T-CSTM 00999-2023 玉米褪綠斑駁病毒 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 透射電子顯微鏡法

Maizechloroticmottlevirus--Morphologicalidentificationmetho2023-12-15發(fā)布2024-20001.4《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)材料與試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)科學(xué)2病毒之一復(fù)合侵染引起的玉米致死壞死病（cornletha番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）、玉米褪綠斑駁病毒屬（Machlomovirus附錄A）。應(yīng)用透射電米褪綠斑駁病毒形態(tài)學(xué)檢測(cè)診斷工作，特制定該病毒透射電子顯微鏡形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)。玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學(xué)檢測(cè)透射電子顯微鏡法可能的安全問(wèn)題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧┫铝形募械膬?nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適GB/T31810玉米褪綠斑駁病毒檢疫JY/T0581透射電子顯微鏡分析方一種嚴(yán)重侵害玉米等作物的檢疫性植物病毒4利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定量顯示抗原的技術(shù)方法，分超薄切片術(shù)ultrathinsectio采用超薄切片機(jī)把經(jīng)過(guò)包埋后的樣品切成厚度為50nm~100nm5儀器設(shè)備、試劑和材料、實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)及環(huán)境條件5）；）；）；）；5.3.1實(shí)驗(yàn)室安全資質(zhì)：植物病毒對(duì)于哺乳動(dòng)物和人不具感染性，本文件規(guī)定的實(shí)驗(yàn)操作可以在普通5.3.2環(huán)境條件：超薄切片機(jī)、透射電鏡應(yīng)安裝在獨(dú)立的房間內(nèi)，工作環(huán)境應(yīng)符b)透射電鏡：相對(duì)濕度小于60%，溫度（20±5）℃,電源電壓（220±22）V，電源頻率（50±1）66.2.2進(jìn)出境植物檢疫的取樣按SN/T21待檢種子樣品可保存于室溫或4℃冰箱內(nèi)；用于超薄切片的葉片樣品應(yīng)保濕存放于4℃冰箱內(nèi)，其它病株樣品可在-20℃以下冰箱凍存。種子樣品在室6.4.1組織粗汁液樣品：將玉米葉片組織加等體積0.05mol/L磷），也可以在適當(dāng)溫度和光照條件下使其發(fā)芽后再制備獲取組織6.4.2提純病毒樣品：將分離提純的MCMV樣品用雙蒸6.4.3超薄切片樣品：選擇有明顯褪綠斑駁癥狀的玉米葉片，用雙面刀片切取病葉的褪綠斑駁邊緣部色，染色時(shí)間1min~2min，用濾紙片從銅網(wǎng)邊緣吸掉多余染色液，干燥后待檢。漂浮法：在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪封口膜，用移液器吸一滴病毒樣品液體滴在封口膜上，將銅網(wǎng)膜面朝下倒扣在病毒懸液滴上靜置1min~2min，然后夾起銅網(wǎng)，用濾紙片從網(wǎng)倒扣在2%磷鎢酸負(fù)染色液滴（pH6.8）上進(jìn)行負(fù)染色，染用濾紙片吸掉抗體余液后，將銅網(wǎng)膜面朝下放置于病毒樣品懸液滴上，在培養(yǎng)皿中保濕反應(yīng)30min（如種子的病毒含量低，反應(yīng)時(shí)間可延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)或7用濾紙片吸除余液后，用2%磷鎢酸戊二醛固定液中前固定2h（4℃)。戊二醛固定液配制參見附錄B。漂洗：用0.1mol/L磷酸緩沖液充分漂洗三次，每次10min~15min。后固定：經(jīng)過(guò)漂洗后的樣品置于0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7min，然后用100％丙酮脫水2次，每次30min。浸透與包埋：樣品脫水后在丙酮：包埋劑（1：1）浸透1h1：3）浸透3h，然后在純包埋劑中浸透過(guò)夜，用膠囊或包埋管進(jìn)行樣品包埋。推薦采用Spurr低粘度包埋劑，其配制修塊和定位：聚合后的包埋塊修成易于超薄切片的形狀，然后在超薄切片機(jī)上用玻璃刀進(jìn)行超薄切片：修塊和定位后的包埋塊在超薄切片機(jī)上用玻璃刀或鉆石刀切成超薄切片，切片厚染色：采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛在室溫下對(duì)超薄切片進(jìn)行雙重染色，醋酸雙氧鈾染色時(shí)間7.2.1按照透射電鏡操作程序開機(jī)，抽真空至正常工作狀態(tài)，精確合軸，消除聚光鏡和物鏡像散，使7.2.3推薦加速電壓范圍：60kV7.2.4推薦放大倍率范圍：4,000×~50,000×。