高中生物2015-2024年10年高考真題專題分類匯編-專題22基因工程考點(diǎn)1重組dna技術(shù)的基本工具

第第頁專題22基因工程考點(diǎn)1重組DNA技術(shù)的基本工具(2024湖南，5，2分)某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶酶切時(shí)，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.限制酶失活，更換新的限制酶B.酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等C.質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識(shí)別位點(diǎn)缺失，更換正常質(zhì)粒DNAD.酶切位點(diǎn)被甲基化修飾，換用對(duì)DNA甲基化不敏感的限制酶【答案】B限制酶失活會(huì)使DNA完全不被酶切，此時(shí)應(yīng)更換新的限制酶，A正確；酶切條件不合適通常會(huì)使切割效果下降，此時(shí)應(yīng)有部分DNA被酶切，B錯(cuò)誤；質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致限制酶識(shí)別位點(diǎn)缺失，會(huì)造成限制酶無法進(jìn)行切割，因此應(yīng)更換為正常質(zhì)粒DNA，C正確；質(zhì)粒DNA上酶切位點(diǎn)被甲基化修飾，會(huì)導(dǎo)致對(duì)DNA甲基化敏感的限制酶無法進(jìn)行酶切，此時(shí)應(yīng)換用對(duì)DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。(2023重慶，12，3分)某小組通過PCR[假設(shè)引物長度為8個(gè)堿基(短于實(shí)際長度)]獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(如圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.其中一個(gè)引物序列為5'-TGCGCAGT-3'B.步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步驟①的酶對(duì)載體進(jìn)行酶切，至少獲得了2個(gè)片段D.酶切片段和載體連接時(shí)，可使用E.coli連接酶或T4連接酶【答案】B由于引物只能引導(dǎo)子鏈從5'到3'合成，分析圖中擴(kuò)增獲得的DNA片段可知，其中一個(gè)引物序列為5'-TGCGCAGT-3'，A正確；根據(jù)三種限制酶的識(shí)別序列和酶切后的DNA片段左右側(cè)的黏性末端可知，步驟①所用的酶是NheⅠ和CfoⅠ，B錯(cuò)誤；用步驟①的兩種酶對(duì)載體進(jìn)行酶切，至少切斷2處，切割之后至少獲得了2個(gè)片段，C正確；圖中形成的是黏性末端，E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端，T4DNA連接酶對(duì)平末端和黏性末端均可連接，D正確。(2023新課標(biāo)，6，6分)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是 ()A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接【答案】C酶4切割位點(diǎn)位于抗生素抗性基因(標(biāo)記基因)內(nèi)部，酶切后會(huì)破壞標(biāo)記基因，D不符合題意；酶3切割后產(chǎn)生平末端，E.coliDNA連接酶僅能連接黏性末端，故E.coliDNA連接酶無法連接酶3切割產(chǎn)生的平末端，A不符合題意；若用酶3切割質(zhì)粒、酶1切割目的基因，兩者產(chǎn)生的末端無法連接在一起，B不符合題意；酶1和酶2切割后產(chǎn)生不同的黏性末端，T4DNA連接酶既可連接黏性末端，也可連接平末端，若用酶1和酶2同時(shí)切割質(zhì)粒和目的基因，并用T4DNA連接酶連接，則既可避免質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化，又能保證目的基因正確插入質(zhì)粒，C符合題意。(2022遼寧，12，2分)抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12-5是我國自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品種。為給監(jiān)管轉(zhuǎn)基因生物安全提供依據(jù)，采用PCR方法進(jìn)行目的基因監(jiān)測，反應(yīng)程序如圖所示。下列敘述正確的是()A.預(yù)變性過程可促進(jìn)模板DNA邊解旋邊復(fù)制B.后延伸過程可使目的基因的擴(kuò)增更加充分C.延伸過程無需引物參與即可完成半保留復(fù)制D.轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測含有目的基因后即可上市【答案】B94℃預(yù)變性可使模板DNA解旋為單鏈，72℃延伸過程中才會(huì)使4種脫氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的催化作用下合成子鏈，A錯(cuò)誤；72℃，1min的后延伸過程可使目的基因的擴(kuò)增更充分，B正確；由于TaqDNA聚合酶只能催化單個(gè)的脫氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端，不能從頭合成DNA，故延伸過程中需要引物參與，C錯(cuò)誤；為防基因污染，確保安全，我國制定了相關(guān)法規(guī)和政策進(jìn)行依法監(jiān)管，轉(zhuǎn)基因品種需經(jīng)國家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會(huì)(評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu))評(píng)價(jià)安全后才可推廣上市，D錯(cuò)誤。(2021浙江6月選考，20，2分)采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因定點(diǎn)插入受精卵的Y染色體上，獲得轉(zhuǎn)基因雄性小鼠。該轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型雌性小鼠交配，通過觀察熒光可確定早期胚胎的性別。下列操作錯(cuò)誤的是()A.基因編輯處理的受精卵在體外培養(yǎng)時(shí)，不同發(fā)育階段的胚胎需用不同成分的培養(yǎng)液B.基因編輯處理的受精卵經(jīng)體外培養(yǎng)至2細(xì)胞期，須將其植入同期發(fā)情小鼠的子宮，才可獲得表達(dá)EGFP的小鼠C.分離能表達(dá)EGFP的胚胎干細(xì)胞，通過核移植等技術(shù)可獲得大量的轉(zhuǎn)基因小鼠D.通過觀察早期胚胎的熒光，能表達(dá)EGFP的即為雄性小鼠胚胎【答案】B受精卵在體外培養(yǎng)時(shí)，由于不同發(fā)育階段的胚胎細(xì)胞所需的環(huán)境有所不同，因此需要更換不同成分的培養(yǎng)液，A正確；進(jìn)行胚胎移植的早期胚胎通常為發(fā)育到8細(xì)胞以上的胚胎，如早期囊胚，B錯(cuò)誤；利用胚胎干細(xì)胞通過核移植等技術(shù)來獲得轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎，再通過胚胎移植技術(shù)大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小鼠，C正確；根據(jù)題干信息可知，EGFP基因被定點(diǎn)插入Y染色體上，而Y染色體只有雄性才具有，因而觀察早期胚胎的熒光，能表達(dá)EGFP的即為雄性小鼠胚胎，D正確。(2021遼寧，14，2分)腈水合酶(N0)廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)和醫(yī)藥原料生產(chǎn)等領(lǐng)域，但不耐高溫，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩(wěn)定的融合型腈水合酶(N1)。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A.N1與N0氨基酸序列的差異是影響其熱穩(wěn)定性的原因之一B.加入連接肽需要通過改造基因?qū)崿F(xiàn)C.獲得N1的過程需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯D.檢測N1的活性時(shí)先將N1與底物充分混合，再置于高溫環(huán)境【答案】D根據(jù)題意可知，與N0相比，N1多了一段連接肽，二者氨基酸序列的差異是影響其熱穩(wěn)定性的原因之一，A正確；利用蛋白質(zhì)工程改造蛋白質(zhì)時(shí)需對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行修飾或合成，在N0的結(jié)構(gòu)中加入連接肽需要通過改造相關(guān)基因來實(shí)現(xiàn)，B正確；獲得N1的過程需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，C正確；檢測N1的活性時(shí)，需要先將N1與底物置于高溫環(huán)境下，再將N1與底物充分混合，D錯(cuò)誤。(2021湖北，7，2分)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ識(shí)別并切割雙鏈DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對(duì))約為()A.6B.250C.4000D.24000【答案】C根據(jù)題干信息可知，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的識(shí)別位點(diǎn)是由6個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成的，若用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，則理論上得到DNA的的平均長度(堿基對(duì))約為46堿基對(duì)，即約為4000堿基對(duì)。故選C。(2021湖北，16，2分)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對(duì))外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是()A.