廣西《觀賞石斛雜交育種技術規(guī)程》編制說明

PAGEPAGE1廣西地方標準《觀賞石斛雜交育種技術規(guī)程》（征求意見稿）編制說明1標準任務來源《觀賞石斛雜交育種技術規(guī)程》是由廣西壯族自治區(qū)質量技術監(jiān)督局批準下達《關于下達2017年第六批廣西地方標準制定（修訂）項目計劃的通知》（桂質監(jiān)函〔2017〕242號）,廣西壯族自治區(qū)林業(yè)廳提出的2017年第六批廣西地方標準制定（修訂）計劃項目，合同編號為2017-0607，起止年限為2017年7月-2018年12月，項目承擔單位為廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院。2目的和意義石斛為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)草本植物,既具有藥用價值也具有觀賞價值。石斛蘭由于其花形花姿優(yōu)美、艷麗多彩、種類繁多、花期長,深受各國人民喜愛和關注,在國際花卉市場上占有重要的地位,與卡特蘭、蝴蝶蘭、萬代蘭并列為觀賞價值最高的四大觀賞洋蘭。廣西石斛屬植物資源豐富，是我國重要的石斛原生種分布區(qū)域。前期，我們依托廣西自然基金項目“石斛種間雜交親和性及雜種胚培養(yǎng)技術研究”、廣西林業(yè)科技項目“廣西特色花卉品種選育關鍵技術研究與示范”以及廣西重點研究發(fā)計劃項目“觀賞石斛新品種選育及花期調控技術研究”，開展了觀賞石斛育種技術研究，獲得了幾個個雜交子代成苗，并針對雜交子代進行了特異性、一致性和穩(wěn)定性測試，獲得了6個觀賞石斛新品種，形成了一套觀賞石斛育種技術。充分利用我區(qū)和東盟國家豐富的石斛種質資源，開展觀賞石斛育種研究，探索出適合我區(qū)的觀賞石斛育種技術體系，制定觀賞石斛雜交育種技術規(guī)程，對于規(guī)范觀賞石斛雜交育種技術，縮短育種時間，獲得具有自主知識產權的觀賞石斛新品種，提高我區(qū)花卉產業(yè)發(fā)展的科技含量，具有重要的意義。承擔單位在石斛蘭育種研究方面具有扎實的基礎，開展地方標準“觀賞石斛雜交育種技術規(guī)程”的編制工作，不僅能夠確保標準具有科學性、先進性和實用性，而且為本標準的進一步推廣應用奠定了基礎。3國內外標準對比情況石斛蘭最早是海南省90年代從泰國引種栽培，目前僅見2009年海南省樂東農業(yè)開發(fā)有限公司和三亞柏盈熱帶蘭花產業(yè)有限公司起草制定的“石斛蘭栽培技術規(guī)程”和“石斛蘭、文心蘭組培苗繁育技術規(guī)程”。隨著石斛蘭在國內的發(fā)展，2014年北京溫榆河花卉有限公司和北京市大東流苗圃制定發(fā)布了“盆栽春石斛蘭栽培技術規(guī)程”，2018年廣西林業(yè)科學研究院制定發(fā)布了“石斛蘭組培快繁技術規(guī)程”，這些標準主要針對組織培養(yǎng)和栽培方面制定。有關育種方面，2015年上海市農業(yè)科學院農業(yè)部植物新品種測試（上海）分中心等單位主要針對石斛屬DUS判定，聯(lián)合制定發(fā)布了“植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南石斛屬”；2016年貴州師范大學和貴州億龍生物科技有限公司主要針對藥用石斛聯(lián)合制定發(fā)布了林業(yè)行業(yè)標準“鐵皮石斛雜交育種技術法規(guī)程”，有關觀賞石斛雜交育種技術標準尚未見發(fā)布。制定觀賞石斛雜交育種技術規(guī)程，有利于填補現(xiàn)有石斛蘭育種標準的空白。