第四章目的基因的轉(zhuǎn)化及其原理

第四章目的基因的轉(zhuǎn)化及其原理一、植物基因工程載體命名規(guī)則及種類(lèi)1、植物基因工程載體命名規(guī)則:(1)

pSC101plasmidStanleyCohen(人名)pTiT37/pAtT37根癌農(nóng)桿菌得質(zhì)粒類(lèi)型(Agrobacteriumtumefaciens)pRiT37/pArT37發(fā)根農(nóng)桿菌得質(zhì)粒類(lèi)型(Agrobacteriumrhizogenes)2(2)每個(gè)基因位點(diǎn)均以三個(gè)斜體小寫(xiě)字母表示,如:leu(亮氨酸基因位點(diǎn))

基因表現(xiàn)型用正體表示,如Leu(3)基因中任何位點(diǎn)發(fā)生突變則在該基因符號(hào)后加該位點(diǎn)斜體大寫(xiě)字母,如亮氨酸A、B位點(diǎn)分別為突變型或缺陷型,表示為:leuA、leuB(4)抗性和敏感性分別用R或r,S或s表示

32、植物基因工程載體得種類(lèi)及特性植物基因工程載體克隆載體中間載體中間克隆載體中間表達(dá)載體卸甲載體onc-onc+轉(zhuǎn)化載體中間黏粒載體質(zhì)粒/黏粒載體基因標(biāo)記載體一元轉(zhuǎn)化載體(順式載體)雙元轉(zhuǎn)化載體(反式式載體)共整合載體SEV(拼接末端載體;split-endvector)4二、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒得結(jié)構(gòu)與功能1、Ti質(zhì)粒得遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能2、T-DNA得基因結(jié)構(gòu)與功能3、Vir區(qū)操縱子得基因結(jié)構(gòu)與功能

5一、Ti質(zhì)粒得遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能1、Ti質(zhì)粒得遺傳特性及類(lèi)型Ti質(zhì)粒就是根癌農(nóng)桿菌染色體外得遺傳物質(zhì),為雙股共價(jià)閉合得環(huán)狀DNA分子。

根據(jù)其誘導(dǎo)得植物冠癭瘤中所合成得冠癭堿種類(lèi)不同,Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類(lèi)型:章魚(yú)堿型(octopine)胭脂堿型(nopaline)農(nóng)桿堿型(agropine)農(nóng)桿菌素堿型(agrocinopine)或稱(chēng)琥珀堿型(succinamopine)6圖3-1章魚(yú)堿型Ti質(zhì)粒基因圖。章魚(yú)堿基因T-DNA區(qū)結(jié)合轉(zhuǎn)移區(qū)冠癭堿代謝復(fù)制起始區(qū)毒力區(qū)生長(zhǎng)素基因細(xì)胞分裂素基因冠癭堿合成72、Ti質(zhì)粒得功能區(qū)域Ti質(zhì)?？煞譃樗膫€(gè)區(qū):(1)T-DNA區(qū)(transferred-DNAregions):