增加模板DNA的量B.延長熱變性的時(shí)間C.延長延伸的時(shí)間D.提高復(fù)性的溫度【答案】DPCR反應(yīng)中出現(xiàn)非特異性條帶的主要原因是引物與模板DNA出現(xiàn)了非特異性結(jié)合，模板DNA不純或過多易出現(xiàn)非特異性結(jié)合，A錯(cuò)誤；延長熱變性時(shí)間與非特異性條帶無直接關(guān)系，B錯(cuò)誤；延長延伸時(shí)間易出現(xiàn)非特異性結(jié)合，C錯(cuò)誤；復(fù)性溫度偏低易出現(xiàn)非特異性結(jié)合，故提高復(fù)性溫度可減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，D正確。(2021山東，4，2分)我國考古學(xué)家利用現(xiàn)代人的DNA序列設(shè)計(jì)并合成了一種類似磁鐵的“引子”，成功將極其微量的古人類DNA從提取自土壤沉積物的多種生物的DNA中識(shí)別并分離出來，用于研究人類起源及進(jìn)化。下列說法正確的是()A.“引子”的徹底水解產(chǎn)物有兩種B.設(shè)計(jì)“引子”的DNA序列信息只能來自核DNAC.設(shè)計(jì)“引子”前不需要知道古人類的DNA序列D.土壤沉積物中的古人類雙鏈DNA可直接與“引子”結(jié)合從而被識(shí)別【答案】C根據(jù)題意，“引子”是利用現(xiàn)代人的DNA序列設(shè)計(jì)并合成的，其本質(zhì)是DNA或RNA，DNA的徹底水解產(chǎn)物有磷酸基團(tuán)、脫氧核糖、四種堿基，RNA的徹底水解產(chǎn)物有磷酸基因、核糖、四種堿基，A錯(cuò)誤；人的細(xì)胞核、線粒體中均有DNA，故設(shè)計(jì)“引子”的DNA序列信息可以來自核DNA和線粒體DNA，B錯(cuò)誤；設(shè)計(jì)“引子”前不需要知道古人類的DNA序列，“引子”是利用現(xiàn)代人的DNA序列設(shè)計(jì)的，C正確；雙鏈DNA解旋成單鏈后才能與“引子”序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而被識(shí)別，D錯(cuò)誤。(2020山東，15，2分)新型冠狀病毒的檢測方法目前主要有核酸檢測法和抗體檢測法。下列說法錯(cuò)誤的是()A.抗體檢測法利用了抗原與抗體特異性結(jié)合的原理B.感染早期，會(huì)出現(xiàn)能檢測出核酸而檢測不出抗體的情況C.患者康復(fù)后，會(huì)出現(xiàn)能檢測出抗體而檢測不出核酸的情況D.感染該病毒但無癥狀者，因其體內(nèi)不能產(chǎn)生抗體不適用抗體檢測法檢測【答案】D抗體檢測法利用了抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，A正確；感染早期，新冠病毒的核酸已進(jìn)入機(jī)體，但機(jī)體可能尚未進(jìn)行體液免疫產(chǎn)生抗體，會(huì)出現(xiàn)能檢測出核酸而檢測不出抗體的情況，B正確；患者康復(fù)后，體內(nèi)留有記憶細(xì)胞和抗體，而新冠病毒已被機(jī)體清除，會(huì)出現(xiàn)能檢測出抗體而檢測不出核酸的情況，C正確；感染該病毒但無癥狀者，其體內(nèi)會(huì)發(fā)生體液免疫產(chǎn)生抗體，適用抗體檢測法檢測，D錯(cuò)誤。(2020浙江7月選考，24，2分)下列關(guān)于基因工程的敘述，正確的是()A.若受體大腸桿菌含有構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)用到的限制性核酸內(nèi)切酶，則一定有利于該重組質(zhì)粒進(jìn)入受體并保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定B.抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某抗鹽植物獲得2個(gè)穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽。表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入無關(guān)C.抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某植物獲得轉(zhuǎn)基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達(dá)了抗性蛋白而后者只表達(dá)抗性基因RNAD.已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶。用某種限制性核酸內(nèi)切酶完全酶切環(huán)狀質(zhì)粒后，出現(xiàn)3條帶。