《食品毒理學(xué)》課件-4食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)

第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)實(shí)訓(xùn)一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理

一、預(yù)備知識(shí)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房的環(huán)境要求

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房的環(huán)境因素

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房的環(huán)境因素分為：①物理因素。②化學(xué)因素。③生物因素。④人為因素。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境總體上可分為三類：①普通環(huán)境。②屏障環(huán)境。③隔離環(huán)境。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房的環(huán)境指標(biāo)

環(huán)境條件不僅影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，而且還直接影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、動(dòng)物反應(yīng)的敏感性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，所以必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的環(huán)境條件。

封閉式動(dòng)物房要求將各種影響因素控制如下：溫度20～26℃；濕度50％～70％；噪聲＜60dB。并且還應(yīng)注意防止人耳聽不到的20000～50000Hz超聲波的影響；換氣8～15次/h；氣流10～25㎝/s，定時(shí)照明l0～14h/d。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房的房間不宜過大，每間以20㎡為好。10只小鼠至少占1～1.5m3，l0只大鼠2～3m3，每只兔1m3。動(dòng)物房的其他環(huán)境指標(biāo)如表4-1所示。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（三）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房的消毒措施

為了保障工作人員的健康和預(yù)防實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病，動(dòng)物房?jī)?nèi)應(yīng)制定定期的清潔衛(wèi)生和消毒制度，保持室內(nèi)清潔。每天上班后，立即檢查動(dòng)物的一般狀況，發(fā)現(xiàn)病鼠、死鼠應(yīng)查明原因，及時(shí)處理并登記。消毒包括定期消毒和臨時(shí)消毒。定期消毒包括每日(1～2次)、周(大掃除1次)、月、季度等對(duì)動(dòng)物房、籠具、墊料、器械以及工作人員的手、衣物進(jìn)行消毒；臨時(shí)消毒是指為了撲滅、控制或預(yù)防疾病的傳播所采用的臨時(shí)措施。

動(dòng)物房消毒方法可分為：①機(jī)械消毒法。這是常規(guī)使用的方法。②物理消毒法。③化學(xué)消毒法。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)二、操作訓(xùn)練：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理

（一）實(shí)訓(xùn)目的

（二）儀器和材料

（三）操作方法

1.大、小鼠的日常飼養(yǎng)管理

2.兔的日常飼養(yǎng)管理

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康的觀察和評(píng)價(jià)

（1）動(dòng)物的外表與行為觀察

（2）個(gè)體檢查

（3）采食和飲水觀察第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（四）實(shí)訓(xùn)結(jié)果

1.計(jì)算動(dòng)物一晝夜之內(nèi)的攝食量和飲水量。

2.對(duì)動(dòng)物進(jìn)行觀察檢查后，認(rèn)真填寫以下記錄表，作出相應(yīng)評(píng)價(jià)。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)實(shí)訓(xùn)二實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、標(biāo)記和染毒技術(shù)

一、預(yù)備知識(shí)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒途徑

毒理學(xué)試驗(yàn)中染毒途徑的選擇，應(yīng)盡可能模擬人在接觸該受試物的方式。最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。不同染毒途徑，毒物的吸收速率不同，一般是：靜脈注射＞吸入＞肌肉注射＞腹腔注射＞皮下注射＞經(jīng)口＞皮內(nèi)注射＞其他途徑(如經(jīng)皮等)。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（一）經(jīng)口(胃腸道)染毒

經(jīng)口染毒指經(jīng)口攝入到達(dá)胃或用器械直接送入胃的過程。常用灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方式。

（二）經(jīng)呼吸道染毒

氣態(tài)和易揮發(fā)的液態(tài)化學(xué)物及氣溶膠均有可經(jīng)呼吸道染毒。經(jīng)呼吸道染毒（inhalationexposure）常用于研究氣體、蒸汽、粉塵、煙、霧等環(huán)境污染物的毒性，這些外源化學(xué)物可由人工染毒，也可由動(dòng)物自行吸入。前者是將外源化學(xué)物氣管內(nèi)注入，后者有靜式吸入和動(dòng)式吸入兩種染毒方法。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（三）經(jīng)皮膚染毒