T-DNA就是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí),從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞得一段DNA,稱(chēng)為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上得基因與腫瘤得形成有關(guān)。(2)Vir區(qū)(virulenceregion)該區(qū)段上得基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移,使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性,故稱(chēng)之為毒區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰,約占Ti質(zhì)粒DNA得三分之一。8(3)Con區(qū)(regionsencodingconjugations)該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移得有關(guān)基因(tra),調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間得轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因,誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移,因此稱(chēng)之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。(4)Ori區(qū)(originofreplication)該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒得自我復(fù)制,故稱(chēng)之為復(fù)制起始區(qū)。9大家有疑問(wèn)的，可以詢(xún)問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)3、Ti質(zhì)粒得生物學(xué)功能Ti質(zhì)粒得功能可歸為以下7個(gè)方面:①參與寄主細(xì)胞合成植物激素吲哚乙酸(IAA)和一些細(xì)胞分裂素得活動(dòng)。②誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導(dǎo)得腫瘤得形態(tài)學(xué)特征和冠癭堿成分。③賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物得能力。④賦予寄主菌株對(duì)土壤桿菌所產(chǎn)生得細(xì)菌素得反應(yīng)性。⑤為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁得能力。⑥決定寄主菌株得植物寄主范圍。⑦有得Ti質(zhì)粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體生長(zhǎng)與發(fā)育,即具有對(duì)噬菌體得“排外性”。11表4-1Ti質(zhì)粒放入部分基因及其功能基因縮寫(xiě)表型及功能在基因圖上得位置(kb)pTiC58(211kb)pTiAch5(195kb)age排斥噬菌體API111-11310-12agr對(duì)PAT-K84質(zhì)粒編碼得農(nóng)桿菌素敏感138-141—arc分解精氨酸4-59-10agc分解農(nóng)桿菌—54-57noc分解胭脂堿18-20—nos合成胭脂堿0-1—occ分解章魚(yú)堿—39-41ocs合成章魚(yú)堿—0-1ori復(fù)制起點(diǎn)33-3590-95roi(tmr)抑制長(zhǎng)根206-207190-192shi(tms)抑制長(zhǎng)芽202-203187-188traTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)移121-12321-30inc質(zhì)粒不相容性33-3590-9512二、T-DNA得基因結(jié)構(gòu)與功能

1、T-DNA得發(fā)現(xiàn)

Chilton等人于1982發(fā)現(xiàn)。(MD

CHILTON,DTEPFER,APETIT,DCHANTAL

,CDFRANCINE,TJACQUES、

Agrobacteriumrhizogenes

insertsT-DNAintothegenomesofthehostplantrootcells、Nature,1982(295):432-434)

研究證明,這部分DNA就是從質(zhì)粒DNA上切割后,轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞,故稱(chēng)之為轉(zhuǎn)移DNA(transferred-DNA)。13GGCAGGATATATATTCAATTGTAATGGCAGGATATATATACCGGTTGTAATT圖3-2Ti質(zhì)粒上幾個(gè)重要區(qū)域及其序列LB:左邊界序列;RB:右邊界序列142、T-DNA得結(jié)構(gòu)特點(diǎn)l

Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)得長(zhǎng)度約為23kb;l

T-DNA僅存在于植物腫瘤細(xì)胞得核DNA中;l

在T-DNA得5′端和3′端都有真核表達(dá)信號(hào)。如TATAbox、AATAAbox及polyA等。15T-DNA得兩端左右邊界各為25bp得重復(fù)序列,即邊界序列(bordersequence),分別稱(chēng)之為左邊界(BL或TL)和右邊界(BR或TR)。該25bp邊界序列屬保守序列,但通常右邊界(TR)序列更為保守,左邊界(TL)序列在某些情況下有所變化。其核心部分就是14bp,可分為10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)兩部分,就是完全保守得。致瘤性:右邊界作用大于左邊界163、T-DNA上得編碼基因及功能

T-DNA得轉(zhuǎn)錄有下述共同點(diǎn):①T-DNA得兩條鏈都就是有意義鏈,即都能被轉(zhuǎn)錄。②T-DNA上每個(gè)基因都有各自得啟動(dòng)子。③基因得轉(zhuǎn)錄由植物細(xì)胞RNA聚合酶Ⅱ完成。④T-DNA具典型得真核生物RNA合成起始和終止得調(diào)節(jié)信號(hào),T-DNA得轉(zhuǎn)錄機(jī)理可能與真核生物相同。⑤植物或農(nóng)桿菌中可能有甲基化或去甲基化得調(diào)節(jié)基因活性。17TLTRTCiaaHiaaMauxiptcytocsfrsmasags圖4-3章魚(yú)堿型Ti質(zhì)粒得T-DNA編碼基因結(jié)構(gòu)iaaH:吲哚乙酸胺水解酶;iaaM:色氨酸單加氧酶;aux:生長(zhǎng)素;ipt:異戊烯基轉(zhuǎn)移酶;cyt:細(xì)胞分裂素;frs:琥珀堿合成酶;mas:甘露堿合成酶;ags:農(nóng)桿堿合成酶18T-DNA區(qū)基因得功能