表明該質(zhì)粒上一定至少有3個(gè)被該酶切開的位置【答案】D若受體大腸桿菌含有構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)用到的限制酶，該酶會(huì)破壞重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，不利于重組質(zhì)粒在受體中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，A錯(cuò)誤；抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某抗鹽植物獲得的2個(gè)穩(wěn)定遺傳品系中有抗除草劑不抗鹽的品系，抗鹽性的改變可能與抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入有關(guān)，B錯(cuò)誤；在DNA檢測均含目的基因的條件下，抗性鑒定為抗除草劑說明目的基因完成了表達(dá)，抗性鑒定為不抗除草劑說明目的基因可能完成了轉(zhuǎn)錄而沒有翻譯成蛋白質(zhì)，還有可能是目的基因沒有轉(zhuǎn)錄，C錯(cuò)誤；因?yàn)橘|(zhì)粒為環(huán)形，用某限制酶完全酶切后出現(xiàn)3條帶，說明酶切后的產(chǎn)物中有3種不同分子量的DNA，可以推測出質(zhì)粒上至少有3個(gè)位置被該酶切開，D正確。(2018北京理綜，5，6分)用XhoⅠ和SalⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別處理同一DNA片段，酶切位點(diǎn)及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖。以下敘述不正確的是()圖1酶切位點(diǎn)圖圖2電泳結(jié)果示意圖A.圖1中兩種酶識(shí)別的核苷酸序列不同B.圖2中酶切產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNAC.泳道①中是用SalⅠ處理得到的酶切產(chǎn)物D.圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA【答案】D本題通過對(duì)酶切位點(diǎn)圖和電泳結(jié)果示意圖的分析，考查基因工程工具酶的相關(guān)知識(shí)，以及觀察圖示、分析推理的能力，試題通過兩種圖示的分析體現(xiàn)了對(duì)科學(xué)思維素養(yǎng)中的演繹與推理要素的考查。圖1中，兩種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)不同，說明兩種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的核苷酸序列不同，A正確。圖2中，兩種酶的酶切產(chǎn)物都為DNA片段，都可用于構(gòu)建重組DNA，B正確。結(jié)合圖1的酶切位點(diǎn)圖，判斷兩種酶切DNA后得到的DNA片段數(shù)；再結(jié)合泳道①②電泳結(jié)果知，泳道①是用SalⅠ處理得到的酶切產(chǎn)物，C正確。能被限制性核酸內(nèi)切酶酶切的DNA片段仍為雙鏈DNA，D錯(cuò)誤。(2017北京理綜，5，6分)為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1)，擬將其與質(zhì)粒(圖2)重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖?)A.用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞D.用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上【答案】C本題主要考查基因工程的相關(guān)知識(shí)。由于C基因兩端及質(zhì)粒上均存在限制酶EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，因此，可采用限制酶EcoRⅠ和DNA連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒；用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織(即農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法)，可以將C基因?qū)爰?xì)胞；由于質(zhì)粒上存在潮霉素抗性基因(標(biāo)記基因)，因此，可以在培養(yǎng)基中添加潮霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞，C符合題意；可用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上。[2022福建，21(一)]美西螈具有很強(qiáng)的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬細(xì)胞在斷肢再生的早期起重要作用。為研究巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制，科研人員制備了抗巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白CD14的單克隆抗體，具體方法如下?；卮鹣铝袉栴}:(一)基因工程抗原的制備(1)根據(jù)美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR擴(kuò)增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3'-OH與加入的脫氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯鍵，則新合成鏈的延伸方向是(填“5'→3'”或“3'→5'”)。