度較大斑塊，觀察樣品全貌。逐步提高放大倍率，仔細(xì)尋找直徑30nm的球狀病毒粒子，由于田間樣品nm線狀病毒粒子。種子樣品中的病毒含量通常較低，電鏡視野下可觀察到的病毒粒子較少。病毒粒子圖像精細(xì)聚焦后用CMOS或CCD相機(jī)記錄并儲(chǔ)存。MCMV病毒粒子的典型形態(tài)見附錄8現(xiàn)病變的細(xì)胞。逐步提高放大倍率，仔細(xì)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的異常變化。在MCMV侵染的病變細(xì)胞中可以觀察到大量直徑30nm典型的球狀病毒粒子分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，局部還有結(jié)晶狀排列的病毒構(gòu)中積累了大量纖維狀物質(zhì)，后期線粒體崩解，纖維狀物質(zhì)釋放到細(xì)胞質(zhì)。MCMV感染的細(xì)胞圖像精確聚焦后用CMOS或CCD相機(jī)記錄并儲(chǔ)存。感染MCMV的病變細(xì)胞特征和健康對(duì)照?qǐng)D片見附錄C。產(chǎn)生周邊復(fù)制小泡，根據(jù)這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征就可判MCMV檢測(cè)過(guò)程中使用過(guò)的樣品材料，在檢測(cè)完畢后需要進(jìn)行消毒和無(wú)害化處理。送檢種子樣品保存在4℃冰箱內(nèi)，病葉樣品保存在-20℃以下冰箱或凍干保存三個(gè)月備查，保存期滿后及時(shí)進(jìn)行滅活9檢測(cè)報(bào)告j)檢測(cè)報(bào)告的頁(yè)碼；）：）：）：種（Species）：玉米褪綠斑駁病毒（Maizechloro玉米褪綠斑駁病毒的自然寄主為玉米，還可侵染小麥、病毒引起褪綠斑駁、壞死、矮化、穗發(fā)育差或無(wú)穗、過(guò)早死亡等癥狀。常與甘蔗花葉病毒等馬鈴病毒易通過(guò)機(jī)械接種傳播，也可以經(jīng)種子、介體葉甲、薊馬傳毒，在田間擴(kuò)散容易。分布于阿根廷、墨西哥、秘魯、美國(guó)，在東非和東南亞地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，200MCMV具有中等到強(qiáng)的免疫原性，在凝膠擴(kuò)散中形成單條沉淀線，與其他一些禾谷類植物病毒無(wú)病毒粒子為等軸對(duì)稱二十面體（T=3直徑為30pH6穩(wěn)定，可由二價(jià)陽(yáng)離子穩(wěn)定。單分子正義單鏈RNA，長(zhǎng)度為4437nt。RNA的3'端無(wú)Poly（A5'端可能是未加帽的。病毒基因3超讀產(chǎn)物的功能尚不清楚，ORF2編碼蛋白及其超讀產(chǎn)物可能是病毒的大量病毒粒子分布在細(xì)胞質(zhì)中；過(guò)氧化物酶體增生并聚集，形成周邊復(fù)制A液：0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液NaH2PO4.H2OB液：0.2mol/L磷酸氫二鈉水Na2HPO4.2H2O35.61g（或Na2HPO4.12H2O不同pH值磷酸緩沖液貯存液配制見表B.1，pH值468將裝有四氧化鋨晶體的安瓿（0.5g）清洗干凈，用玻璃劃割器在上面刻痕，再用雙次，放入潔凈棕色廣口瓶?jī)?nèi)，加上25mL雙蒸餾水，用潔凈玻璃棒搗破安瓿，快B.2.2.20.1mol/L磷酸緩沖液配制的四氧化鋨固B.3.1Spurr低黏度包埋劑配制見表B.3。NSA8888327B.3.2按表B.3比例將前三種成份混合均勻，再加DMAE催化劑攪拌。配好的包埋劑在低溫和防潮狀稱取1g磷鎢酸，用50mL雙蒸餾水配制成2%的水溶液，用1mol/L低鹽的病毒提純?cè)嚇右部捎蔑柡痛姿犭p氧鈾水溶液進(jìn)行負(fù)染色，具有更高的圖像分辨率。飽和醋酸雙氧鈾負(fù)染色液用雙蒸餾水配制，pH值4.2，室溫下避光保B.4.3.1醋酸雙氧鈾染色液：用50%乙醇配制成1%~3%的飽和溶液B.4.3.2檸檬酸鉛染色液：稱取硝酸鉛1.33g、檸檬酸三鈉1.76g，放入50mL容量瓶中，加預(yù)先煮沸過(guò)AACBBDBDACBDACBABA本文件起草單位：浙江大學(xué)，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，拱北海關(guān)技術(shù)中心，上海海關(guān)動(dòng)植物與食本文件主要起草人：洪健，謝禮，王華，李云琴，尚衛(wèi)娜，吳建祥、張仲凱、張衛(wèi)東、于InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses(2020).ArchivesofVirology,2020,165:2737-2748.[3]LiXie,JingzeZhang,QiangWang,ChunmeiMeng,JianHong,XuepingZhou.CharacterizationofMaizechloroticmottlevirusAssociatedwithMaizeLethalNecrosisDiseaseinChina.Phytopathol.2011,159:191-193.[4]QiangWang,ChunyanWang,ZhengheLi,JianHong,