第一類(lèi)就是編碼冠癭堿合成酶及分解代謝基因,如:frs、mas、ags第二類(lèi)就是致瘤基因;包括生長(zhǎng)素基因aux和細(xì)胞分裂素基因cyt

19三、Vir區(qū)操縱子得基因結(jié)構(gòu)與功能1、Vir區(qū)操縱子得基因結(jié)構(gòu):農(nóng)桿菌致瘤所必須得;Vir區(qū)僅位于T區(qū)DNA左側(cè);兩者之間得距離常隨Ti質(zhì)粒類(lèi)型不同而有差異。HABGCDEFtzsABGCDE章魚(yú)堿胭脂堿圖4-5章魚(yú)堿型和胭脂堿型Ti質(zhì)粒得Vir區(qū)編碼基因結(jié)構(gòu)20表4-4章魚(yú)堿型Ti質(zhì)粒vir基因基本結(jié)構(gòu)與功能遺傳座位分子量(kb)基因數(shù)表達(dá)方式功能virA2、81組成型幫助接受植物信號(hào)分子啟動(dòng)毒性區(qū)表達(dá)virG1、01組成型轉(zhuǎn)錄活化virC1、52誘導(dǎo)型T-DNA加工virD4、54誘導(dǎo)型T-DNA加工virE2、22誘導(dǎo)型T-DNA加工virB9、511誘導(dǎo)型膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白virF1、01誘導(dǎo)型T-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)virH94、22誘導(dǎo)型細(xì)胞色素P-450單氧化酶21三、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機(jī)理

已知農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后,只留在細(xì)胞間隙中。T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制,然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞,并非整個(gè)Ti質(zhì)粒都進(jìn)入植物細(xì)胞。該基因轉(zhuǎn)化過(guò)程就是一個(gè)復(fù)雜得遺傳工程。221、T-DNA得加工及轉(zhuǎn)移

23四、T鏈整合植物基因組得分子機(jī)理

1、整合位點(diǎn)及其特性T-DNA在植物染色體中得插入就是隨機(jī)得,可插入植物任何一條染色體插入位點(diǎn)常有以下特點(diǎn):①T-DNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍得植物基因位點(diǎn);②T-DNA與植物DNA連接處富含A,T堿基對(duì);③植物DNA上得插入靶位點(diǎn)與T-DNA邊界序列有一定程度得同源性。242、T-DNA得整合機(jī)理

雙鏈斷裂修復(fù)模型(DSBRmodel)單鏈缺口修復(fù)模型(SSGRmodel)