(2)載體和CD14片段的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序列如圖1所示。用XhoⅠ和SalⅠ分別酶切CD14和載體后連接，CD14接入載體時(shí)會(huì)形成正向連接和反向連接的兩種重組DNA。可進(jìn)一步用這兩種限制酶對(duì)CD14的連接方向進(jìn)行鑒定，理由是。

(3)培養(yǎng)能表達(dá)CD14蛋白的大腸桿菌，分離純化目的蛋白。

【答案】(一)(1)5'→3'(2)正向連接的重組DNA有這兩種酶切位點(diǎn)(限制酶的識(shí)別序列)；而反向連接的重組DNA會(huì)形成新的序列，沒有這兩種酶的酶切位點(diǎn)(沒有限制酶的識(shí)別序列)解析(一)(1)PCR擴(kuò)增過程中，引物鏈的延伸方向?yàn)?'→3'。(2)兩種酶雖然能切出相同的黏性末端，但正向連接的重組DNA，限制酶的識(shí)別序列沒有變，仍能用原來的兩種酶進(jìn)行酶切；反向連接的重組DNA，不存在XhoⅠ和SalⅠ兩種限制酶的識(shí)別序列，無法再進(jìn)行酶切。(2021全國乙，38，15分)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)如圖所示。回答下列問題:(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。

(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是。

(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能；質(zhì)粒DNA分子上有，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是。

(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指。

【答案】(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ(2)磷酸二酯鍵(3)自我復(fù)制限制酶切割位點(diǎn)將待篩選的宿主細(xì)胞接種到含該抗生素的培養(yǎng)基中，能夠生長的是含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞(4)RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA片段解析(1)E.coliDNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端連接起來。T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。(2)DNA連接酶是通過催化兩個(gè)核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，將雙鏈DNA片段“縫合”起來的。(3)作為載體，質(zhì)粒DNA分子上必須有復(fù)制原點(diǎn)，才能使質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能進(jìn)行自我復(fù)制；且質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因，可以用添加特定抗生素的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的宿主細(xì)胞，以達(dá)到篩選目的。(4)啟動(dòng)子是指RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA片段。(2021全國甲，38，15分)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進(jìn)行了相關(guān)操作:①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴(kuò)增DNA片段；④采集病人組織樣本?；卮鹣铝袉栴}:(1)若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是(用數(shù)字序號(hào)表示)。

(2)操作③中使用的酶是。PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、三步，其中復(fù)性的結(jié)果是

。

(3)為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與特異性結(jié)合。

(4)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是指。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。

【答案】(1)④②③①(2)DNA聚合酶延伸引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與單鏈DNA結(jié)合(3)病原菌DNA(4)在生物體外大量快速擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)解析(1)根據(jù)題干中給出的信息分析，若要檢測病人是否感染了某種病原菌，需要從病人體內(nèi)獲取組織樣本，提取樣本中的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再分析PCR擴(kuò)增的結(jié)果。由此可知若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是④②③①。(2)操作③利用PCR擴(kuò)增DNA片段時(shí)需要使用的酶是(耐高溫的)DNA聚合酶，即TaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步，其中復(fù)性是指溫度下降到55~60℃，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。(3)為了做出正確的診斷，應(yīng)檢測病原菌的遺傳物質(zhì)，所以PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與病原菌DNA特異性結(jié)合。(4)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是指在生物體外大量快速擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。(2021山東，25，12分)人類γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變該結(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。(1)為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖可知，在F1~F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是，在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是。本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程共需要種酶。

(2)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是。

(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1~F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于，理由是