4標準編寫的原則和依據(jù)本標準制定以推進廣西觀賞石斛雜交育種技術的標準化，培育具有地方特色的優(yōu)良觀賞石斛新品種為目標，遵循科學性、先進性、合理性和適用性的原則，力求做到科學規(guī)范、指標準確、可操作性強，既與國家相關標準接軌，又符合廣西區(qū)情，對觀賞石斛育種科研和生產有積極的推動作用。本標準按照中華人民共和國國家標準GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。5工作簡況5.1標準起草承擔單位廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院5.2標準主要起草人龔建英、王華新、唐慶、汪小玉、陳寶玲、龍定建、蒙芳、桂雪萍、潘文、唐遒冥、吳玉華、李華、劉華、蘇莉花。本標準負責人龔建英，負責標準申報、合同編寫、實施方案制定、組織資料收集、試驗驗證及標準的起草與修訂工作；王華新、龍定建、唐慶、潘文負責標準的修改、征求意見與審定工作；汪小玉、陳寶玲、吳玉華負責雜交授粉和無菌播種實驗；蒙芳、桂雪萍和唐遒冥負責雜交子代優(yōu)良單株測定、數(shù)據(jù)收集、整理和分析；李華、劉華和蘇莉花負責雜交子代瓶苗移栽管護以及檔案管理等。5.3技術路線標準起草工作組按項目合同要求及時編寫了實施方案，并制定了項目技術路線（如下圖）：相關相關資料收集整理形成工作組討論稿實驗驗證自有科研成果總結討論研究形成征求意見稿形成標準送審稿征求產學研用專家意見根據(jù)專家意見和驗證結果，修改完善觀賞石斛等蘭花育種現(xiàn)狀調研綜合分析調查研究、整理總結形成標準報批稿專家審定修改完善5.4標準起草過程5.4.1標準編制準備標準項目下達后，標準起草工作組的主要起草人員認真學習了《中華人民共和國標準化法》、《標準化工作導則匯編》、《廣西壯族自治區(qū)地方標準管理規(guī)定》和標準制定有關文件資料，研究確定了標準編寫的原則、技術路線和實施方案，并有序地開展標準的編制工作。5.4.2資料收集和實驗驗證2018年1-12月，編制人員開展了花卉、林木等雜交育種標準資料收集，整理匯總我們完成或在研的廣西重點研發(fā)計劃項目“觀賞石斛新品種選育及花期調控技術研究”和廣西科技基地與人才專項“瀕危石斛屬植物種質資源庫建設及共享服務平臺建設”、廣西自然基金項目“石斛種間雜交親種性及雜種胚培養(yǎng)技術研究”以及廣西林業(yè)科技項目“廣西特色花卉品種選育關鍵技術研究與示范”等項目的論文、專利、成果登記等科研成果，同時參考了近年來石斛蘭等蘭花育種方面公開發(fā)表的科技論文，開展石斛蘭雜交種子無菌播種和組培實驗優(yōu)化和實驗論證。5.4.3工作組討論稿的形成2019年1-2月，編制工作小組廣泛收集和查閱國內有關石斛蘭育種的國家、行業(yè)和地方標準，匯總近年來我們對石斛蘭的研究成果及技術參數(shù)，以實驗數(shù)據(jù)、調查材料為依據(jù)，對數(shù)據(jù)資料進行分析整理，參考已有的石斛屬、蝴蝶蘭屬以及花卉、林木相關育種標準，初步確定了標準內容的基本構架，形成了工作組討論稿。5.4.4征求意見稿的形成2019年3-5月，標準編制工作小組召開工作會議，對草案稿的框架、條款和技術參數(shù)等進行討論。經過多次討論、修改，最終形成《觀賞石斛雜交育種技術規(guī)程》廣西地方標準的征求意見稿。5.4.5征求意見及處理2019年6-7月，向10家科研、教學、生產單位發(fā)函征求意見以及在廣西金質網(wǎng)公開征求意見。