25Sci,IF:9、2052627Fig4-6IllegitimaterebinationmodelsforT-DNAintegration、(a)Double-strandbreak-repair(DSBR)andsingle-strandgap-repair(SSGR)modelsequallyexplaintheintegrationeventsleadingtoT-DNAinsertion621-x34、AsoutlinedintheDiscussion,theDSBRmodelpredictsadouble-strandbreakinthetarget、UnwoundorexonucleaseprocessedendsoftheT-DNAandofthetargetannealbypartialhomologouspairing、Single-strandoverhangsareremovedbyendo-orexonucleasedigestion;theendsarerepairedandligated、TheSSGRmodelpredictsanickinthetargetthatisconvertedtoagapbya5'-3'exonuclease、TheT-strandinvadesthegapandasynapsisisformedbypartialpairingbetweenT-DNAendsandtarget、TheoverhangsoftheT-DNAareremovedandtheT-strandisligatedtothetarget、AnickintroducedintothesecondstrandofthetargetinitiatesrepairsynthesisofthesecondstrandoftheT-DNA、(b)ApplicationoftheSSGRmodelforT-DNAinsertion621-36、Asproposedinthemodelofinsertion621-x34,repairattheendsofinvadingT-strandmayoccurbeforeligation、AbsenceofaninternalCAGTT-DNAsequencefromtherightjunctionofinsert621-36suggeststhatcopyingofthetargetplantDNAledtoalterationoftherightT-DNAendduringintegration、Mismatchrepairmaysimilarlyexplaintheobserveddeletion、(c)AmodifiedversionofSSGRmodelexplainingpossibleinvolvementofVirD2proteininrebinationeventsthatresultedinT-DNAinsertions621-37andN6H-cs4、T-DNAinvasiondepictedinthemodelinvolvesVirD2-mediatedrecognitionofanick(orgap)thatisfollowedbyligationofthe5'endoftheT-strandtothetargetDNA、The3'endoftheT-strandmovesalongthetarget,whiletheunwoundtargetDNAstrandisremovedbyexonucleolyticdigestion、Atthepositionwherethe3'endoftheT-strandisstabilizedbybase-pairing,theT-strandisligatedtothetarget、Atthesamepositionanickisintroducedinthesecondstrandofthetargetthatdefinestheleftbreak-pointoftargetdeletionandinitiatesthereplicationoftheT-strand、Symbolsusedforpresentationofputativerebinationeventsareexplainedunderneaththemodels、283、T-DNA整合得遺傳效應(yīng)T-DNA插入得遺傳特性:(1)T-DNA得插入不引起植物DNA大得重排。但多數(shù)插入會(huì)導(dǎo)致靶位點(diǎn)處小得缺失,缺失多至79個(gè)核苷酸。(2)另一個(gè)常見(jiàn)得結(jié)果就是,在T-DNA／植物DNA連接處,會(huì)有幾個(gè)至33個(gè)核苷酸得“填充”DNA(FillerDNA)存在,這些“填充”DNA得序列與靠近連接處得植物DNA序列相似。(3)在植物靶位處不要求有特異得序列,但若在T-DNA兩端和植物靶位處之間有一段短序列(5～10b)同源,則可以在整合中起作用。29五、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒得改造及載體構(gòu)建1、Ti質(zhì)粒得改造及卸甲載體構(gòu)建

2、中間載體/表達(dá)載體得構(gòu)建

3、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)得構(gòu)建301、Ti質(zhì)粒得改造及卸甲載體構(gòu)建

野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體,存在如下障礙:①Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大,一般在160～240kb,基因工程中難以操作;②大型得野生Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶得多個(gè)切點(diǎn),、、難以找到可利用得單一限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn),不能通過(guò)體外DNA重組技術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因;③T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因,其中onc基因產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素得平衡,轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤,阻礙細(xì)胞得分化和植株得再生;④Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制,即使得到重組質(zhì)粒,也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增;而農(nóng)桿菌得轉(zhuǎn)化率極低(10％左右),因此,通過(guò)Ti質(zhì)粒得體外操作,在常規(guī)分子克隆條件下幾乎不能構(gòu)建在T-DNA中只有單一切點(diǎn)得載體;⑤Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用得基因。

31為了使Ti質(zhì)粒成為有效得外源基因?qū)胼d體,必須對(duì)野生型Ti質(zhì)粒進(jìn)行一番科學(xué)得改造。十分幸運(yùn)得就是,大腸桿菌具有能與農(nóng)桿菌高效地接合轉(zhuǎn)移得特性。因此,科學(xué)家們可以先將T-DNA片段克隆到大腸桿菌得質(zhì)粒中,并插入外源基因,最后通過(guò)接合轉(zhuǎn)移把外源基因引入到農(nóng)桿茵得Ti質(zhì)粒上,這就是一種把預(yù)先進(jìn)行亞克隆、切除、插入或置換得T-DNA引入Ti質(zhì)粒得有效方法。帶有重組T-DNA得大腸桿菌質(zhì)粒衍生載體稱(chēng)為”中間載體”(intermediatevector),而接受中間載體得Ti質(zhì)粒則稱(chēng)為受體Ti質(zhì)粒(acceptorTip1asmid),一般就是卸甲載體(disarmedvector)。322、onc-卸甲載體所謂卸甲載體就就是無(wú)毒得(non-oncogenic)Ti質(zhì)粒載體。因?yàn)槔靡吧偷肨i質(zhì)粒作載體時(shí),影響植株再生得直接原因就是T-DNA中onc基因得致瘤作用。因此,為了使野生型得Ti質(zhì)粒成為基因轉(zhuǎn)化得載體,必須切除T-DNA上得onc基因,即“解除”其“