。

【答案】(1)SalⅠEcoRⅠ6(2)F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基因不表達(dá)(3)引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上根據(jù)有無熒光情況判斷，F(xiàn)1~F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點(diǎn)，因此結(jié)合位點(diǎn)位于F4所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的下游(右側(cè))；F5~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均無結(jié)合位點(diǎn)，可知結(jié)合位點(diǎn)位于F5所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的上游(左側(cè))，所以結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上解析(1)觀察圖示可知，熒光蛋白基因的左側(cè)為終止子，為了將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，擴(kuò)增后的產(chǎn)物的插入點(diǎn)應(yīng)在熒光蛋白基因的右側(cè)，而熒光蛋白基因的右側(cè)有三個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，分別是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ的切割位點(diǎn)，但因?yàn)橛肊coRⅠ會(huì)破壞熒光蛋白基因，所以只能用MunⅠ和XhoⅠ切割載體，切割后載體的部分序列如圖所示:擴(kuò)增后的產(chǎn)物的兩端添加限制酶后得到的DNA片段能夠替換上圖載體中位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位點(diǎn)之間的片段，并能與左側(cè)的熒光蛋白基因片段及右側(cè)的片段連接起來。由題圖中終止子及基因的位置可知，F(xiàn)1~F7末端添加序列后應(yīng)與XhoⅠ切割的末端相連，R末端添加序列后應(yīng)與MunⅠ切割的末端相連。由于調(diào)控序列及啟動(dòng)子中有XhoⅠ限制酶切割位點(diǎn)，所以需尋找切割后的末端能與XhoⅠ限制酶切割后的末端連接且調(diào)控序列及啟動(dòng)子中無其切割位點(diǎn)的限制酶，SalⅠ符合這一要求，所以在F1~F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是SalⅠ；由于調(diào)控序列及啟動(dòng)子中含有MunⅠ的切割位點(diǎn)，所以需尋找切割后的末端能與MunⅠ限制酶切割后的末端連接且調(diào)控序列及啟動(dòng)子中無其切割位點(diǎn)的限制酶，EcoRⅠ符合這一要求，所以在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是EcoRⅠ。擴(kuò)增后的產(chǎn)物的兩端添加的限制酶識(shí)別序列如圖所示:本實(shí)驗(yàn)中，用EcoRⅠ和SalⅠ切割擴(kuò)增產(chǎn)物，用MunⅠ和XhoⅠ切割載體，故從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程需要Taq酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ、DNA連接酶共6種酶。(2)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，說明F1~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基因表達(dá)；含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光，說明F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基因不表達(dá)。(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，雌激素能誘導(dǎo)P發(fā)揮作用，使BCL11A基因表達(dá)。構(gòu)建的載體含有BCL11A基因，導(dǎo)入構(gòu)建載體的受體細(xì)胞能合成BCL11A蛋白。含F(xiàn)1~F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，說明F1~F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)(調(diào)控啟動(dòng)子，熒光蛋白基因不表達(dá))，因此結(jié)合位點(diǎn)位于F4所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的下游(右側(cè))；而含F(xiàn)5~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光，說明F5~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均無BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)(熒光蛋白基因能表達(dá))，由此可知結(jié)合位點(diǎn)位于F5所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的上游(左側(cè))，所以結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上。(2019課標(biāo)全國Ⅰ，38，15分)基因工程中可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因?；卮鹣铝袉栴}。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得?；蛭膸彀ê汀?/p>

(2)生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí)，解開DNA雙鏈的酶是。在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是。上述兩個(gè)解鏈過程的共同點(diǎn)是破壞了DNA雙鏈分子中的。

(3)目前在PCR反應(yīng)中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是。

【答案】(1)基因組文庫cDNA文庫(2)解旋酶加熱至90~95℃氫鍵(3)Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會(huì)失活解析本題借助目的基因的獲取考查基因工程中的PCR技術(shù)以及考生對(duì)生物學(xué)問題進(jìn)行科學(xué)解釋的能力；試題通過PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的比較，體現(xiàn)了對(duì)科學(xué)思維中歸納與概括要素的考查。(1)基因文庫包括基因組文庫和cDNA文庫。(2)體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，需用解旋酶打開氫鍵使雙鏈DNA解旋，而PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，是借助高溫加熱至90~95℃使DNA變性解旋。(3)PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成時(shí)，溫度需控制在70~75℃，則應(yīng)使用耐高溫的DNA聚合酶，即Taq酶，而不能使用大腸桿菌DNA聚合酶(高溫下會(huì)失活)。(2018課標(biāo)全國Ⅰ，38，15分)回答下列問題:(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。該研究除證明了質(zhì)?？梢宰鳛檩d體外，還證明了