6關鍵技術指標依據(jù)和來源本標準的關鍵技術指標主要來源于廣西重點研發(fā)計劃項目“觀賞石斛新品種選育及花期調控技術研究”、廣西科技基地與人才專項“瀕危石斛屬植物種質資源庫建設及共享服務平臺建設”、廣西自然基金項目“石斛種間雜交親種性及雜種胚培養(yǎng)技術研究”、廣西林業(yè)科技項目“廣西特色花卉品種選育關鍵技術研究與示范”以及“廣西主要草本花卉種質創(chuàng)新利用與繁育技術研究”等項目的科研成果、發(fā)表論文、授權專利以及長期對觀賞石斛育種的經驗積累，參考已有的石斛蘭、蝴蝶蘭以及花卉、林木等相關育種標準，進一步開展培養(yǎng)基配方優(yōu)化實驗，獲得相關實驗數(shù)據(jù)和技術指標。7關鍵技術指標內容及說明本標準的主要技術內容包括范圍、規(guī)范性引用文件、術語和定義、雜交育種目標、親本選配與栽培、雜交技術、F1代無菌苗培育、F1代測定、優(yōu)良單株選擇、優(yōu)良單株擴繁、優(yōu)良單株利用、譜系檔案管理等共12章，以及資料性附錄A、資料性附錄B、資料性附錄C。第1章范圍：規(guī)定技術規(guī)程的主要技術內容和適用范圍。第2章規(guī)范性引用文件：農業(yè)行業(yè)標準1個，即LY/T2758植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南石斛屬；地方標準2個，即DB45/T1783石斛蘭組培快繁技術規(guī)程和DB45/T1781觀賞植物品種審定技術規(guī)程。第3章術語和定義：提出了本標準所涉及并需要說明的3個術語，即唇瓣、合蕊柱、柱頭窩并對其含義進行了規(guī)定。第4章育種目標：株形緊湊美觀，花色艷麗、花期長、花量大，具有芳香，易栽培，抗逆性強。第5章親本選配：規(guī)定了親本選擇、組合配制、親本栽培。第6章雜交技術：規(guī)定了工具準備、母本花朵、父本花朵、花粉采集、花粉保存、授粉方法、授粉花朵數(shù)、標記、授粉后管理、蒴果采收與保存。（1）父本花粉：采集金釵石斛花朵不同開放天數(shù)的花粉（0d，2d，4d，8d，12d），采用培養(yǎng)液法，測定花粉生活力，研究不同開放天數(shù)金釵石斛花粉生活力大小。結果表明，金釵石斛開朵放（0d，2d，4d，8d，12d），其花粉生活力分別為35.8%，90%，85.6%，52.8%,35.5%，根據(jù)花粉生活力動態(tài)變化曲線圖看出，從開花第1d至第5d，花粉生活力均較高。因此，確定觀賞石斛父本花粉最佳授粉時間為1~5d。參考聚石斛花粉生活力及貯藏的研究。（2）母本柱頭：以金釵石斛花朵不同開放天數(shù)的柱頭為對象（0d，2d，4d，8d，12d），與具有較高親和性的廣東石斛進行雜交授粉，記錄種間雜交結實率，研究不同開放天數(shù)金釵石斛柱頭可授性。結果表明，金釵石斛開放（0d，2d，4d，8d，12d），其雜交結實率分別為40.0%，80%，60.0%，50.0%,35.5%，根據(jù)雜交結實率動態(tài)變化曲線圖看出，從開花第1d至第3d時，母本柱頭均具有較高可授性。因此，確定觀賞石斛母本柱頭最佳授粉時間為1~3d。參考聚石斛花粉生活力及貯藏的研究。參考聚石斛花粉活力及貯藏的研究。（3）花粉保存：收集鐵皮石斛當天開花的新鮮花粉，放在干燥器中，置于4℃溫度下貯藏，設置時間梯度（0d，4，8d，12d，16d，20d），每隔4d對待測花粉進行花粉活力測定研究不同貯藏天數(shù)花粉生活力大小。結果表明，不同花粉貯藏天數(shù)（0d，4d，8d，12d，16d，20d），鐵皮石斛花粉生活力分別為70.6%、60.2%、48.7%、35.1%、27.4%、21.2%。根據(jù)花粉生活力動態(tài)變化曲線圖看出，花粉貯藏第1d至第7d，花粉生活力較高，至隨著貯藏時間的延長，花粉活力降低.因此，確定觀賞石斛花粉的貯藏時間為1~7d。參考鐵皮石斛花粉活力與種質創(chuàng)制研究。