武裝”,構(gòu)建成所謂“卸甲”或稱(chēng)“繳械”載體(disarmedvector)。在這種onc-載體中,已經(jīng)缺失得T-DNA部位被大腸桿菌得一種常用得質(zhì)粒pBR322取代。這樣任何適合于克隆在

pBR322質(zhì)粒中得外源DNA片段,都可以通過(guò)與

pBR322質(zhì)粒DNA得同源重組,而被共整合到Onc-Ti質(zhì)粒載體上。33onc+卸甲載體

對(duì)于研究外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中得表達(dá),以及對(duì)于以改良農(nóng)作物為目得得植物基因工程而言,onc-體系就是最有用得。不過(guò),人們可能還要設(shè)計(jì)一些特殊得實(shí)驗(yàn)來(lái)研究外源基因在冠癭瘤組織中得表達(dá)問(wèn)題。在這種情況下,使用onc+菌株載體則比較合適。由于冠癭瘤組織具有不依賴(lài)于激素得表型特征,所以這種載體系統(tǒng)得優(yōu)點(diǎn)在于她可以快速地增生冠癭組織,比較快速而容易得到轉(zhuǎn)化體。342、中間載體得構(gòu)建(1)中間載體得基本結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)

為解決Ti質(zhì)粒不能直接導(dǎo)入目得基因得困難,構(gòu)建中間載體(intermediatevector)就是有效方法之一。中間載體就是一種在一個(gè)普通大腸桿菌得克隆載體(例如pBR322質(zhì)粒)中插入了一段合適得T-DNA片段,而構(gòu)成得小型質(zhì)粒。中間載體通常就是多拷貝得E、Coli小質(zhì)粒,這一點(diǎn)對(duì)于通過(guò)體外遺傳操作導(dǎo)入外源基因就是非常必要得。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)看可分為兩類(lèi)中間載體,即共整合系統(tǒng)中間載體和雙元載體系統(tǒng)中間載體。35共整合系統(tǒng)中間載體得特征①中間載體必須含有與Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)同源得序列,此外含有pBR得序列,在其被引入到根癌農(nóng)桿菌后即可高頻地與Ti質(zhì)粒得T-DNA得同源序列進(jìn)行重組;②她應(yīng)具有一個(gè)或幾個(gè)細(xì)菌選擇標(biāo)記,這將有利于篩選共整合質(zhì)粒;③她必須

有bom位點(diǎn),在有誘導(dǎo)質(zhì)粒存在得情況下,bom位點(diǎn)得存在可以使中間載體在不同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移;④她應(yīng)該含有陽(yáng)性植物選擇標(biāo)記,以利于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞得篩選,例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycinphosphotransferase,Npt-Ⅱ)基因,其可賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞卡那霉素抗性;⑤她應(yīng)該含有單一得限制性?xún)?nèi)切酶切點(diǎn),以利于外源基因得插入;⑥無(wú)Ti質(zhì)粒得邊界序列。36雙元載體系統(tǒng)得中間載體與共整合系統(tǒng)中間載體不同之處就是:①無(wú)同源序列;②具有LB和RB;③無(wú)Co1E1復(fù)制點(diǎn)