(答出兩點(diǎn)即可)。

(2)體外重組的質(zhì)?？赏ㄟ^Ca2+參與的方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在細(xì)菌、心肌細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中，可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是。

(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會(huì)被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加的抑制劑。

【答案】(1)體外重組的質(zhì)粒可以進(jìn)入受體細(xì)胞；真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)(2)轉(zhuǎn)化外殼蛋白(或答噬菌體蛋白)細(xì)菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶解析本題主要考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，試題通過三問并列的命題方式考查基因工程的原理與操作程序，考查考生的識(shí)記、理解能力，涉及科學(xué)思維素養(yǎng)中歸納與概括、演繹與推理等思維過程。本題主要考查基因工程的相關(guān)知識(shí)。(1)體外重組的質(zhì)?？梢赃M(jìn)入受體細(xì)胞，且重組質(zhì)粒在不同細(xì)胞中能正常表達(dá)，說明目的基因在不同細(xì)胞中的表達(dá)機(jī)制相同，生物界共用一套遺傳密碼。(2)基因工程中，受體細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞時(shí)，常用Ca2+處理大腸桿菌，使之處于感受態(tài)，即Ca2+參與的轉(zhuǎn)化法。噬菌體DNA與外殼蛋白組裝成完整噬菌體。因噬菌體的宿主是細(xì)菌，故只有細(xì)菌可作為重組噬菌體的宿主細(xì)胞。(3)為防止目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)被破壞，可選用不能合成蛋白酶的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化過程中加入蛋白酶的抑制劑可以保護(hù)蛋白質(zhì)不被水解。[2018浙江4月選考，32(二)，7分]回答與基因工程和植物克隆有關(guān)的問題:(1)將含某抗蟲基因的載體和含卡那霉素抗性基因的載體pBI121均用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切，在切口處形成。選取含抗蟲基因的DNA片段與切割后的pBI121用DNA連接酶連接，在兩個(gè)片段相鄰處形成，獲得重組質(zhì)粒。

(2)已知用CaCl2處理細(xì)菌，會(huì)改變其某些生理狀態(tài)。取CaCl2處理過的農(nóng)桿菌與重組質(zhì)粒在離心管內(nèi)進(jìn)行混合等操作，使重組質(zhì)粒進(jìn)入農(nóng)桿菌，完成實(shí)驗(yàn)。在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于搖床慢速培養(yǎng)一段時(shí)間，其目的是，從而表達(dá)卡那霉素抗性基因，并大量增殖。

(3)取田間不同品種水稻的幼胚，先進(jìn)行，然后接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼胚發(fā)生形成愈傷組織，并進(jìn)行繼代培養(yǎng)。用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染愈傷組織，再培養(yǎng)愈傷組織，以便獲得抗蟲的轉(zhuǎn)基因水稻。影響愈傷組織能否成功再生出植株的因素有:培養(yǎng)條件如光溫、培養(yǎng)基配方如植物激素配比以及。(答出2點(diǎn)即可)。

