生物基因工程的基本操作程序課件-2024-2025學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

基因工程的基本操作程序第一課時(shí)第2節(jié)人教版選擇性必修31.能闡明目的基因篩選與獲取的方法。2.能闡述基因表達(dá)載體構(gòu)建的流程。

2025/4/20

1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)的機(jī)制是什么嗎？轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉非轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：提取棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)蘇云金芽孢桿菌抗蟲(chóng)基因與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用。載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。前提核心關(guān)鍵保證

目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因。目的基因“殺蟲(chóng)基因”:Bt抗蟲(chóng)蛋白基因目的基因的篩選和獲取

根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。知識(shí)回顧

請(qǐng)從DNA水平上給基因下一個(gè)定義，要求既能反映基因與DNA的關(guān)系，又能體現(xiàn)基因的作用?；蛲ǔＪ怯羞z傳效應(yīng)的DNA片段但一段DNA片段不一定是基因--ATGCATGCATCGATGCTAGCGATCGCTAAGCACAG-----TACGTACGTAGCTACGATCGCTAGCGATTCGTGTC---基因1基因2非基因片段非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子編碼區(qū)原核生物基因終止子補(bǔ)充知識(shí)：基因結(jié)構(gòu)：非編碼區(qū)

組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游

功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)

啟動(dòng)子：RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始的信號(hào)

終止子：終止RNA的合成編碼蛋白質(zhì)的合成加工轉(zhuǎn)錄mRNA前體成熟mRNA真核細(xì)胞的基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345啟動(dòng)子終止子補(bǔ)充知識(shí)：基因結(jié)構(gòu)：

目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因、人干擾素基因等。篩選Bt基因作為轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的目的基因的原因是什么？用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲(chóng)劑，廣泛用于防治棉花蟲(chóng)害已有多年歷史蘇云金桿菌的殺蟲(chóng)作用與Bt基因有關(guān)掌握了Bt基因的序列信息對(duì)Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物--對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白有了較為深入的了解Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉較為合適的目的基因獲取目的基因的常用方法有哪些?從基因文庫(kù)中尋找聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增化學(xué)合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知初始目的基因的來(lái)源1.從生物中直接獲取2.人工合成注意：要保持基因的完整性1.篩選合適的目的基因2025/4/202.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）PCR：是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。原理：DNA半保留復(fù)制。操作環(huán)境：體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）。目的：對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制。優(yōu)點(diǎn)：可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。PCR擴(kuò)增儀（2）DNA體內(nèi)復(fù)制的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開(kāi)DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸2025/4/20一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。(RNA單鏈)（3）DNA體外復(fù)制（PCR）的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用90℃以上高溫DNA母鏈*4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶引物緩沖液（含Mg2+)提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開(kāi)DNA雙鏈（變性）催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸2025/4/20(DNA單鏈)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶（4）PCR過(guò)程：2025/4/20擴(kuò)增的過(guò)程①變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈；②復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合；③延伸：當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。如此重復(fù)循環(huán)多次，由于延伸后得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。TaqDNA聚合酶的應(yīng)用

高溫解決了打開(kāi)雙鏈的問(wèn)題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化。PCR過(guò)程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長(zhǎng)度通常為20－30個(gè)脫氧核苷酸。PCR和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的不同點(diǎn)？緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)？DNA模板，四種脫氧核苷酸，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，Taq酶。關(guān)于PCR的幾點(diǎn)說(shuō)明：2025/4/203.獲取目的基因的其他方法（1）構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。①基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因。提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)②部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)。提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA反（逆）

轉(zhuǎn)錄酶單鏈互補(bǔ)DNADNA聚合酶雙鏈DNA片段與載體連接基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存cDNA文庫(kù)真核細(xì)胞的cDNA的獲取編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動(dòng)子終止子基因不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子2025/4/20基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較

文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)

基因組文庫(kù)

文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子（具有啟動(dòng)作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）

基因多少

物種間的基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以2025/4/202025/4/20（2）利用化學(xué)方法人工合成①需要儀器：DNA合成儀。②適用目的基因類型：要獲取的基因比較小，核苷酸序列又已知；③不需要模板。1.操作目的：讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)成啟動(dòng)子目的基因限制酶切割位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因終止子（若需要能完成自主復(fù)制，還應(yīng)有復(fù)制原點(diǎn)）目的基因啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因基因表達(dá)載體的構(gòu)建（1）啟動(dòng)子思考:表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？

生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能有利于基因的表達(dá)；通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無(wú)法轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。操縱基因結(jié)構(gòu)基因

啟動(dòng)子RNA聚合酶（1）啟動(dòng)子①本質(zhì):一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段②位置:位于基因的上游（首端），緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)。③特殊類型：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。④誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的特點(diǎn)：當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)

。（2）終止子①本質(zhì):一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。②位置:位于基因的下游。③功能：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)。（3）標(biāo)記基因①作用：是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的重組DNA分子細(xì)胞篩選出來(lái)。②常見(jiàn)類型:抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)位置功能補(bǔ)充：?jiǎn)?dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰的堿基mRNA上三個(gè)相鄰的堿基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)翻譯的起始信號(hào)（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號(hào)（不編碼氨基酸）質(zhì)粒啟動(dòng)子限制酶切割位點(diǎn)終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)限制酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)限制酶獲取目的基因連接酶重組DNA分子

載體（質(zhì)粒）含有目的基因的DNA片段同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割帶有黏性末端（或平末端）的切口帶有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程2025/4/20

將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡(jiǎn)便嗎？如果這么做，效果會(huì)怎樣？

有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個(gè)生物的總DNA提取出來(lái)，通過(guò)注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒(méi)有進(jìn)