；f——樣品稀釋倍數(shù)，除第一步固體樣品溶解之外的稀釋倍數(shù)；V——定容體積，為10mL；從μg/mL更換為mg/kg的換算；m——樣品質量，單位為g；液體樣品中乳鐵蛋白含量按式（3）計算：式中：X——樣品中乳鐵蛋白含量，單位為毫克每升（mg/L）；c——待測樣品液中乳鐵蛋白濃度，單位為微克每毫升(μg/mL）；f——樣品稀釋倍數(shù)；——從μg/mL更換為mg/L的換算；8質量控制8.1試劑失效5出現(xiàn)以下情況之一表明試劑失效，不能進行測定或測定結果作廢：-貯存在試劑瓶中的底物顏色出現(xiàn)藍色；-加入終止液后標準稀釋工作液1（0μg/mL）吸光度值<0.8。8.2精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。9檢測限和定量限本方法檢測生乳的檢測限為46.50mg/L，定量限為64.52mg/L；巴氏殺菌乳的檢測限為7.02mg/L，定量限為9.25mg/L；調制乳的檢測限為6.19mg/L，定量限為8.33mg/L；風味發(fā)酵乳的檢測限為7.00mg/L，定量限為9.80mg/L；含乳飲料的檢測限為7.12mg/L,定量限為8.91mg/L；調制乳粉的檢測限為13.22mg/kg，定量限為17.08mg/kg；嬰幼兒配方乳粉的檢測限為11.40mg/kg，定量限為13.77mg/kg；固體飲料的檢測限是13.58mg/kg，定量限為17.04mg/kg。6（規(guī)范性）乳鐵蛋白酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒A.1試劑盒組成乳鐵蛋白檢測試劑盒EuroProximaLACTOFERRINFASTELISA包括：a）預包被乳鐵蛋白抗體的96孔可拆分微孔板：12×8孔；b）100×乳鐵蛋白-辣根過氧化物酶濃縮液：150μL/瓶×1瓶；c）乳鐵蛋白標準品凍干粉：3瓶；d）10×稀釋緩沖液濃縮液（磷酸鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、吐溫20、明膠）：30mL/瓶×1瓶；e）20×洗滌緩沖液濃縮液（磷酸鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、氯化鈉、吐溫20）：30mL/瓶×1瓶；f）底物