【答案】(1)粘性末端磷酸二酯鍵(2)轉(zhuǎn)化使CaCl2處理過的農(nóng)桿菌恢復(fù)細(xì)胞的正常狀態(tài)(3)消毒脫分化水稻的基因型、愈傷組織繼代的次數(shù)解析(1)用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切含某抗蟲基因的載體和含卡那霉素抗性基因的載體PBⅠ121，可在切口處形成粘(黏)性末端，通過DNA連接酶連接，在兩個(gè)片段相鄰處形成磷酸二酯鍵，從而獲得重組質(zhì)粒。(2)經(jīng)CaCl2處理過的農(nóng)桿菌，成為感受態(tài)細(xì)胞，與重組質(zhì)?；旌?，使重組質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞，從而完成轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。將其置于搖床慢速培養(yǎng)一段時(shí)間，目的是使經(jīng)CaCl2處理過的農(nóng)桿菌恢復(fù)細(xì)胞的正常狀態(tài)，從而表達(dá)卡那霉素抗性基因，并大量增殖。(3)田間獲取的水稻幼胚，需要先進(jìn)行消毒處理，后接種培養(yǎng)，經(jīng)脫分化形成愈傷組織，并進(jìn)行繼代培養(yǎng)。影響愈傷組織能否再生出植株的因素，除了培養(yǎng)條件，還有水稻本身的基因型這一內(nèi)因，也跟繼代培養(yǎng)次數(shù)有關(guān)。易錯(cuò)警示影響愈傷組織再生出植株的因素，題干中給出了外界培養(yǎng)條件，所以應(yīng)從內(nèi)因考慮。同時(shí)，一些植物在多次繼代培養(yǎng)后也會(huì)喪失細(xì)胞全能性的表達(dá)能力，所以也跟繼代培養(yǎng)次數(shù)有關(guān)。(2017課標(biāo)全國Ⅰ，38，15分)真核生物基因中通常有內(nèi)含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列的機(jī)制。已知在人體中基因A(有內(nèi)含子)可以表達(dá)出某種特定蛋白(簡稱蛋白A)?；卮鹣铝袉栴}:(1)某同學(xué)從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細(xì)胞卻未得到蛋白A，其原因是。

(2)若用家蠶作為表達(dá)基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用作為載體，其原因是。

(3)若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。因?yàn)榕c家蠶相比，大腸桿菌具有(答出兩點(diǎn)即可)等優(yōu)點(diǎn)。

(4)若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測物質(zhì)是(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。

(5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)為證明DNA是遺傳物質(zhì)做出了重要貢獻(xiàn)，也可以說是基因工程的先導(dǎo)，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是。

【答案】(1)基因A有內(nèi)含子，在大腸桿菌中，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列不能被切除，無法表達(dá)出蛋白A(2)噬菌體噬菌體的宿主是細(xì)菌，而不是家蠶(3)繁殖快、容易培養(yǎng)(4)蛋白A的抗體(5)DNA可以從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體解析本題主要涉及基因文庫與cDNA文庫的差異、基因工程的步驟、基因工程產(chǎn)物的檢測方法等知識(shí)，意在考查考生提取知識(shí)、分析和歸納知識(shí)的能力。(1)真核生物和原核生物的基因結(jié)構(gòu)不同，真核生物的基因中存在內(nèi)含子等不能編碼蛋白質(zhì)的序列，原核生物的基因中不存在內(nèi)含子。真核生物在基因表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)錄出的RNA需要將內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列切除后才可進(jìn)行翻譯。從人的基因組文庫中獲得的基因A中含有內(nèi)含子，而作為原核生物的大腸桿菌不能切除內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列，故基因A在大腸桿菌中無法表達(dá)出蛋白A。(2)病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染具有特異性，噬菌體是專門侵染細(xì)菌的病毒，不能侵染家蠶細(xì)胞，故可選用可感染家蠶的昆蟲病毒作為載體。(3)與真核生物相比，大腸桿菌等原核生物具有繁殖快、容易培養(yǎng)、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等優(yōu)點(diǎn)，因此在基因工程中常用原核生物作為受體細(xì)胞。(4)檢測基因A是否翻譯出蛋白A，一般用抗原—抗體雜交的方法，即用蛋白A的抗體與從細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行雜交，觀察是否出現(xiàn)雜交帶。(5)肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的實(shí)質(zhì)是S型菌的DNA進(jìn)入R型菌體內(nèi)，并可在R型菌體內(nèi)完成表達(dá)，這證明了DNA可以從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體，為基因工程奠定了理論基礎(chǔ)。(2017課標(biāo)全國Ⅱ，38，15分)幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，幾丁質(zhì)酶可催化幾丁質(zhì)水解。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，可增強(qiáng)其抗真菌病的能力?；卮鹣铝袉栴}:(1)在進(jìn)行基因工程操作時(shí)，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選