染毒過程：脫毛→涂抹受試物→覆蓋→固定。

（1）經(jīng)皮膚吸收毒性。

（2）皮膚刺激毒性。

（四）注射染毒

注射用藥品應(yīng)以注射途徑染毒，對(duì)非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑，如狗可用后肢隱靜脈注射，而嚙齒類的尾靜脈和肌肉注射難以多次染毒，必要時(shí)可改為皮下注射。注射染毒，應(yīng)調(diào)整受試物的pH及滲透壓，pH應(yīng)5～8，最好是等滲溶液，動(dòng)物對(duì)高滲的耐受力比低滲強(qiáng)。靜脈注射應(yīng)控制速度，大鼠尾靜脈注射最好控制在10秒以上。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)注射染毒主要用于絕對(duì)毒性研究、比較毒性研究、毒物靜脈注射代謝動(dòng)力學(xué)研究和中毒的急救藥物篩選。常根據(jù)試驗(yàn)要求選擇。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同注射途徑的注射量見表4-3。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)二、操作訓(xùn)練：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、標(biāo)記和染毒技術(shù)

（一）實(shí)訓(xùn)目的

（二）儀器和材料

（三）操作方法和步驟

1.健康動(dòng)物的選擇和性別鑒定第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抓取方法第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重、分組、編號(hào)、標(biāo)記方法

（1）稱重。大、小鼠秤的感應(yīng)量需在0.1g以下。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同要求，選擇一定數(shù)量的大、小鼠，體重要求在同一組內(nèi)、同性別動(dòng)物體重差異應(yīng)小于平均體重的10％，不同組間同性別動(dòng)物體重均值應(yīng)小于5％。

（2）隨機(jī)數(shù)字分組法。

將實(shí)驗(yàn)用30只雄性動(dòng)物平均分成A，B，C，D，E，F(xiàn)六組，每組5只動(dòng)物。將已編好號(hào)的動(dòng)物依號(hào)碼用隨機(jī)數(shù)目表(見附表Ⅰ)分配。如選隨機(jī)數(shù)目表第二行，從第一個(gè)數(shù)目開始，依次抄下30個(gè)數(shù)目(依橫行、縱行、甚至斜行抄錄均可)。將各數(shù)目一律以組數(shù)除6，以余數(shù)1，2，3，4，5，0代表應(yīng)分配于A，B，C，D，E，F(xiàn)各組的動(dòng)物。結(jié)果如表4-4(從第二行隨機(jī)數(shù)表開始)。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)

按上法分組后，A組有動(dòng)物7只，B組7只，C組6只，D組和E組各2只，F(xiàn)組6只。為使各組動(dòng)物數(shù)均達(dá)5只，再依隨機(jī)分配原則選出A組2只，C組1只給D組；B組選2只，F(xiàn)組選l只給E組。為此，繼續(xù)抄下隨機(jī)數(shù)字分別除以A、B、C、F各組動(dòng)物數(shù)。計(jì)算如下：56／7除盡，即將A組第7只動(dòng)物(25號(hào))給D組；50／6，余數(shù)為2，即將A組第2只動(dòng)物(4號(hào))給D組；26／6余數(shù)為2，即將C組第2只動(dòng)物(9號(hào))給D組。依次類推，最后調(diào)整分組如表4-5。

雌性動(dòng)物也依上法分組。然后將雌、雄動(dòng)物合組進(jìn)行試驗(yàn)。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（3）編號(hào)及標(biāo)記。

①染色法。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)②耳緣孔口法。大、小鼠常用此法。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)③烙印法。適用于兔以上的動(dòng)物。④號(hào)牌法。適用于大動(dòng)物。4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被毛去除方法

方法有三種：剪毛、拔毛和脫毛。

5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒方法

（1）灌胃法第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（2）吞咽膠囊。

（3）喂飼。

（4）小鼠腹腔注射法。(如圖4-12)

（5）小鼠皮下注射法。(如圖4-13)第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（6）小鼠尾靜脈注射法。（如圖4-14）

（7）小鼠腦室注射法。（如圖4-15）第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)實(shí)訓(xùn)三實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖和生物樣本采集、

制備技術(shù)

一、預(yù)備知識(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉方法

（一）常用的麻醉劑

（1）揮發(fā)性麻醉劑：這類麻藥包括乙醚、氯仿等。

（2）非揮發(fā)性麻醉劑：種類較多，包括苯巴比妥鈉、戊巴比妥鈉、硫噴妥鈉等巴比妥類的衍生物，氨基甲酸乙酯和水合氯醛。

（3）中藥麻醉劑：如象洋金花、曼陀羅等。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（二）動(dòng)物的麻醉方法