（4）蒴果采收時間：采集不同種類石斛（潑墨石斛、青蘋果石斛，大苞鞘石斛、腫節(jié)石斛、報春石斛），在雜交授粉后的（90d,120d,150d，180d,210d,240d,270d，360d）采摘蒴果進行無菌播種，45天后統(tǒng)計萌發(fā)率，研究不同采收時間對觀賞石斛萌發(fā)率的影響。結果表明，對于秋石斛種類，需120~150d采摘蒴果進行無菌播種，萌發(fā)率達90%以上,且蒴果未開裂，有利于滅菌；而春斛種類，則需180~240d,無菌播種萌發(fā)率達95%以上，且蒴果未開裂，有利于滅菌。因此，篩選出觀賞石斛蒴果最佳蒴果采收時間120~240d。第7章F1代無菌苗培養(yǎng)：規(guī)定了石斛蘭蒴果滅菌、無菌播種、無菌播種培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、壯苗生根培養(yǎng)基以及F1代無菌苗繁育數(shù)量。（1）無菌播種培養(yǎng)基篩選：設置不同質量濃度6-BA（0.05，0.1，0.3，0.5，1.0）mg/L，NAA（0.05，0.1，0.2，0.3）mg/L，共同添加MS+白糖30g/L+瓊脂4.7g/L+活性炭0.5g/L+蛋白胨1g/L，pH5.4～5.6，共20個培養(yǎng)基配方，研究不同激素組合對觀賞石斛雜交蒴果無菌播種萌發(fā)、分化及壯苗生根的影響。根據(jù)萌發(fā)率、分化率、苗高、莖粗、根長、根數(shù)，根粗，葉數(shù)、葉色，植株長勢等指標，篩選最佳萌發(fā)培基為：MS+白糖30g/L+瓊脂4.7g/L+活性炭0.5g/L+蛋白胨1g/L+6-BA0.05mg/L～0.5mg/L+NAA0.05mg/L～0.2mg/L+椰汁100ml/L，pH5.4～5.6，萌發(fā)率達100%；最佳分化培養(yǎng)基為：MS+白糖30?g/L+瓊脂4.7g/L+活性炭0.5?g/L+蛋白胨1?g/L+6-BA0.2mg/L～0.5mg/L+NAA0.05mg/L～0.2mg/L馬鈴薯100?g/L，pH5.4～5.6，分化率為100%；最佳壯苗生根為：MS+白糖30?g/L+瓊脂4.7g/L+活性炭0.5?g/L+蛋白胨1?g/L+NAA0.2mg/L～0.5mg/L+6-BA0.05mg/L～0.2mg/L+馬鈴薯100?g/L，pH5.4～5.6。第8章F1代性狀觀測及組合篩選：對雜交F1代性狀進行觀測，參照LY/T2758執(zhí)行。組合篩選主要評價指標參照資料性附錄C，采用層次分析法進行綜合評價。第9章優(yōu)良單株選擇：規(guī)定了入選數(shù)量、指標測定和優(yōu)良單株選擇。測定指標參照LY/T2758執(zhí)行。優(yōu)良單株選擇評價指標參照資料性附錄C，采用層次分析法進行綜合評價。第10章優(yōu)良單株擴繁：規(guī)定了觀賞石斛優(yōu)良單株誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和生根培根壯苗培養(yǎng)。參照DB45/T1783執(zhí)行。第11章優(yōu)良單株利用：規(guī)定了植物新品種申報、品種審定和品種登錄。植物新品種申報按照LY/T2758要求進行植物新品種申報；品種審定按照按照DB45/T1781要求進行品種審定；品種登錄按照英國皇家園藝學會蘭科植物新品種登錄要求進行。第12章譜系管理：規(guī)定了觀賞石斛雜交育種技術檔案。附錄A觀賞石斛雜交授粉格式：資料性附錄，列出父本、母本、花朵編號、授粉地點、授粉人員、授粉時間。附錄B培養(yǎng)基配方：資料性附錄，列出觀賞石斛無菌播種培養(yǎng)基、分