37(2)中間表達(dá)載體啟動(dòng)子及其她調(diào)控序列

轉(zhuǎn)錄得調(diào)控對(duì)真核生物基因表達(dá)起著關(guān)鍵性作用。就真核生物基因表達(dá)調(diào)控序列而言,大多數(shù)真核生物在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)得5′端上游區(qū)第30至25bp處具有TATA盒,在70至80bp處還有CAAT盒。在大多數(shù)真核生物基因得3′端具有AATAA序列。這些5′和3′端得調(diào)控序列對(duì)真核生物得基因表達(dá)起著關(guān)鍵性作用。Ti質(zhì)粒雖然來(lái)源于農(nóng)桿菌,但其N(xiāo)os、Ocs、Tmr等基因具有與真核生物啟動(dòng)子類(lèi)似得TATA盒和CAAT盒,均能在植物細(xì)胞中表達(dá),并且無(wú)組織特異性。因此,她們成為早期構(gòu)建嵌合基因得啟動(dòng)子,其中以Nos啟動(dòng)子(pNos)最常用。38393、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)得構(gòu)建(1)一元載體系統(tǒng)(2)雙元載體系統(tǒng)401、一元載體系統(tǒng)得構(gòu)建這一類(lèi)載體就是中間表達(dá)載體與改造后得受體Ti質(zhì)粒之間,通過(guò)同源重組所產(chǎn)生得一種復(fù)合型載體,通常亦稱(chēng)為共整合載體(co-intergratedvecter),又由于該載體得T-DNA區(qū)與Ti質(zhì)粒Vir區(qū)連鎖,因此又稱(chēng)之為順式載體(cis-vector)。一元載體得特點(diǎn)就是:①由兩個(gè)質(zhì)粒(E、coli質(zhì)粒和Ti質(zhì)粒)重組而成,分子量較大;②共合體得形成頻率與兩個(gè)質(zhì)粒得重組頻率有關(guān),相對(duì)較低;③必須用Southern雜交或PCR對(duì)大得共整合體質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè);④構(gòu)建時(shí)比較困難。一元載體系統(tǒng)目前主要有兩種載體:共整合載體和拼接未端載體(split-endvector,SEV)。

41(1)共整合載體得構(gòu)建共整合載體得特點(diǎn)就是:①中間表達(dá)載體與受體Ti卸甲載體,通過(guò)同源重組共整合而構(gòu)建;②中間表達(dá)載體與受體Ti質(zhì)粒之間同源序列就是pBR322。共整合載體得構(gòu)建過(guò)程

l)中間載體pLGV1103導(dǎo)入農(nóng)桿菌:目前通常采用兩種方法,即接合轉(zhuǎn)移法(conjugativetransfer)和三親雜交轉(zhuǎn)移法。

2)中間載體與受體Ti質(zhì)粒得同源重組。

3)共整合載體得選擇。

42共整合轉(zhuǎn)化程序(2)

SEV得構(gòu)建SEV系統(tǒng)即T-DNA邊界拼接系統(tǒng),亦稱(chēng)拼接末端載體(sp1it-endvecter,SEV)。她就是由Freley等人于1985年建立得另一種共整合載體,也因?yàn)樗脙蓚€(gè)LIH序列在同源重組前分別處于不同質(zhì)粒上而得名。SEV與pGV3850得差異及構(gòu)建過(guò)程如下述:1)SEV得受體Ti質(zhì)粒得T-DNA上得致瘤基因(onc)及TR都已被缺失,T-DNA得保留部分被稱(chēng)為“左邊界內(nèi)部同源區(qū)”(1eftinsidehomcology,LIH)。該受體Ti質(zhì)粒還保留了Vir基因及其她正常得功能基因,同時(shí)還攜有用于細(xì)菌篩選得抗性基因。2)SEV中間載體具有一個(gè)細(xì)菌得抗性基因,一個(gè)植物抗性基因及與受體Ti質(zhì)粒同源得LIH序列及TR。3)通過(guò)三親雜交將中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌后,由于她們之間都具有LIH同源序列,即可發(fā)生同源重組,形成SEV得共整合載體。

44(3)

SEV與pGV3850比較

兩者都就是通過(guò)受體Ti質(zhì)粒與中間載體同源重組而形成,故同屬于共整合得一元載體系統(tǒng),但她們之間有著一定得差異:1)她們得受體Ti質(zhì)粒與中間載體得結(jié)構(gòu)不同。pGV3850得左右邊界在一個(gè)受體T