1.全身麻醉

（1）吸入法。

（2）腹腔和靜脈給藥麻醉法。

2.局部麻醉

3.麻醉的注意事項(xiàng)

（1）注射必須緩慢，同時(shí)觀察肌肉緊張性、角膜反射和對(duì)皮膚夾捏的反應(yīng)，當(dāng)這些活動(dòng)明顯減弱或消失時(shí)，立即停止注射。

（2）必須注意保溫。

（3）在寒冷冬季，麻醉劑在注射前應(yīng)加熱至動(dòng)物體溫水平。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)二、操作訓(xùn)練：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖和生物樣本采集、制備技術(shù)

（一）實(shí)訓(xùn)目的

（二）儀器和材料

（三）操作方法

1.采血

(1)鼠尾采血。

(2)眼眶靜脈叢（竇）采血。

(3)摘眼球采血。

(4)腹主動(dòng)脈或股動(dòng)(靜)脈采血。

(5)斷頭采血

(6)心臟采血。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每次采血量不能過多，表4-6是最大安全采血量。

2．血清與血細(xì)胞分離

(1)血清的制備

(2)血細(xì)胞分離。

3．尿液收集

(1)代謝籠法。（圖4-17）

(2)反射排尿法。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)4．處死

(1)頸椎脫臼法

。

(2)空氣栓塞法

。

(3)斷頭法

。

(4)急性放血法

。

(5)擊打法

。

(6)化學(xué)藥物致死法。

(7)麻醉致死法。

(8)其他：電擊法、槍擊法、微波法等。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大體解剖

6.組織病理學(xué)檢查

7.組織勻漿的制備

(1)動(dòng)物處死。

(2)臟器制備。

(3)勻漿制備。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（四）實(shí)訓(xùn)結(jié)果

(1)數(shù)據(jù)記錄，如下表所示，并計(jì)算臟體比（如肝／體比、腎／體比、脾／體比等)。

(2)器官顏色和形態(tài)描述。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)

實(shí)訓(xùn)四

皮膚刺激試驗(yàn)

一、預(yù)備知識(shí)：外源性化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收的途徑及影響因素

（一）外源性化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收的途徑

外源化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收的途徑：

①毒物通過表皮脂質(zhì)屏障→角質(zhì)層→透明層→顆粒層→生發(fā)層和基膜→真皮層→血液。

②毒物通過汗腺、皮脂腺和毛囊等皮膚附屬器，繞過表皮屏障直接進(jìn)入真皮。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)圖4-18皮膚的基本組成（二）影響經(jīng)皮膚吸收的因素

1.角質(zhì)層受損時(shí)通透性就會(huì)提高，吸收增加。

2.接觸面積和皮膚的血流量。

3.在高溫高濕的氣象條件下，皮膚的血流量增加會(huì)提高吸收速率。

4.在酸、堿和皮膚刺激物對(duì)皮膚產(chǎn)生損傷后通透性也會(huì)明顯提高。

脂溶性毒物可經(jīng)皮膚直接吸收，如芳香族的氨基、硝基化合物，有機(jī)磷化合物，苯及同系物等。個(gè)別金屬如汞亦可經(jīng)皮膚吸收。某些氣態(tài)毒物，如氰化氫，濃度較高時(shí)也可經(jīng)皮膚進(jìn)入體內(nèi)。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)二、操作訓(xùn)練：皮膚刺激試驗(yàn)

（一）實(shí)訓(xùn)目的

（二）實(shí)訓(xùn)原理

（三）儀器和材料

（四）操作方法

1.小鼠脫毛技術(shù)

方法有三種：剪毛、拔毛和脫毛。

2.小鼠染毒操作

（1）浸尾法。

（2）涂布法。

3.皮膚局部刺激作用的觀察方法和評(píng)價(jià)。（見表4-8、表4-9）第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)4.實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)

5.注意事項(xiàng)

（五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察辣椒油對(duì)小鼠皮膚的刺激作用，并做出皮膚刺激性分級(jí)的判斷。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)實(shí)訓(xùn)五經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)

一、預(yù)備知識(shí)：食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的幾個(gè)基本問題

（一）實(shí)驗(yàn)的原則

在食品毒理學(xué)試驗(yàn)中，有三個(gè)基本的原則。

1.化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的作用可以外推于人。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對(duì)人潛在危害的必需的和可靠的方法。

3.選擇成年的健康(雄性和雌性未孕)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人可能的暴露途徑。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

1.物種的選擇

在毒理學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有地鼠、獼猴、小型豬、雞等。

2.品系的選擇

品系(strain)指起源于一個(gè)共同祖先而具有特定基因型的一群動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按遺傳學(xué)控制分類可分為：（1）近交系。（2）雜交群動(dòng)物(雜交1代，F(xiàn)1)。（3）封閉群。

遺傳毒理學(xué)一般利用嚙齒類動(dòng)物，主要是小鼠或大鼠。如果有合適的理由，其他物種也可接受。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)3.對(duì)微生物控制的選擇

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按微生物控制分為四級(jí)，見表4-10。毒性試驗(yàn)及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(jí)(或二級(jí)以上)的動(dòng)物，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)4.個(gè)體選擇

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)外源化學(xué)物的毒性反應(yīng)還存在個(gè)體差異。

（1）性別。

（2）年齡和體重。

（3）生理狀態(tài)。

（4）健康狀況。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（三）毒理學(xué)試驗(yàn)常用的對(duì)照

毒理學(xué)試驗(yàn)常用的對(duì)照有4種：

1.未處理對(duì)照組(空白對(duì)照組)

2.陰性(溶劑/賦形劑)對(duì)照

3.陽性對(duì)照

4.歷史性對(duì)照第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)二、操作訓(xùn)練：經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)

（一）實(shí)訓(xùn)目的

（二）實(shí)訓(xùn)原理

（三）儀器和材料

（四）操作方法及步驟

1.健康動(dòng)物的選擇和性別鑒定。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重、編號(hào)和隨機(jī)分組。

3.受試化學(xué)物溶液的配制。

4.小鼠灌胃操作技術(shù)。

5.毒性癥狀的觀察。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)6.注意事項(xiàng)。

（五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照表4-12的內(nèi)容進(jìn)行填寫。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)實(shí)訓(xùn)六

經(jīng)呼吸道急性毒性試驗(yàn)

一、預(yù)備知識(shí)：呼吸道吸入染毒方式

（一）靜式吸入染毒

靜式吸入染毒系將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于一個(gè)一定的體積的密閉容器內(nèi)，加入定量的易揮發(fā)液態(tài)受試化合物或一定體積的氣態(tài)受試化合物，在容器內(nèi)形成所需的受試化合物的空氣環(huán)境。接觸一定時(shí)間（一般為2h或4h）后，觀察動(dòng)物的中毒反應(yīng)，并根據(jù)動(dòng)物的死亡情況和相應(yīng)的受試物濃度，求出LC50。

染毒柜體積、放置動(dòng)物種類和數(shù)量及放置時(shí)間相互關(guān)系見表4-13。第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)染毒柜為有機(jī)玻璃制成，現(xiàn)有容積有60L和100L兩種規(guī)格。

柜頂蓋部有三個(gè)附件。一個(gè)是投藥孔，一個(gè)是用于混勻蒸氣或氣體的小電扇，一個(gè)是插入溫度計(jì)的孔。在柜壁上掛有一個(gè)小不銹鋼碟為接受和蒸發(fā)液態(tài)受試物的藥物蒸發(fā)器。（如圖4-19）第四章食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)（二）動(dòng)式吸入染毒

動(dòng)式吸入染毒設(shè)備由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)成對(duì)設(shè)備的要求較高，優(yōu)點(diǎn)是在染毒過程中染毒柜內(nèi)氧分壓及受試物濃度較穩(wěn)定，缺點(diǎn)是消耗受試物的量大，并易于污染環(huán)境。動(dòng)式吸入染毒又分為整體接觸和口鼻接觸兩種，此設(shè)備設(shè)計(jì)為維持每小時(shí)12~15次的換氣，保證氧氣濃度為19%受試物的均勻分布。染毒柜應(yīng)維持成輕微的負(fù)壓以免受試物從染毒柜逸出。要保證染毒柜中氣流的穩(wěn)